EMS诱变国麦301突变体库的构建
诱变剂的作用机理
3．1甲基磺酸乙酯( EMS) EMS分子式CH3SO2OC2H5,中文名为甲基磺酸乙酯,无色液体,分子量124,水中溶解度为8%。pH7条件下在水中半衰期20℃时是93 h, 30℃时26 h。EMS是烷化剂的一种。烷化剂通常带有1个或多个活性烷基,此基团能够转移到其它电子密度高的分子上去,使碱基许多位置上增加了烷基,从而在多方面改变氢键的能力。EMS被证明是最为有效而且负面影响小的诱变剂。与其他烷化诱变剂类似,是通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变。EMS诱发的突变主要通过两个步骤来完成,首先鸟嘌呤的O6位置被烷基化,成为一个带正电荷的季铵基团,从而发生两种遗传效应:一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对,代替胞嘧啶,发生转换型的突变;二是由于鸟嘌呤的N27烷基活化,糖苷键断裂造成脱嘌而后在DNA复制过程中,烷基化鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对,导致碱基替换,即G∶C变为A∶T。当然,化学诱变存在着染色体结构和数量方面的诱导变异,但这种单一碱基对改变而形成的点突变仍是化学诱变的主要形式。这样的点突变将是品种改良和退化特性恢复的希望所在。诱变剂也可与核苷结构的磷酸反应,形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断,产生染色体的缺失。这些DNA结构上的变化都可能促使不表达的基因或区段被激活,而表现出被掩盖的性状。EMS化学诱变产生点突变的频率较高,而染色体畸变相对较少,可以对作物的某一种特殊性状进行改良。与其它诱变剂相比,EMS诱变后产生的突变频率高,且多为显性突变体,易于突变体的筛选。EMS是目前运用最广泛也是公认最为有效的诱变剂。 3.2叠氮化钠( NaN3) NaN3等电点是pH=4. 18,在pH=3时NaN3溶液中主要产生呈中性的分子HN3,易透过膜进入细胞内,以碱基替换方式影响DNA的正常合成,从而导致点突变的产生。由于NaN3只作用于复制中的DNA,所以处理种子时把种子预浸到种胚中,有利于提高处理效果。NaN3具有高效、无毒、便宜及使用安全等优点。在酸性溶液中对大麦叶绿素缺失和形态突变诱发非常有效。 3.3平阳霉素(PYM) PYM是一种抗生素,属于博莱霉素的一类,是博莱霉素的A5组分。目前主要作为抗肿瘤药应用于临床,对多种癌症具有较好的疗效。抗生素具有高度选择性,能抑制细胞的生长,其中的大多数对维持生命有重要意义。作为一种新的诱变剂, PYM在许多实验中均被证明具有安全、高效、诱变频率高、范围大等特点。与EMS的诱变特点相近,在某些方面优于EMS,很具有开发和应用前景。
线虫的EMS诱变和突变体筛选2015
线虫的EMS诱变和突变体筛选 摘要：秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一种被广泛研究的模式生物，其性状容易辨别，突变型多且容易获得。本实验用EMS诱变剂对同步化后的N2型怀卵成虫线虫进行不定向诱变，筛选出一系列的突变体，再通过对亲代突变体的子代进行进一步的筛选，筛选出F1、F2、F3突变体，最后获得性状稳定的、能够稳定遗传的突变体，可以将突变体至于-80℃保存。本次试验涉及到的生物技术有：无菌操作技术，同步化技术，EMS诱变技术，显微操作技术等。将获得的突变体与野生型作对比，可以在显微镜下观察到性状明显的突变体，将突变体转移、传代、保留，最后获得稳定的突变体。 关键词：秀丽隐杆线虫同步化EMS诱变无菌操作技术突变体 1.引言 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一种以细菌为食，居住在土壤中，无毒无害、可以独立生存的线虫。它有如下几个特点：①其个体小，成体仅1mm长，雌雄同体全身共有959个细胞，雄性线虫全身共有1031个体细胞；②为雌雄同体：雄性个体仅占群体的0.2%，可自体受精或双性生殖；③染色体组简单：只有5对常染色体和1对性染色体；④基因组便于研究：基因组大小仅为100Mb，并且内含子少，基因密度高；⑤生活周期短且随温度变化：线虫整个的生命周期仅3天（25℃）。野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度的程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析。温度越高，生活周期越短；⑥有大量突变株；⑦繁殖能力强：成虫一生可产300个受精卵；⑧易于保存：可以用-80℃冰箱长期保存 线虫作为模式生物，与酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠和拟南芥等一起，为生命科学的发展做出了极大的贡献。它与其他模式生物相比，有自身优势，如：①它只有消化系统和呼吸系统，并且肉眼可见，容易研究；②它是目前最适合大规模药物筛选的多细胞动物，③它的研究成本低：既提供了一个完整动物实验系统，又避免了小鼠模型的高价费时等。但也有其缺点，如：①线虫的神经元细胞对RNAi不敏感；②线虫没有心脏、获得性免疫系统、呼吸系统等，所以一些人类疾病无法在线虫中模拟；③鉴于线虫与人类种间距离太远，线虫的作用仍是在药物研发初期，快速粗筛，提供线索，需要再经过哺乳动物模型的“细筛”。 基于线虫的自身体积小并且结构简单的优势，国内外众多的科研机构都在以线虫作为研究材料，在RNAi、衰老、药物筛选、功能基因组学等领域进行研究。研究发现，线虫中大约有35%的基因是在人体中具有等同作用，并且有大量人类遗传疾病同源基因，只有大约58%是线虫特有的，所以，从理论上讲, 只要人类疾病的靶蛋白或调控途径是物种间保守的, 就可能利用模式生物来进行研究。 目前，已经有许多成功的线虫病理模型，如：溶酶体病，阿尔茨海默症(Alzheimer’s, AD)，多囊肾病(polycystic kidney disease)，Duchenne 肌营养不良症，过氧化物体生物合成缺陷等。 甲基磺酸乙酯，简称EMS，是一种重要的致癌物之一，生物学上可以用来创建突变体库。本实验就是将EMS作为诱变剂来获得线虫的突变体。线虫有单基因突变形成的表型，例如：运动不协调（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成这些表型的基因有很多个，分别分布于各条染色体上。这些易于观察的表型作为遗传标记，给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利。此外，线虫还有许多组织特异性标记的品系，如在线虫中负责协调前后运动的D型运动神经元。我们通过对排卵时期的线虫进行诱变，观察诱变后线虫突变体表形，对突变体后代进行筛选，探究影响突变型基因的显隐性，
EMS诱变技术及其在创造玉米新种质中的应用
农作物化学诱变育种是人为地利用化学诱变剂，诱发作物发生突变，再通过多世代对突变体进行选择和鉴定，直接或间接地培育成生产上能利用的作物新品种。化学诱变具有成本低廉、使用方便、诱变作用专一等特点，是一种迅速发展的农作物育种手段。目前，在众多的化学诱变剂中，甲基磺酸乙酯（EMS ）被认为是应用最好的诱变剂[1～6] 。EM S 诱变技 术在国内外已成为一种成熟的技术，在玉米诱变育 种中得到广泛的应用。 1ＥＭＳ诱变技术 EMS ,即甲基磺酸乙酯，是一种烷化剂，烷化剂EM S 所诱发的突变主要通过以下步骤来完成。烷基化位点主要在G （鸟嘌呤）的N-7位上[6]，由于G 上N-7的烷基化，使之成为带一个正电荷的季铵基团。这个季铵基团产生两个效应：一是促进第一位氨基上氢解离，使G 不再与C 配对而与T 配对，从而造成G:C-A:T 转换（图1）。 二是N-7成为季铵基团后，减弱了N-9位上的N-糖苷键，而产生了去嘌呤作用。大部分的无嘌呤 位点都可以被无嘌呤内切酶系统所修复，但是有时复制在修复之前进行，则在无碱基位置上可以通过插入任何一个碱基，在第二轮复制以后，则原来的G ∶C 对可以变为任何碱基对G ∶C 、C ∶G 、A ∶T 、T ∶A ，既有转换,又有颠换（图2）。此外，它也可与核苷结构的磷酸反应，形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断，产生染色体的缺失[6]（图3）。 EMS 诱变技术及其在创造玉米新种质中的应用 安伟，樊智翔，马海林，米小红，王计虎 （山西农业科学院玉米研究所，山西忻州034000） 摘要：综述了EMS 的作用机制、作用特点及EMS 在创造玉米新种质中的应用等方面的内容，并对EM S 在玉米遗传育种研究中的 利用前景进行了论述。 关键词：EM S ；诱变技术；玉米；新种质中图分类号：S513.032 文献标识码：A 文章编号：1002-2481(2008)12-0037-03 Induced Mutation Technique and Application of EMS to Create New Corn Germplasm AN Wei ，FAN Zhi-xiang ，MA Hai-lin ，MI Xiao-hong ，WANG Ji-hu (Maize Research Institute ，Shanxi Academy of Agricultural Sciences ，Xinzhou Shanxi ，034000，China) Abstract:The mechanism 、property and application of EMS for creation of new corn germplasm etc.was reviewed in the paper.The prospect of EMS utilization in research of corn genetic and breeding was also pointed out. Key words: EMS ；Induced Mutation Technique ；Corn ；New germplasm *收稿日期：2008-11-13 作者简介：安伟（1975-），男，山西代县人，助研，主要从事玉米遗传育种工作。 Journal of Shanxi Agricultural Sciences 山西农业科学2008，36（12）：37～39图1N-7烷基化鸟嘌呤由于N-1位上H 的电 离而与胸腺嘧啶配对,从而导致G:C-A:T 转换 图2N-7烷基化鸟嘌呤通过去嘌呤作用导致转换和颠换 37
EMS诱变
EMS?诱变？ 常用浓度0.05-0.5mol/L，作用时间5-60min。 小心点，那东西剧毒且致癌。 人工化学诱变技术: 化学诱变技术是指利用一些化学物质提高生物的自然突变率，这些化学物质就叫做“化学诱变剂”。其特点有：可操作性强，简单易行；特异性较强，能诱变定位到DNA上的某些碱基；后代较易稳定遗传，一般到F3代就可稳定；应用于遗传标记，是细胞融合技术的基础。 诱变剂主要包括5类，他们的特点、机理和应用如下： 1、烷化剂：能使一些碱基烷基化，比如使鸟苷酸甲基化，影响mRNA的转录，从而使蛋白质的表达紊乱，使得蛋白质重组，而改变了性状。临床上应用此类物质作为抗癌药物，具有强烈杀伤癌细胞的作用，所以在应用在于植物上时，也要注意他的强烈杀伤性。 主要有：甲基磺酸乙酯（EMS），是最常用的诱变剂，我们曾用作真菌的遗传标记，诱变率很高。常用浓度0.05-0.5mol/L，作用时间5-60min。该物质具有强烈致癌性和挥发性，可用5%硫代硫酸钠作为终止剂和解毒剂。SIGMA公司价格：80元/25ml。 硫酸二乙酯（DMS），也很常用，但由于毒性太强，目前很少使用，作用机理和使用方法和EMS基本相同。属于剧毒品，受公安局管治。 乙烯亚胺，生产的较少，很难买到。只要用于大量诱变育种用，使用浓度： 0.0001-0.1%，高度致癌性！使用时需要使用缓冲液配置。 盐酸氮芥，用于抗癌药物，可以从药店买到，但有些地方必须有主任医师的处方。一般是针剂，稍加稀释即可使用，作用时间5-10min，可用甘氨酸作为终止剂和解毒剂。 环磷酰胺、亚硝基胍等物质也可作为诱变剂使用，但较少使用。 2、碱基类似物：分子结构类似碱基，导致DNA复制时产生错配，mRNA转录紊乱，功能蛋白重组，表型改变。该类物质毒性相对较小，但负诱变率很高，往往不易得到好的突变体。主要有：6-溴尿嘧啶、6-BudR、马来酰肼、2-氨基嘌呤等，同样属于抗癌药物，可到药店买到，稍加稀释即可使用。 3、嵌入剂：是分子生物学比较常用的一类，诱导率较高。原理是这类分子的大小正好可以嵌入碱基分子中，导致错配。最常用的：溴化乙锭（EB），高致癌性！价格较贵，但诱变率很高，是实验室常用试剂，可以到生化实际商店买到，1500元/100mg. 4、无机化合物：比较容易得到，效果一般，危险性较小。常用：氯化锂，白色粉状，使用时配成0.1-0.5%的溶液，作用30min-2d。可到化工商店买到：120元/500克。
诱变方法
EMS的诱变处理方法： ①EMS 母液的配制：为了安全和防上失效，配制前将需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配制。取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸缓冲液中，加盖，并轻轻转动试管。由于在水溶液中易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。 ②取新鲜的菌体，经前培养至对数期．离心洗涤，用缓冲液制成8 ml 菌悬液（107-108ml-1）。对于丝状菌孢子，则前培养至萌动期，悬液含106 ml-1。 ③取EMS母液2ml，加人到以8ml的菌悬液中。在适宜温度下处理一定时间（根据预实验绪果确定）。处理的最终浓度为0 .lmol／L。对于真菌孢子，则为0.2-0.5rnol／L。 ④EMS处理一定时间后，用50倍生理盐水稀释或加入一定量的2%NaS2O3溶液或多次离心、洗涤，以终止反应。 EMS是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用10％NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。 亚硝酸是一稀常用的诱变剂，毒性小．不稳定，易挥发．其钠盐易在酸性缓冲液中产生NO 和NO2 （一）亚硝酸的诱变机制 脱去碱基中的氨基变成酮基，引起转换而发生变异。A→H，C→U，G→X。A：T→G：C和G：C→A：T。亚硝酸的诱变也可以发坐回复突变。 亚硝酸除了脱氨基作用外，还可引起DNA交联作用，DNA复制，从而导致奕变。（二）亚硝酸的处理方法 1．试剂的配制 （1）1mol／L pH4.5醋酸缓冲液
（2）0.1mol／L亚硝酸钠溶液 （3）0.07mol／L pH8.6磷酸氢二钠溶液 以上试剂用前均要灭菌。 2．处理方法 取孢子悬液1 ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及硝酸钠溶液lml，最后处理浓度为0.025 mol／L ；25-26℃保温10-20min，加入的磷酸氢二钠溶液20 ml，使出下降至pH 6. 8左右，以终止反应。稀释分离于平板。 如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05 mol／L。 在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度，否则会影响诱变效果。 羟胺的简称HA，常以盐酸羟胺形式存在，为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性。 1.羟胺的诱变机制 当羟胺浓度为0.1-1.0mol／L pH6.0时，主要与胞嘧啶反应，使羟化的C与A配对，在0.1-1.0mol／L pH9.0，羟胺可以与鸟嘧啶反应，10-3 mol／L时，羟胺可以与胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶起反应。但据分析，羟胺与T、G反应的是它的产物，而不是它本身。此外，羟胺有时还能和细胞中其他物质作用产生过氧化氯，也具有诱变作用。 2．羟胺的处理方法 常用浓度为0.1％-5％，可直接在溶液中处理，时间1-2h，然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中。然后接入孢子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理．所用浓度比直接处理时低些。 六、金属盐类 用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等。其中氯化理比较常用，与其他诱变剂复合处理，效果相当显著。 氯化锂称之为助诱变剂，氯化锂是白色粉末，易溶于水，使用时通常加到培养基中。 为了速免受破坏．倒平板时，当培养基温度冷却到50-60℃时才加入制成平板，然后把细菌或孢子涂布分离，处理终浓度为0.3％-1.5%。实验思路：出发菌株（酶活较大菌株编号）—紫外诱变——选透明圈较大（与未诱变的菌株进行对照）的进行化学诱变——EMS 和DES诱变——选透明圈较大（与未诱变的菌株进行对照）的进行氯化锂诱变——最终获得突变菌株 注：每次均需要做对照，测酶活，目的菌株选择：透明圈直径：菌落直径（HC值）较大的菌株进行下一步的诱变。
水稻EMS诱变
水稻EMS诱变 1、EMS诱导水稻中花11突变体的筛选和鉴定,顾佳清，等.上海农业学报，2005，21(1)：7～ll。这篇文献所使用的方法主要是：（1）先用清水浸种16h，再用0.5%的EMS在28℃下处理4h，播种，收种子（M1）。 （2）将M1代种子用清水浸种16h，用0.5%的EMS在28℃下处理4h，再用0.7%的EMS处理4h，播种，收种子M2代。 （3）将M2代播种，筛选突变植株。 在这篇文献中，经两次诱变后，突变率达12.4%，有各种突变体产生，其中有叶片形状的突变。只是两次诱变所花时间长。 2、三种化学诱变剂对不同水稻品种的生物学效应研究，彭波，等.湖南人文科技学院学报，2007年8月，第4期。这篇文献主要使用的方法是： 用三种浓度（0.5%，1.0%，2.0%）的EMS，在26℃的培养箱中处理水稻种子12h，再用清水冲洗4h，播种。其中0.5%的发芽率最高，在80-90%之间，1.0%的发芽率在40%-50%之间，作者认为这种半致死量（1.0%）的浓度为诱导水稻突变的最佳浓度，我想对我们工作来说，我们是寻找表皮和气孔的突变体，所以用0.5%的比较适宜。 3、水稻“9311"突变体筛选和突变体库构建，叶俊，等. 作物学报，第32卷第10期，2006年10月 1525～1529页。这篇文献主要使用的方法是： 将9311种子浸种16 h，用0.4％ EMS处理8h。
4、Selection of stable mutants from cultured rice anthers treated with ethyl methane sulfonic acid.Joong Ho Lee & Seung Yeob Lee. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 71: 165–171, 2002。这篇文献主要使用的方法是： 用0.5%的EMS在25±2 ?C下处理，轻微摇晃6h。 所以，我们诱变可以选用0.5%的EMS，在25 ?C下处理6-8h为宜。
EMS诱变水稻突变体致变基因的鉴定0725
EMS突变体致变基因鉴定 在植物遗传学研究中，研究者除了采用传统的正向遗传学手段外，反向遗传学也得到广泛应用。采用各种物理或化学突变，导致遗传物质发生突变，进而根据突变性状来研究变异基因的生物学功能。在众多的致突变手段中，EMS突变技术由于导致的突变多为单碱基突变，且遵循C>T突变规律，在近代遗传学研究中得到广泛的应用。常规的对突变基因的鉴定多采用建立F2连锁群体，通过分子标记进行图位克隆，研究的周期长、工作量大且过程繁琐。随着高通量测序技术的快速发展，实现了在短期时间内获得植物的基因组信息，为研究突变体的突变基因的鉴定提供了一条新的研究途径。 根据对研究材料中突变基因的信息不同可以分为两种策略： 方案一：对于已经比较纯合的突变体植株，可以直接对野生型植物和突变体植株进行深度测序，通过对野生型和突变体中的变异信息的分析，直接对导致表型的致变位点进行鉴定。 方案二：对于没有初步定位突变位点信息的材料，可以对突变植株的自交F2后代中，选择具有突变表型的植株进行混合测序，突变位点在混合群体中应该处于高度纯合而极低的杂合度，因此通过对全基因组中位点进行扫描，从而定位到突变位点。该方法特别适合于大量突变体的鉴定，可以同时鉴定大量的株系，且群体建立方法简便，工作量低。
变位点，并定位突变基因，然后对可能的突变基因的表达进行检测。 方案二：如果没有定位信息，可以将多株具有突变表型的F2个体的DNA按等量混合，并进行低深度（30X）测序，即可减少工作量
又可降低测序成本。由于EMS诱变F2代中具有表型的多为隐性纯合突变，突变基因所在区间为纯合子，为了减少假阳性出现，结合分析该区间的杂合度综合分析，获得突变位点后在扩大样品群体中进一步验证，即可定位导致突变表型的位点和基因。 水稻、拟南芥、玉米等重要模式和粮食作物已经完成了基因组的完整测序，为基于高通量测序技术的突变基因的鉴定奠定了丰富的资源基础。该方案的实施将为加快作物突变体的鉴定具有重要的推动作用，并为作物功能基因组研究提供了一种高效、便捷的技术手段。该方案一中针对具有明显表型的突变体方案包括以下三个步骤：（1）测序样本的选择及测序深度的确定 选择连续多代自交的突变体植株，以及野生型植株个体，提取基因组DNA，按照标准的Illunima 建库流程，建立插入片段为350bp 的文库，根据不同作物基因组大小进行30X测序。 （2）基因组重测序数据的获得与生物信息学分析 通过对测序数据的质控之后，将获得的reads同野生型基因组序列进行，找出测序数据中的SNP、InDel，对全基因组的SNP纯合度进行分析，找出可能的突变位点，并进一步采用其他分析软件进行确认，从而锁定出突变表型相关位点及基因。 （3）突变位点的鉴定和扩大群体中验证 根据生物信息学获得突变位点信息，利用Sanger测序进一步在突变体中进行验证。
石蜡油-EMS花粉诱变技术
EMS(EthylMethaneSulfonate,甲基磺酸乙酯)是一种烷化剂,其诱变机理是通过与核苷酸中的嘌呤、嘧啶分子直接反应来诱发突变。EMS诱发的突变体主要通过两个步骤完成:首先鸟嘌呤的O6位置被烷基化,而后在DNA复制过程中,烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对,导致碱基交换,即G∶C变为A∶T,形成点突变。 早在60年代,人们就已开始采用EMS水溶液处理植物种子,但诱变效率很低。自Neuffer 等(1978)将EMS溶于石蜡油中处理玉米花粉获得成功后,石蜡油_EMS处理花粉诱变技术在国外广泛应用起来。Greaves等(1986)采用含0.667×10-3EMS的石蜡油处理玉米自交系的成熟花粉40min,在M2代施以除草剂的筛选环境,获得抗除草剂Pursuit突变体,该突变体含抗除草剂显性基因。1987年美国ICI种子公司用EMS处理花粉获得糯质、甜质玉米突变体。张铭堂(1989)采用该技术获得诱变率为0·2%的糯质基因。据报道,AllenWright等在M3后代中筛选出10个高赖氨酸突变材料。中国农业大学等单位开展了特用玉米突变体的筛选研究。石蜡油_EMS花粉诱变技术,由于诱变剂直接作用于配子,具有诱变率高,诱变范围广,且产生的突变体多为点突变的特点,较传统电离辐射优越。研究表明,石蜡油_EMS处理花粉,平均每个位点上单个基因的隐性和显性突变率可达千分之一和万分之一以上,可以在较大的诱变后代群体中筛选出目标突变体。该技术将是改良自交系和进行种质创新的有效工具。 诱变剂：EMS(甲基磺酸乙酯)，德国产。 载体剂：液体石蜡天津产。 诱变处理：参照Neuffer的花粉诱变方法，具体见参考文献31。 (4)诱变材料种植:为了处理方便和工作人员安全,该处理自交系(Mo)行距加宽到75cm,株距按常规种植; (5)Mo预处理:提前根除杂株;在诱变的前一天下午,雌穗剪苞叶,雄穗去掉老花药后分别套袋。 (6)处理液制备:参照Neuffer的方法。在通风橱内,按照1mLEMS:100mL液体石蜡的比例配制母液,在磁力搅拌器上搅拌1h混合均匀;在大田处理前,配成所需浓度。本试验采用了大多数人认同的浓度0.667×10-3和比它低的1×10-4以及比它高的1×10-3,1.5×10-3,2×10-3共5个浓度;C对照,为纯石蜡油处理。 (7)田间诱变处理:在适当的时间,收集新鲜花粉,过筛除去花药后,按照1体积花粉:10体积处理液的比例于棕色瓶里,在混匀器上间断的混匀,处理45min后,在田间用毛笔把相应的花粉授在相应的花丝上。 (8)后代处理:M0果穗成熟后收获,得到M1种子。M1种子全部按穗行单粒点播,苗期和成株期进行田间观察,并挂牌标记;将全部植株自交后得到M2代种子,并观察子粒突变。 M2代种子按穗行种植,每穗种3行,共60粒,每15行种植CK2行;抽雄时调查抽雄情况及株型和抗性等变异,并进行挂牌标记。将标有变异的植株自交得M3代种子; M3自交种子种成穗行,每5行加一个对照;此代中,观察、记录各穗行的抽雄期及其他性状,将不同穗行同对照比较,选择整齐一致并与CK有明显差异的穗行即为突变纯合体,将有利用价值的突变体自交留种。 (9)生育期突变选择标准:每穗行的抽雄高峰期与CK的抽雄高峰期相差6天以上。 诱变处理先将EMS配成1%母液,保存 备用。参照Neuffer的诱变方法进行诱变。上午9~10时,收集玉米新鲜花粉,去掉花药,加入处理液中,并用医用混匀器间断振荡45min后,再用毛笔把处理的花粉授在相应的花丝上;本试验采用0、0·50、0·67、1·00、1·50和2·00mL/L共6个处理浓度。0为CK,用纯液体石蜡油处理。 诱变后代的处理后代M1、M2采用系普法、单粒点播,各代标记并全部自交保种;将M3
EMS诱变油菜种子
EMS诱变油菜种子综述 背景 化学诱变育种是目前一种迅速发展的作物育种技术,具有使用方便,特异性较强和诱变后代较易稳定遗传等特点,已广泛地应用于油菜、玉米、大豆等农作物,并且取得了巨大的经济效益和社会效益。自然条件下植物发生基因突变的频率较低,而人工诱发基因突变则提高了突变率。诱变技术被广泛应用于作物育种,能使作物产生有益变异,从而获得与育种目标相符的性状。目前,抗性突变体主要有除草剂抗性突变体、盐及重金属离子抗性突变体、植物病毒抗性突变体以及逆境条件抗性突变体等一些类型[1]。 EMS(甲基磺酸乙酯) 是烈性致癌物质,对育种者而言,它又是很好的诱变剂，自从1953年，LLMARK首次报告了EMS对突变诱导的有效性以来，目前已被广泛应用于农作物诱变育种。EMS对小麦、大麦、水稻等作物的最适处理浓度，生理特性，生物学效应等方面的影响有较多报道，而对于油菜种子的最适处理浓度、生长、萌发的影响研究较少[2]。本试验想通过诱变得到抗除草剂的突变体。 1 材料与方法 1.1 试材及处理 供试材料：中双九号上述材料由重庆市油菜工程技术研究中心提供。 试验方法：种子粒选后，以蒸馏水预浸12 h(20℃左右)，然后用吸水纸吸去表面水分，浸入用0.1M磷酸缓冲液（Ph=7.0）稀释的0.8％、1.0％、1.2%的EMS诱变液中，处理时间8 h（对照用清水浸种），EMS溶液的体积设1粒/ml,10粒/ml两个水平，处理后用流水冲洗4 h。之后将处理好的不同品种的油菜种子整齐排列在铺有滤纸的培养皿中，每皿100粒，重复三次。置于人工气候培养箱内，25℃光照发芽。 1.2发芽指标测定 处理后三天测定发芽势，7天统计发芽率；油菜种子的发芽以幼根达种子直径长为标准。第七天计算发芽率的同时测量油菜的根长和苗高，均以每一处理的任意10株的平均值表示。 发芽指数=ΣGt/ D t ( Gt为t时间内的发芽数,D t为相应的发芽天数)