血清中病毒DNA提取方法

血清中病毒DNA提取方法。

一煮沸法

从血清中提取病毒DNA，与其它方法比较，此法最为简单，并且很多文献都有报道。

鲁艳芹等在一篇名为《乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法及专用试剂盒》专利(专利申请号为200610044679)中对六种方法提取血清中乙型肝炎病毒DNA的效率做了比较，得出结果是：NaOH裂解法最佳，其次是直接煮沸法，但该法不适合提取粘稠度较高的血样标本。说明直接煮沸法还是可以的。

另外，陈秀珍等人《采用不同方法提取血清及乳汁中HBV-DNA扩增结果分析》对抽提法、热处理、碱变性法提取乙肝标志物阳性出产妇血清及乳汁中HBV-DNA方法进行评价，发现血清标本HBV-DNA的提取，三种方法无明显差异。

陈秀珍等：取血清100ul，放入0.5ulEP管中，沸水中煮10分钟，10000r/m,离心5分钟，取上清备用。

专利：取血清100ul和100ulPBS，煮沸10分钟，12000rpm, 离心5分钟，取上清备用.

两篇文章所用的煮沸法大致一样,只是是否加PBS的差异。加PBS，这样使得血清在煮10分钟后，不会干掉，没有上清，另外，它不会干扰核酸的提取。加TE是否也可以呢？

二裂解液煮沸法

郭龙华等《3种方法从血清标本中提取I--IBV DNA 的比较》

比较3种从血清标本中提取HBV DNA方法的效果，选出一种快速、简单、高效提取血清中HBV DNA的方法——裂解液煮沸法，此法提取的HBV DNA模板含量最高，与碱裂解法和蛋白酶K-苯酚抽提法之间的差异显著(P

裂解液配制(10 mmol/L Tris—HC1，1 mmol/L EDTA，15 mmol/L 氯化钠，0．5％SDS，pH 8．0).

方法：取5Oul 血清加1Oul 裂解液，混匀,煮沸1O分钟，5 O00xg 离心5分钟，取上清液备用，平均每管大约可以取到2Oul上清液。裂解液煮沸法是一种快速、简便、高效的提取HBV DNA的方法。特别适用于大批量标本，该法同时可节约实验成本和时间，具有很大的应用价值。

三碱裂解法

在不同的文献中，虽然都称为碱裂解法，但是所用的量不同，导致的结果就不同。

郭龙华等《3种方法从血清标本中提取I--IBV DNA 的比较》，所用的碱裂解法：5Oul血清加45ulddH20加5ulmol/L氢氧

化钠，混匀，37℃2O分钟，加入5 u1mol/L 氯化氢，10 O00xg

离心5分钟，取上清液备用.NaOH的终浓度只有0.01M，所以去蛋白效果不好，明显影响了PCR效果。

而陈秀珍等人《采用不同方法提取血清及乳汁中HBV-DNA扩增结果分析》，所用的碱变性法：50ul样品加入0.5mlEp管中，再加50ul02mol／L NaOH，置37℃水浴1小时，再加50ul 0.2mol／L HC1

置93℃10分钟，10000rpm／min离心5分钟，上清液备用. 与抽提法和热处理法无显著性差异。此法NaOH的终浓度为0.1M。

另外，鲁艳芹等在《乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法及专用试剂盒》专利(专利申请号为200610044679)中使用的碱裂解法：100ul 血清加入100ul0.3mol/L 的NaOH ,80℃温育10分钟，12000rmp 室温离心5分钟，吸取上清加入50ul 0.4mol/L 的Tris-HCl PH7.5, 4℃保存。结果显示为阴性。

病毒DNA提取

小鼠血浆中HSV-1 DNA的提取 [目的] 掌握血浆中病毒DNA 提取的原理，熟悉其提取方法。 [原理] E.Z.N.A.?Viral DNA Kit 该试剂盒提供了从小于250ul血浆、血清、无细胞培养液等样品中快速简单地提取病毒DNA的方法，液体样品经Buffer BL和蛋白酶（OB）消化后，经乙醇调节结合条件，过柱吸附DNA，再经过两步快速洗涤后，最后用Elution Buffer (10mM Tris,pH8.5)溶解基因组DNA。纯化的DNA可直接用于PCR，Southern杂交，酶切等实验。 [试剂及仪器]旋涡混合振荡仪；微量DNA定量仪；台式离心机；65℃水浴锅。 1.5ml无菌EP管（2个/人）；EP抗凝管(含100ul抗凝剂)（K）；1000ul枪及枪头；。Hibind DNA 结合柱(1个/人)；2ml收集管（3个/人）；OB蛋白酶（OB）；Buffer B L（含线性丙烯酰胺）(BL)；乙醇(乙)；Buffer HB(HB)；DNA Wash Buffer（W）；Elution Buffer(EB)。 [实验步骤] 一、血浆样品的制备： 1.用微量加样器取100ul抗凝剂加入1.5mlEP管中。 2.右手抓起小鼠尾巴，用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用镊子迅速摘除 眼球，将流出的血液滴入含有抗凝剂的1.5ml EP管中，迅速混匀后，10000rpm，离心3min。 上层黄色透明的即为血浆。 二、DNA的提取 1.取血浆250ul（如不足250ul，用Elution Buffer补足250ul）于1.5ml无菌EP管中。 2.加入10ul OB蛋白酶和250ul BL Buffer（含4ul线性丙烯酰胺用于填补病毒DNA在吸附 柱上的本底吸附），于旋涡混合振荡仪上最大速度振荡15sec。 3.65℃孵育10min。孵育过程中，用旋涡混合振荡仪混匀一次。 4.加入260ul乙醇，旋涡混合振荡仪最大速度振荡20sec。12000×g离心10sec，使盖子上的 液体沉于管中。 5.将Hibind DNA结合柱装在2ml收集管中，将第4步离心的上清中所有液体（约760ul） 加入Hibind DNA结合柱装上，8000×g离心1min。卸下收集管，将收集管及其中的液体弃去。 6.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的收集管中，向柱中加入500ul HB Buffer，8000×g 离心1min，卸下收集管，倒掉其中的液体后，将收集管重新装在柱子上。、 7.向柱中加入700ul DNA Wash Buffer，8000×g离心1min，卸下收集管，将收集管及其中 的液体弃去。 8.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的收集管中，向柱中加入700ul DNA Wash Buffer， 8000×g离心1min，卸下收集管，倒掉其中的液体后，将收集管重新装在柱子上。 9.将空的Hibind DNA结合柱15000×g离心2min，以去掉其中残余的液体。卸下收集管， 将收集管及其中的液体弃去。----这一步非常重要 10.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的无菌1.5ml EP管上（事先做好标记），加入50-100ul 65℃预热的Elution Buffer，室温静置5min后，8000×g离心1min，洗脱液中即含有病毒DNA。 三、DNA定量： 微量DNA定量仪。取1.5ul用于DNA定量。

病毒基因组DNA提取试剂盒使用说明书

病毒基因组DNA 提取试剂盒 Virus Genomic DNA Kit (目录号：HS0307) 产品包装 自备试剂 无水乙醇 储存条件 蛋白酶K 于-20℃，其他组分室温（15 ~ 25℃） 产品简介 本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的血浆、血清和无细胞体液中提取高质量的病毒DNA 。无需使用苯酚、氯仿等有机溶剂抽提，独特的缓冲液/蛋白酶K 体系能迅速裂解病毒，使病毒蛋白与DNA 分离，在蛋白酶K 的作用下降解病毒蛋白，在高盐状态下将病毒DNA 选择性吸附于硅基质膜上，再通过快速的漂洗、离心步骤，去除蛋白等杂质，最后低盐的洗脱缓冲液将高纯度的病毒DNA 从吸附柱膜上洗脱下来。 本试剂盒操作简单、快速，所得病毒DNA 不含蛋白、核酸酶和其他杂质，可直接用于PCR 、RT-PCR 、Real-Time PCR 、印迹等分子生物学实验。 产品特点 1.简便快速，1小时内可获得高纯度的病毒基因组DNA 。 2.无需有机溶剂抽提，使用安全。 3.重复性好，产量高。 北京厚生博泰科技有限公司 Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.

4.所得病毒DNA纯度高，无污染物和抑制剂，方便下游应用。 注意事项 1.血清或血浆避免反复冻融，否则会使蛋白变性或产生沉淀，导致提取的DNA片段小，提取量下降。 2.如缓冲液Buffer GB、Buffer GD结晶或产生沉淀，可在56℃水浴溶解。 3.所有离心步骤均为室温下操作。 操作步骤 1. 取1.5 ml离心管（自备），加入20 ul的Proteinase K溶液。 2. 向离心管中加入200 ul血清或血浆，然后再加入200 ul Buffer GB，涡旋震荡15 sec。（注意：1、样本体积不足200 ul可以加入0.9% NaCl（自备）补足。2、为确保样本有效裂解，加入Buffer GB后，需将样本与Buffer GB充分混匀。） 3．56℃孵育15 min，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底。 4. 加入250 ul无水乙醇，涡旋震荡15 sec，室温放置5 min，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底。 (注意：如果环境温度超过25℃，无水乙醇应在冰上预冷后使用。) 5．将一个Spin Columns CG*放入Collection Tubes(2 ml)中，将上一步所得溶液转移到离心吸附柱中，10 000 rpm离心30 sec，弃收集管中的废液。 6. 向吸附柱内加入500 ul的Buffer GD，室温10 000 rpm离心30 sec，弃收集管中废液。（注意：Buffer GD中含有乙醇，用后及时盖紧，以防乙醇挥发） 7. 向吸附柱内加入500 ul的Buffer PW，室温10 000 rpm离心30 sec，弃收集管中废液。（注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7一次。Buffer PW中含有乙醇，用后及时盖紧，以防乙醇挥发） 8．向吸附柱中加入500 ul无水乙醇，10 000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 9．室温12 000 rpm离心3 min，甩干残留液体。 （注意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用） 10. 将离心吸附柱置于一个新的1.5 ml塑料离心管（自备）中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3 min，使吸附膜完全变干。加入30 ~ 100 ul的洗脱液，室温放置2 ~ 5 min。12 000 rpm

病毒基因组DNA RNA快速提取试剂盒II操作方法及步骤说明书

试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存50次(RN2201) 裂解液VLB 室温20 ml Poly Carrier -20℃200μl 去蛋白液RE 室温25 ml 漂洗液RW 室温10 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H2O 室温10 ml RNase-free 吸附柱RA和收集管 室温50套 室温储存12个月不影响使用效果，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 产品介绍： 采用特异性结合病毒DNA/RNA 的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，病毒DNA/RNA提取试剂盒适合于从无细胞体液，包括血浆、血清、腹水、培养细胞上清液、脑脊髓液及尿液等中快速提取高纯的病毒DNA/RNA。该产品可以满足绝大多数的病毒RNA/DNA的同时提取要求，如病毒RNA：HCV（丙肝病毒）,HIV（艾滋病毒）,和HTLV（人类嗜T淋巴细胞病毒）；病毒DNA：HBV（乙肝病毒）和CMV（巨细胞病毒）等等。病毒裂解后，DNA/RNA后在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜（特别配备了Poly Carrier可以从体系中轻松捕获微量核酸），再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净的病毒DNA/RNA从硅基质膜上洗脱。纯化后的病毒核酸无杂质和PCR抑制剂，可直接适用于PCR/RT-PCR分析。 产品特点：

1.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 2.节省时间，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。 3.多次柱漂洗确保高纯度，提取的病毒DNA/RNA 纯度高，质量稳定可靠，可适用 于各种常规操作，包括PCR/RT-PCR、酶切、测序、Southern 杂交等。 注意事项： 1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机， 如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2.开始实验前将需要的水浴先预热到特定温度备用。 3.裂解液VLB和去蛋白液RE中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染 皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。4.Poly Carrier： Poly Carrier使用方法：如果起始处理量很少，我们推荐使用Poly Carrier，如果预期有较大量核酸产量，用户可以根据需要选择是否加入Poly Carrier。使用时在每个样品提取所需裂解液VLB中加入4μl Poly Carrier储存溶液，将裂解液VLB与Poly Carrier溶液充分颠倒混匀即可(裂解液VLB容易起泡沫，请勿使用涡旋振荡混匀)。也可根据样品数量，在总共需要的裂解液VLB中加入总共需要的Poly Carrier混匀备用。混合液在室温24小时内稳定。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 提示：第一次使用前请先在10ml漂洗液RW中加入40ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! 1.200μl血清等体液（需回复到室温，不足可用0.9% NaCl或者PBS补足）转入上 述1.5ml离心管，加入400μl 裂解液VLB，立刻涡旋振荡充分混匀。

RNA病毒基因组提取试剂盒使用说明

RNA病毒基因组提取试剂盒使用说明 货号：R2000 规格：50T/100T 保存：室温（15℃-25℃）干燥条件下可保存12个月，更长时间的保存可置于2℃-8℃。产品内容： 试剂盒组成R2000-50R2000-100 蛋白酶K1ml2ml 洗柱液50ml2ml 结合液25ml50ml×2 漂洗液15ml50ml RNase free ddH2O15ml15ml×2 RNase free吸附柱50个100个 RNase free收集管(2ml)50个100个 产品介绍： RNA病毒基因组提取试剂盒适合于从血清、细胞上清、淋巴液中提取RNA病毒基因组，不适合于细胞等组织内RNA病毒基因组的提取。使用本试剂盒提取的基因组RNA可用于RT-PCR实验。 操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入一瓶新开启的无水乙醇，加入到离瓶口约0.5-1cm距离，盖好摇匀。所有离心步骤均在2-8℃条件下进行。 1、取病毒上清液0.5ml，12000rpm离心5min，尽量吸尽上清使用，弃去沉淀（如无沉淀

可省去此步）。 2、向病毒上清中加入20ul10mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，65℃消化10min，期间可颠倒离心管混匀数次。 3、吸附柱前处理：从包装中取出吸附柱，放入收集管中，加入700ul洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中待用。 4、向病毒上清中加入500ul结合液，充分混匀。再向管中加入400ul无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响RNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，静置2min。（吸附柱的最大容积为750ul，可分两次加入。一次吸附完离心后再将余下的混合液体加入柱中静置离心。） 5、12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 7、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 8、12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。 9、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50ul-100ul经65℃水浴预热的RNase free ddH2O，室温放置5min，12000rpm离心2min。即可得到高质量的病毒基因组RNA。 注意事项： 1、经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。 2、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的RNA提取量也下降。

病毒DNA提取

我要提取一种病毒的DNA，DNA是单链的，外面是病毒的蛋白质外壳包裹。 我的病毒样品是买来的灭活疫苗(vaccine)（干粉状），想用酚/氯仿来抽提DNA，请问病毒干粉要溶解在什么溶液里？ 回复 1、病毒干粉可以溶解在PBS、HBSS或者营养液如1640或MEM中。 2、振荡溶解之后，取上清加入等体积的消化缓冲液(0.5M EDTA pH8.0.1M Tris·HCl pH7.4, 10% SDS) , 再加入蛋白酶K (20mg/ml) 至终浓度50ug/ml, 于50℃消化2 h。 3、取出300ul 的消化产物, 加入等体积的酚抽提一次。 4、用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇再抽提两次,。 5、加入1/10体积的3M 乙酸钠（pH 5.2）和2倍体积的无水乙醇沉淀 6、70% 乙醇洗涤 7、待沉淀干燥后溶于含RNase A (40ug/ml) TE(pH 8.0) 溶液中。 谢谢您回答我的问题，还想请问，从疫苗(vaccine)干粉中提取DNA，跑琼脂糖凝胶电泳，能看到明显的条带吗？病毒干粉要取多少量来提取？另外，我曾经把疫苗(vaccine)中的病毒干粉溶解在无菌高纯水中，结果水变成了红色，应该是有些疫苗(vaccine)佐剂在影响，请问要如何排除疫苗(vaccine)佐剂影响，红色的物质可能是什么？？ 红色的东西应该是保护剂的颜色，保护剂一般是蛋白或其他大分子一类的东西，对DNA提取可能会有一些干扰，如果有条件，可以细胞传代一次最好，不过可能影响也不是很大。疫苗(vaccine)干粉中提取的DNA跑琼脂糖凝胶电泳，能否看到明显的条带，主要与含有的病毒量、提取的DNA量有关。如果后续是扩增基因，微量的可能也就足够了。病毒干粉溶解具体看病毒说明书的推荐，如果没有一般用1-2ml的量来溶解，取多少量来提取DNA，按照说明书一般取300ul左右，如DNAzol。注意提取之前先离心，取上清提取DNA。 血清HBVDNA提取方法 裂解法： 试剂： TES：10mmol/LTris-HCl,pH8.0, 5mmol/L EDTA, 0.5%SDS 150μg/ml蛋白酶K 100μl血清加TES 方法： 65°C3小时 加等体积酚-氯仿-异戊醇,混匀,12000ｒ/ｍｉｎ离心10分钟,将上清吸入一新管 再用等体积氯仿-异戊醇提取一次,在上清中加入1/10体积的2ｍｏｌ/Ｌ乙酸钠和2倍体积的无水乙醇,-20℃放置30分钟(或过夜),沉淀ＤＮＡ,用70%乙醇洗沉淀1次,12000ｒｐｍ/ｍｉｎ离心10分钟,倾去上清,晾干,加100μｌＴＥ缓冲液溶解沉淀 煮沸法提取血清HBV DNA： 吸200ul 血清放入0.5ml EP管中，沸水煮10分钟，10000rpm离心5min

血清中病毒DNA提取方法

血清中病毒DNA提取方法。 一煮沸法 从血清中提取病毒DNA，与其它方法比较，此法最为简单，并且很多文献都有报道。 鲁艳芹等在一篇名为《乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法及专用试剂盒》专利(专利申请号为200610044679)中对六种方法提取血清中乙型肝炎病毒DNA的效率做了比较，得出结果是：NaOH裂解法最佳，其次是直接煮沸法，但该法不适合提取粘稠度较高的血样标本。说明直接煮沸法还是可以的。 另外，陈秀珍等人《采用不同方法提取血清及乳汁中HBV-DNA扩增结果分析》对抽提法、热处理、碱变性法提取乙肝标志物阳性出产妇血清及乳汁中HBV-DNA方法进行评价，发现血清标本HBV-DNA的提取，三种方法无明显差异。 陈秀珍等：取血清100ul，放入0.5ulEP管中，沸水中煮10分钟，10000r/m,离心5分钟，取上清备用。 专利：取血清100ul和100ulPBS，煮沸10分钟，12000rpm, 离心5分钟，取上清备用. 两篇文章所用的煮沸法大致一样,只是是否加PBS的差异。加PBS，这样使得血清在煮10分钟后，不会干掉，没有上清，另外，它不会干扰核酸的提取。加TE是否也可以呢？ 二裂解液煮沸法 郭龙华等《3种方法从血清标本中提取I--IBV DNA 的比较》

比较3种从血清标本中提取HBV DNA方法的效果，选出一种快速、简单、高效提取血清中HBV DNA的方法——裂解液煮沸法，此法提取的HBV DNA模板含量最高，与碱裂解法和蛋白酶K-苯酚抽提法之间的差异显著(P