微生物学实验指导书
微生物学实验指导书生物技术教学部初立业编
重庆邮电学院生物信息学院
2003年12月30日
前言
一、本课程的性质和任务
微生物学实验是生物学重要的基础课之一，特别是随着分子生物学的发展与拓宽，微生物学方法与技术显得尤为重要。此外，医学、农学、林学等学科，甚至地质学、太空学等也需微生物的方法与技术。因此，熟悉掌握微生物学方法与技术，对其它很多学科的发展有直接的影响。无菌操作技能和无菌概念的建立是微生物学实验中最重要的内容，微生物学实验课主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。
二、教学要求与教学方法
1.教学要求
1)注重微生物学基础实验技能的掌握与提高，克服盲目追求新颖而忽视基础的倾向；
2)实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤；
3)在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象；
4)树立密切合作的风气，包括学生与老师、班与班、组与组、组长与组员之间的密配合。
2.教学方法
1)以学生自己动手为主，老师在适当时间予以提示；
2)对实验中所出现的一些现象多向学生提出问题，使它们学会分析结果，并与理论知识有
机结合；
3）根据实验的进行程度，引导学生更深入思考，逐步树立他们的创新意思；
4）严格要求使操作技能规范化，老师作示范，强调其要点学生自己练。
三. 教学学时分配与安排
本课程按每周3学时安排，共6个实验，总学时18。
目录
实验一细菌的革兰氏染色 (3)
实验二根霉、酵母菌形态结构的观察 (4)
实验三培养基制备 (6)
实验四灭菌与消毒 (9)
实验五微生物的分离和纯化 (12)
实验六微生物的生理生化反应 (14)
实验七水中细菌总数的测定 (19)
实验八放线菌形态的观察 (21)
实验九细菌的芽胞染色 (22)
实验十微生物菌种保藏 (24)
实验一细菌的革兰氏染色法
实验目的：
1．学习并初步掌握革兰氏染色法。
2．了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
实验原理：
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，象简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
实验器材：
1．菌种大肠杆菌(Escherichia coli)约24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)约24h营养琼脂斜面培养物，蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）12～20h营养琼脂斜面培养物。
2．染色剂革兰氏染色液。
3. 仪器或其它用具显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水。
实验内容：
1．制片
取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
*要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。
2．初染
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。
3．媒染
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
4．脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直
至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
*革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20-30s。
5．复染
用番红染液复染约2min，水洗。
6．镜检
干燥后，用油镜观察。
菌体被染成蓝紫色是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。
7．混合涂片染色
按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄菌作为混合涂片、染色、镜检进行比较。
实验报告：
1．列表简述3株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。2．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？最关键的环节是什么？
3．现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。4．你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。
5．进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？6．革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
7．你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？
实验二根霉、酵母菌形态结构的观察
实验目的：
1．观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。2．学习并掌握观察霉菌的基本方法，了解四类常见霉菌的基本形态特征。
实验原理：
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水侵片来观察酵母菌的形态和发芽生殖方式。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。
霉菌可产生分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，可用低倍显微镜观察。
观察霉菌的形态主要有三种方法，
直接制片观察法：是将培养物放置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检，其制片的特点是：细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥，能保存较长时间；能防止孢子飞散；染液的蓝色能增强反差。必要时，还可用树脂封固，制成永久标本长期保存。
载玻片培养观察法：用无菌操作将培养物琼脂薄层放置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置显微镜下观察。这中方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育时期的培养物。
玻璃纸培养观察法：霉菌的玻璃纸培养观察方法与放线菌玻璃纸培养观察方法相似。这种方法用于观察不同生长阶段霉菌的形态，也可获得良好的效果。
实验器材：
1.菌种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养约2day 的麦芽汁斜面培养物，曲霉(Aspergillus sp.) ，青霉(Pencillium sp.)，根霉（Rhizopus sp.）和毛霉（Mucor sp.）培养2-5天的马铃薯琼脂平板培养物。
2.溶液或试剂0.05%和0.1%吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液，乳酸石炭酸棉蓝染色液。
3.仪器或其它用具显微镜，载玻片，盖玻片，无菌吸管，平皿，载玻片，盖玻片，U 型玻璃棒，解剖针，镊子，50%乙醇，20%的甘油等。
实验内容：
（一）酵母观察
1.美蓝浸片的观察
(1) 在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌放在染液中，混合均匀。
(2) 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢地将盖玻片放下使其盖在菌液上。
(3) 将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。
(4) 染色约0.5h后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。
(5) 用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。
2.水—碘液浸片的观察
在载玻片中央加一小滴革兰氏染色液用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水—碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。
（二）霉菌观察
1.直接制片观察法
在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染色液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，放置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。
2.载玻片培养观察法
(1)培养小室的灭菌在平皿皿底铺一张略少于皿底的圆滤纸片，再放一U型玻璃棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖。包扎后121°C灭菌30min，烘干备用。
(2)琼脂块的制作取已经灭菌的马铃薯琼脂培养基6~7ml注入另一个灭菌平皿中，使之凝
固成薄层。解剖刀切成0.5~1cm2的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上。
(3)接种用尖细的接种针挑取很少量的孢子接种于琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖再琼脂块上。
(4)培养先在平皿的滤纸上加3~5ml灭菌的20%甘油(用于保持平皿内的湿度)，盖上盖，28°C培养。
(5)镜检根据需要可以在不同的培养时间内取出载玻片置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。实验报告：
1．绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征
2．说明观察到的吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？分析其原因。
3．在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？
4．你主要根据哪些形态特征来区分所观察的四种霉菌？
5．在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什么？
实验三培养基制备
实验目的：了解培养基的制备原理并掌握其制备过程。
实验原理：
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
由于各种微生物所需要的营养不同，所以培养基的种类很多。可以根据微生物种类和实验目的不同分成若干类型。培养基的类别如下：
1.按照培养基的成分来分
培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。
(1)合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏培养基等。
(2)天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。
(3)半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。
2.按照培养基的物理状态分
培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。
(1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。
(2)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。
(3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。
3.按照培养基用途分
培养基按用途可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。
(1)基础培养基含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基是天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培养基。
(2)加富培养基是在基础培养基中加入某些特殊营养物质，如血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。
(3)选择性培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。
⑷鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使微生物培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。
实验器材：
1．溶液或试剂牛肉膏，蛋白胨，琼脂，可溶性淀粉，葡萄糖，孟加拉红，链霉素，1mol/L NaOH，lmol/L HCl，KNO3，NaCl，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O。2．仪器或其他用具试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，pH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，线绳，纱布，漏斗，漏斗架，胶管，止水夹等。
实验内容：
（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：
牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.6
1．称药品
按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2．加热溶解
在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。
3．调pH
检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4．过滤
液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。
5．分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容
积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
6．加棉塞
试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约2/3塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。
7．包扎
加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。
8．灭菌
将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
9．摆斜面
灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2。
10．无菌检查
将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。
（二）高氏Ⅰ号培养基的配制
高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：
可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，
FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。
l．称量和溶解
先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加入少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL 水中加入1g的FeSO4·7H2O，配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2．pH调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
（三）马丁氏培养基的配制
马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：
KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，琼脂15～20g，水1000mL，自然pH。
1．称量和溶解
先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需量的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。2．分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
3．链霉素的加入
链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃)，在100mL培养基中加1%链霉素0.3mL ，使每毫升培养基中含链霉素30μg。
注意事项：称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。
实验报告：
l．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?
2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?
3．细菌能在高氏Ⅰ号培养基上生长吗？为了分离放线菌，你认为应该采取什么措施？4．什么是选择性培养基？它在微生物学工作中有何重要性？
5．如果在用马丁氏培养基分离真菌时，发现有细菌生长，你认为是什么原因？你将如何进一步分离纯化得到所需要的真菌？
实验四灭菌与消毒
实验目的：
1．了解干热灭菌的原理和应用范围。学习干热灭菌的操作技术。
2．了解高压蒸气灭菌的基本原理及应用范围。学习高压蒸气灭菌的操作方法。
3．了解紫外线灭菌的原理和方法。
实验原理：
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表1），，二是湿热的穿透力比干热大（表2），，三是湿热的蒸气有潜热存在。1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
表1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系
表2干热湿热穿透力及灭菌效果比较
在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表3）
表3 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系
现在法定压力单位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其换算关系为：1kg/cm2=98066.5Pa；1Ib/in2=6894.76Pa.
一般培养基用0.1Mpa（相当于15 Ib/in2或1.05kg/cm2），121.5℃，15～30min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.06Mpa（8Ib/in2或0.59kg/cm2）112.6℃灭菌15min，但为了保证效果，可将其他成分先行121.3o C, 灭菌20min,然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以0.1Mpa，121.5℃灭菌20min即可，而盛于大瓶内的培养基最好以0.1Mpa，122℃灭菌30min。
实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式和手提式二种，其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸气灭菌锅为例，介绍其使用方法，有关自控高压蒸气灭菌锅（autoclave）的使用可参照厂家说明书。
紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200~300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）。O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前；可在无菌室内(或接种箱内)喷洒3%～5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用2%～3%的来苏尔擦洗，然
微生物实验指导书
实验一普通光学显微镜的使用及其对微生物一般形态的观察 一、实验目的 1．了解普通光学显微镜的构造及其各部分的作用。 2．掌握普通光学显微镜的正确使用和维护方法。 3．通过低倍镜、高倍镜观察藻类、酵母培养液和新鲜活性污泥中微生物的一般形态。 二、实验原理 普通光学显微镜由机械部分和光学部分组成。 图1-1 双目生物显微镜 1．机械部分： （1）镜筒：位于镜臂上端的空心圆筒，是光线的通道。镜筒的上端可插入目镜，下面与转换器相连。 （2）转换器：位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有3~4个孔，用于安装不同放大倍数的物镜。 （3）载物台：载物台是放置标本的方块平台，中央有透光孔，载物台上面有玻片夹持器，侧面有移动手轮，可纵向和横向移动标本。 （4）调焦手轮：包括粗调手轮和微调手轮，可使载物台上下升降，调节物镜和标本之间的距离。 2．光学部分： （1）目镜：放在镜筒上，配有10倍（10×）、16倍（16×）两种。 （2）物镜：装在转换器的孔上，有低倍镜（4、10）、高倍镜（40）和油镜（100），是显微镜中最主要的部分。各种镜头上都刻有放大倍数和数值孔径（A N ）及所要求盖玻片厚度等主要参数。物镜的性能由数值孔径决定，并且还依赖于物镜的分辨率。 （3）聚光器：由聚光镜和孔径光阑组成。聚光镜的作用是把光线聚集在标本上，增强照明度。孔径光阑是用来调节对比度的，使物镜和聚光器的数值孔径相符合。当孔径光阑开启到物镜出瞳的70~80%时，就可以得到足够对比度的良好图象。如果开得太大，超过物镜的数值孔径，就会产生光斑；如果开得太小，则分辨率下降，降低物像的清晰度。 （4）电光源：在显微镜的下部，提供观察标本时所用光源。
微生物学实验技术指导书
实验须知 普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基础知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。 2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导老师，及时处理，切勿隐瞒。 5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。 6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。 7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石碳酸液覆盖0.5小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前需浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。 8.每次实验需进行培养的材料，应标明姓名、组别及处理方法，放于教师指定的仪器内培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10.实验结束后，整理桌面，物归原处，留人打扫室内卫生。 11.离实验室前，将手洗净，注意关闭火、煤气、灯、水管等。
检验科微生物室sop文件检验科微生物实验室
检验科微生物室sop文件检验科微生物实验室检验科微生物室SOP文件检验科微生物实验室 作业指导书细菌室工作守则文件编号:LAB,SOP,JX001 细菌室工作守则 1.每日工作前用紫外线照射实验室半小时以上。 2.入室前应穿工作服，并做好实验前的各项准备工作。 3.实验室内应保持肃静，不准吸烟、吃东西及用手触摸面部。尽量减少室内活动，以免引起风动，无关人员禁入。 4.非必要物品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。 5.做好标本的登记、编号及试验记录。未发出报告前，请勿丢弃标本。 6.标本处理及各项试验应在操作间进行，接种环用完后应立即火焰灭菌，沾菌吸管、玻片等用后应浸泡在消毒液内。 7.实验时手部污染，应立即用过氧乙酸消毒或浸于3%来苏儿溶液中5-10分，再用肥皂洗手并冲洗干净;如误入口内，应立即吐出，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口，根据实际情况服用有关药物。 8.实验过程中，如污染了实验台或地面，应用3%来苏儿覆盖其上半小时，然后清洗;如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。 9.若出现着火情况，应沉着处理，切勿慌张，立即关闭电闸，积极灭火。易燃物品(如酒精、二甲苯、乙醚和丙酮等)必须远离火源，妥善保存。 10.工作结束时检查电器、酒精灯等是否关闭，观察记录培养箱、冰箱温度及工作情况，用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，并将试剂、用具等放回原处，清理台面，未污染的废弃物扔进污物桶，有菌废弃物应送高压灭菌后处理。 11.离室前工作人员应将双手用消毒液消毒，并用肥皂和清水洗净。
12.爱护仪器设备，经常清洁，注意防尘和防潮。 作业指导书细菌室消毒隔离措施文件编号:LAB,SOP,JX002 细菌室消毒隔离措施 1.每天工作前用消毒液消毒工作台，上班前、下班后开紫外灯(最少半小时)进行空气消毒。 2.非必要品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。 3.使用后的载玻片、盖片、平皿、试管等用消毒液浸泡，经煮沸后清洗或丢弃。 4.试验后的血液标本用消毒液浸泡后煮沸消毒，所有用于试验的反应板、吸头等用消毒液浸泡(至少24小时以上)后清洗或丢弃。 5.所有微生物培养物(细菌、支原体、真菌等培养物)，不管标本阳性或阴性均用消毒液浸泡后，经煮沸消毒，才能清洗或丢弃。 6.取材、最好采用一次性工具，不能采用一次性工具者，每次取材前均应彻底消毒。 7.用于浸泡各种器械如刮菌刀、持物钳、镊子等的消毒液要定期更换。 8.不慎发生临床标本或培养物污染工作台，不要立即用水冲洗，应先用纸巾、布等敷料加上消毒液(如5%石炭酸、3%来苏儿等)消毒30分钟以上，然后再清洗。如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。 9.实验时手部污染，应立即用肥皂洗手并冲洗干净，再外用消毒药水，如误入口内，应立即吐出，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口，必要时根据实际情况服用有关药物。作业指导书微生物实验室安全与防护文件编 号:LAB,SOP,JX003 在工作区内禁止饮食，吸烟和存放食物及使用化妆品。 实验室里应保持整洁，不存放与工作无关的杂物。 工作台每天至少用消毒剂清洁一次，在溢渗传染物后要立即消毒、清洗; 进入无菌室必须穿工作服，戴口罩、帽子。 在各种操作进程中均应尽量避免或减少气溶胶产生。
微生物实验指导
二零零六年十月
目录 实验一显微镜油浸系物镜的使用 ------------------------------------------3实验二细菌形态的观察-------------------------------------------------------------4实验三细菌简单染色法及口腔微生物的观察 ------------------------5实验四细菌的革兰氏染色---------------------------------------------------------7实验五细菌的芽胞染色 ------------------------------------------------------------8实验六酵母菌的形态观察实验 ---------------------------------------------- 10实验七霉菌的形态观察----------------------------------------------------------- 12实验八细菌大小的测定----------------------------------------------------------- 14实验九细菌数量的测定（血球板计数） ------------------------------ 16实验十培养基的配制--------------------------------------------------------------- 19实验十一消毒与灭菌--------------------------------------------------------------- 21实验十二稀释平板计数及微生物菌落形态的观察 -------------- 27实验十三紫外线对微生物生长的影响 ---------------------------------- 30实验十四抗生素对微生物的作用 ------------------------------------------ 30实验十五比浊法测定大肠杆菌的生长曲线 ------------------------ 31实验十六土壤中好气性细菌的分离与计数(附划线分离法)33实验十七土壤中放线菌的分离与计数 -------------------------------- 35实验十八土壤中真菌的分离与计数 ------------------------------------ 36实验十九纤维素分解试验----------------------------------------------------------- 37
环境工程微生物实验指导书-图文
环境工程微生物实验指导书-图文 实验一光学显微镜的操作及细菌形态观察 1.1实验目的 (1)掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养。 (2)观察几种典型细菌的形态与构造，学会绘制微生物图。 1.2实验器材 显微镜、二甲苯、香柏油、载玻片、盖玻片、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、球衣菌、假单胞菌、固氮菌标本片。 1.3显微镜的结构及其操作方法 1.3.1普通光学显微镜(LightMicrocope)1.3.1.1光学显微镜的结构和各部件作用 观察、检验微生物通常用光学生物显微镜（见图1-1），显微镜分机械装置和光学系 统两部分。 一机械装置 (1)镜筒：镜筒长度一般是160cm。它的上端装目镜，下端装物镜回转板。回转板上一般有三个物镜。 (2)转换器：位于镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个孔或5个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。
(3)载物台：载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光 线可以通过。两旁有弹簧夹，用以固定标本或载破片。有的载物台上装有 自动推物器。 (4)调节器：镜筒旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降镜筒，调节物镜与被观察物体之间的距离。 二光学光学系统 （1）目镜：一般使用的显微镜具有2—3个目镜，其上刻有“5某”、“10某”、“15某”(或“16某”) 等数字及符号，意即放大5倍、10倍、15倍(16倍)。这三种透镜的 焦距分别为50mm、25nn、16mm，线视场分别为20mm、14mm、10mm。 （2）物镜：物镜装在回转板上，可分为低倍物镜、高倍物镜和油镜 三种。相应的放大倍数是10某（5某）、40某（50某）、100某（90某），相应的工作距离是7.63mm、0.5mm、0.198mm，物镜上常标注数值 孔径（N.A）。使用低倍镜和高倍镜时，一般做活体观察，不进行染色。 在观察原生动物时，低倍镜主要用来观察全部原生动物的种类和观察它的 活动状态，而高倍镜则可以看清楚微生物的结构特征。油镜在大多数情况 下是用来观察染色的涂片。 （3）集光器集光器在载物台的下面，用来集合反光镜反射来的光线。集光器可以上下调整，中央装有光圈，可以调整光线的强弱。当光线过强时，应缩小光圈或把集光器向下移动。 （4）反光镜反光镜装在显微镜的最下方，有平凹面反光镜。 1.3.1.2光学显微镜的分辨率与放大倍数
(完整版)微生物学实验指导书
实验一微生物的分离和纯化 本实验以微生物的分离和纯化为主线，综合包括了培养基的配制、消毒灭菌、微生物的分离等内容,在给定的时间内由学生自主完成。包括以下知识内容。学生书写实验报告的时候,不能照抄袭原文，要用自己的语言，表述实验过程，在别人看完你的实验报告后,能够知道你是怎样做的，能够重复你的实验过程。 一、目的要求 1．了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法. 2．掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。 3 学习、掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术. 4 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 5 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术,了解培养细菌、放线菌及霉等种类的微生物的培养条件. 二、原理 培养基是将微生物生长繁殖所需要各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。其中除含有水分、碳水化合物、含氮化合物和无机盐类。此外，微生物还必须在最合适的酸碱度范围的培养基上生长繁殖，因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的PH值范围.根据研究目的不同,可将培养基制成固体、半固体和液体三种形式。固体培养基是在液体培养基中加入1.5～2％的琼脂作凝固剂，半固体培养基则加入0.5～0.8％的琼脂.有时为了特殊目的，也可用明胶或硅胶等作为凝固剂。 由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。在分离、培养异样微生物时，对一般细菌常用肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏合成1号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基，有时也常用马丁培养基分离霉菌。马丁培养基除含有霉菌所含需的各种营养物外,还有孟加拉红染料，能抑制放线菌和细菌，链霉素可杀死或抑制细菌，但对霉菌均无害，所以这种培养基具有选择作用。
OG500 公共场所卫生检验方法 第3部分：空气微生物作业指导书
公共场所卫生检验方法 第3部分：空气微生物作业指导书 一、适用范围： GB/T18204的本部分规定了公共场所空气中细菌总数、真菌总数、β-溶血性链球菌和嗜肺军团菌的现场采样与实验室培养方法。 本部分适用于公共场所空气中细菌总数、真菌总数、β-溶血性链球菌和嗜肺军团菌的测定，其他场所可参照执行。 注：本部分中同一个指标如果有2个或者2个以上检验方法时，可根据技术条件选择使用。 二、参考文献 GB/T18204.3—2013《公共场所卫生检验方法》第三部分：空气微生物 三、细菌总数 3.1 原理： 采用撞击方法或者自然沉降法采样、营养琼脂培养基培养计数的方法测定公共场所空气中的细菌总数。 3.2 撞击法 3.2.1 仪器和设备 3.2.1.1六级筛孔撞击式微生物采样器。 3.2.1.2 高压蒸汽灭菌器。 3.2.1.3 恒温培养箱。 3.2.1.4 平皿：直径90mm 3.2.2培养基 3.2.2.1 营养琼脂培养基成分： 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 肉膏 3g 琼脂 20g 蒸馏水 1000mL 2.2.2.2 制法：将蛋白胨、氯化钠、肉膏溶于蒸馏水中，校正PH为7.2～7.6,加入琼脂，121℃，20min灭菌备用。
3.2.3采样 3.2.4 检验步骤 将采集细菌后的营养琼脂平皿置35℃～37℃培养48h，菌落计数。 3.2.5 结果报告 3.2.5.1采样点细菌总数结果计算：菌落计数，记录结果并按稀释比与采气体积换算成CFU/ m3 （每立方米空气中菌落形成单位）。 2.2.5.2一个区域细菌总数测定结果：一个区域空气中细菌总数的测定结果按该区域全部采样点中细菌总数测定值的最大值给出。 3.3 自然沉降法 3.3.1 仪器和设备 3.3.1.1 高压蒸汽灭菌器。 3.3.1.2 恒温培养箱。 3.3.1.3 平皿：直径90mm。 3.3.1.4 采样支架。 3.3.2 培养基 见3.2.2。 3.3.3 采样 3.3.4 检验步骤 见3.2.4。 3.3.5 结果报告 计数每块平板上生长的菌落数，求出全部采样点的平均菌落数，检验结果以每平皿菌落数（CFU/皿）给出。 四、真菌总数： 4.1 原理 采用撞击法或者自然沉降法采样，沙氏琼脂培养基计数的方法测定公共场所空气中的真菌总数。 4.2 撞击法
二级甲等医院微生物检验作业指导书
XX县人民医院检验科质量管理体系文件(第八册) 微生物学 作业指导书 文件编号：XXJY-3-WSW-01~24 第5版 编制：XXX 审核：XXX 批准：XXX 生效日期：20XX年XX月XX日 XX县人民医院检验科
目录
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BD BACTECTM 9120全自动血培养仪 操作维护规程 1.目的 指导工作人员按照标准化的操作步骤来使用仪器，确保每日结果的准确可信。 2.基本结构 BD BACTECTM 9120全自动血培养仪由主机和联机电脑两部分组成。主机有控制面板及显示器；内有 A、B、C 3个孵育架，每个孵育架共40个瓶位，每个瓶位均有红、绿二色指示灯指示瓶位状况，瓶位 底部有检测荧光信号变化的检测器。主机门内贴有条码面板。 3.原理 配套使用的培养瓶内有微生物生长的各种营养物质，而微生物在生长过程中的代谢产物之一C02会激活瓶内底部荧光感应物质而发出荧光，荧光信号变化与CO2变化成正比。该荧光信号的变化经一组运算公式的运算，得出荧光信号变化的各种参数，从而判断培养瓶内是否有微生物生长。ΒD ΒACTECTM 9120设定瓶位探测器检测与计算时间间隔为每lOmin一次，并可根据运算结果提供生长曲线。 4.仪器操作步骤 4.1 开机 打开仪器电源开关，仪器进行系统自检。该机为24 小时连续开机，仅在必要时（如第一次使用或停电后）才需重新开机。 4.2工具菜单（F5 Utility） 4.2.1 功能描述 4.2.2 系统设置（F3）由BD 工程师或产品专员设定。 4.2.3 手工方式（F9）当条码扫描仪损坏时可以利用手工方式操作。 * 按F9 进入手工操作界面，界面指示与条码面板相同。 * 选择所需功能，并确认。 4.2.4 数据备份（F5）与备份回输（F7） 4.2.4.1 数据备份（F5）建议用户每天做数据备份，每天一张软盘，可循环使用。
微生物检测作业指导书
一．目的：为确保产品质量得到控制，依据GB15979及《消毒技术规范》规范制定微生物检测方法。 二．范围：适用于原料、包材、产品微生物检测（细菌/霉菌和真菌总数）。 三．职责：由研发部/实验室负责执行实施。 四．内容 4.1检测前准备： 4.1.1将检测用的试管、刻度吸管等洗净后置于干燥箱内干燥后备用。 4.1.2将使用过的培养皿连同培养基煮沸15-30分钟后，用清洁液洗净晾干备用。 4.1.3 0.9%生理盐水配制：准确称取9g氯化钠，加入1000ml去离子水。 4.1.4 中和剂配方 1) 磷酸盐缓冲液（PBS，0.03mol/L，pH7.2）无水磷酸氢二钠 2.84g磷酸二氢钾 1.36g 蒸馏水加至 1000ml 将各成分加入到1000ml 蒸馏水中，待完全溶解后，调 pH 至7.2～7.4，于121℃压力蒸气灭菌20min备用。 2) 硫代硫酸钠中和剂（0.1%） pH7.2-7.40.03mol/L磷酸盐缓冲液 100 ml硫代硫酸钠0.1g于121℃ 压力蒸气灭菌15min备用。 3) 0.3%（W/V）吐温80和0.3%卵磷脂 pH7.2-7.40.03mol/L磷酸盐缓冲液 100 ml吐温80 0.3g+0.3g卵磷脂于 121℃压力蒸气灭菌15min备用。 4) 0.3%甘氨酸 pH7.2-7.40.03mol/L磷酸盐缓冲液 100 ml甘氨酸 0.3g于121℃压力蒸气灭菌15min备用。 5) 对于复方或特殊消毒剂的中和剂，根据厂家提供的资料选用合适的中和剂或用以下中和剂: 4.2灭菌： 4.2.1干热灭菌法(160℃-170℃，2小时):适用于培养皿、取样用称量瓶、刻度吸管的灭菌。4.2.2湿热灭菌法(121℃，0.1Mpa，15-30min)：适用于培养基溶液、生理盐水、培养皿 、吸管、取样棉球等的灭菌。 4.3原料、产品微生物检测： 4.3.1抽样 a固体样品 用消毒取样器于同一个批次三个大包装（三个以上员工的产品）中至少随机抽取90g或抽取12个最小销售包
微生物学实验指导书
微生物学实验指导书生物技术教学部初立业编 重庆邮电学院生物信息学院
2003年12月30日 前言 一、本课程的性质和任务 微生物学实验是生物学重要的基础课之一，特别是随着分子生物学的发展与拓宽，微生物学方法与技术显得尤为重要。此外，医学、农学、林学等学科，甚至地质学、太空学等也需微生物的方法与技术。因此，熟悉掌握微生物学方法与技术，对其它很多学科的发展有直接的影响。无菌操作技能和无菌概念的建立是微生物学实验中最重要的内容，微生物学实验课主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。 二、教学要求与教学方法 1.教学要求
1)注重微生物学基础实验技能的掌握与提高，克服盲目追求新颖而忽视基础的倾向； 2)实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤； 3)在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象； 4)树立密切合作的风气，包括学生与老师、班与班、组与组、组长与组员之间的密配合。 2.教学方法 1)以学生自己动手为主，老师在适当时间予以提示； 2)对实验中所出现的一些现象多向学生提出问题，使它们学会分析结果，并与理论知识有 机结合； 3）根据实验的进行程度，引导学生更深入思考，逐步树立他们的创新意思； 4）严格要求使操作技能规范化，老师作示范，强调其要点学生自己练。 三. 教学学时分配与安排 本课程按每周3学时安排，共6个实验，总学时18。 目录 实验一细菌的革兰氏染色 (3) 实验二根霉、酵母菌形态结构的观察 (4)
医院检验微生物作业指导书
1.目的 规范微生物实验室内部质量控制，确保临床报告的质量。 2.适用范围 微生物实验室的所有检验项目。 3.职责 实验室检验人员均需熟知并遵守本程序。 4.程序 4.1分析前质量控制 4.1.1检验申请单：临床医生应按照《微生物检验项目申请程序》申请临床微生物检测口头申请追加样本检验项目，必须在样本有效期内申请.并补正式的检验申请单。 4.1.2生成微生物检验标本标签：护士应在核对医嘱患者信息和检验申请信息后，按照《微生物检验标本条形码程序》生成申请单和微生物检验项目标签，并将微生物检验项目标签正确张贴于标本容器上。 4.1.3样本采集手册：实验室应制订样本采集手册，指导正确采集和处理样本。 4.1.4样本采集和运输：样本采集人员应按照《采样前患者识别程序》确认患者，按照《标本采集、运送、保存程序》采集样本，并在规定的时间和温度范围内，使用指定的运输培养基，安全运送到微生物室。 4.1.5样本的接收：样本接收人员应严格按照《标本接收、标识及信息录人程序》《标本拒收程序》对样本接收或拒收，并记录。 4.1.6微生物检验标本信息输人：微生物实验室接种岗位检验人员严格按照相关的微生物标本检验信息输，人程序录人，核对患者信息和标本信息等资料。 4.1.7样本储存：微生物实验室接种岗位检验人员按照相关的微生物标本检验前储存程序正确铺存未能及时处理的标本，已经检验的样本应在保证其性质稳
定的条件下，将样本以适当的方式保留到规定时间内，以便能在出具结果报告后可以复查，成做补无检食。 4.2分析中质量控制 4.2.1试剂的质量控制 4.2.1.1所有试剂用于检测标本前，必须做质控以验证试剂性能并记录质控结果，只有质控合格才可使用（表2-1-1）。质控应遵循以下原则。 4.2.1.1.1使用中的染色剂（革兰染色、特殊染色和荧光染色），至少每周（若检测频率小于每周1次,则实验当日）用已知阳性和阴性（适用时）的质控菌株检测。 4.2.1.2平行试验：新批号试剂使用前须用老试利或参考材料平行试验。 4.2.1.3无厂商特别说明时，不同批号的试剂不可混用。 4.2.1.4缺陷或失效试剂只能用于培训员工业务能力，否则报废处理。培训试剂应明显标记“仅供培训使用"，并与检验试剂分开放置。 4.2.2培养基的质量控制 4.2.2.1培养基外观良好（平滑、水分适宜、无污染、适当的颜色和厚度，试管培养基湿度适宜），新批号及每一贷次的商品成自配培养基应检测相应的性能，包括无菌试验、生长试验或与旧批号平行试验、生长抑制试验（适用时）、生化反应（适用时）等，应以质控菌株进行验证。 4.2.2.2外观检查合格的培养基的标准：完整，琼脂附于平板底部，血平板应不透明、没有溶血情况，平板颜色好、湿润，无干裂、无污染、无浑浊或沉淀、无冻伤、无过热现象，琼脂厚度至少3mm。如发现与上述情况不符的培养基，应不予使用。 4.2.2.3无菌试验时抽检培养基数量：100块以内，随机抽检5%;100块以上可随机取10块平板或10支试管培养基进行无南试验。35C培养24h后观察是否有细菌生长，无细菌生长为合格。 4.2.2.4 生长试验及生化反应试验：质控菌栋（表2-1-2.表2-1-3）于35C培养24h，用无菌生理盐水配制0.5麦氏单位的细菌胁悬液。无菌生理盐水1：100稀释，每块平板接种10μ（浓度相当于103~104CFU/平板），培养24~48h。符合生长、
水微生物学实验指导书
水微生物学实验指导书 武汉科技大学城市建设学院 给排水工程系 2007.12
目录页 实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察活性污泥生物相的观察 实验二培养基的制备及灭菌 微生物的纯种分离及计数 实验三微生物生理生化特性
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察 一、实验目的 1.了解普通光学显微镜的构造，学习显微镜的使用方法和保养方法。 2.观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。 二. 实验内容 1．显微镜的使用方法和保养方法 2．微生物形态的观察 三、实验仪器、设备及材料 1.光学显微镜、载玻片、盖玻片等 2.示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌。 四、实验原理 显微镜的结构和各部分的作用 图1是微生物实验常用的双目电光源生物显微镜，其构造分机械和光学两部分：机械部分主要包括： 1．镜筒镜筒是双筒，两筒间距离可调，长度一般是160mm。它的上端装有接目镜，下端有回转板。回转板上一般装有3个接物镜。 2．载物台载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。两旁有弹簧夹，用以固定标本或载玻片。有的载物台上装有自动推物器。 3．调节器镜臂旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降载物台，调节接物镜与所需观察的物体之间的距离。 光学部分主要包括： 1．接目镜一股使用的显微镜具有2—3种放大倍数的接目镜，其上常刻有“5×”、“10×”或“16×”等数字及符号。意即使用时可放大5倍、10倍或16倍。观察微生物时常用放大10倍或16倍的接目镜。 2．接物镜接物镜装在回转板上．可分低倍镜、高倍镜和油镜3种，其相应的放大倍数常是10、40 (45)、100。通常显微镜的放大倍数等于接物镜与接目镜放大倍数的乘积。例如：用放大40倍的接物镜(高倍镜)与放大10倍的接目镜时所得的物象的放大倍数为40×10＝400。如果用放大100倍的接物镜则放大倍数为100×10＝1000。接目镜装在镜筒上端，在使用过程中并不经常变动，所以通常所谓的用低倍镜、高倍镜或油镜的观察主要是指使用不同的接物镜而言的。 油镜的放大倍数最大(100)。放大倍数这样大的镜头，焦距就很短．直径就很小。所以自标本玻片透过的光线，因介质密度(从玻片至空气，再进入油镜)不同、有些光线因折射或全反射，就不能进入镜头，致使射入的光线较少，物象显现不清。所
微生物实验室消毒处理和废弃物处理作业指导书
微生物试验室消毒处理和废弃物处理作业 引导书 微生物试验室是进行微生物学试验的紧要场所，而消毒处理和 废弃物处理是试验室安全卫生的紧要措施。因此，本引导书将介绍 微生物试验室的消毒处理和废弃物处理作业引导，以保障试验室工 作人员的安全和试验室内的卫生环境。 一、消毒处理作业引导 1.消毒处理的目的和原则 消毒处理是指利用化学方法或物理方法杀灭或去除物体表面和 内部的微生物及其有关的病原性物质，以达到破坏、削减、掌控微 生物数量的目的。消毒处理的原则是：高效、快速、安全、经济。 对于微生物试验室，消毒的目的是为了保持试验室内的微生物数量 在可接受的范围内，防止病原体的传播和交叉感染。 2.消毒处理的方法 （1）化学消毒法：化学消毒法是利用化学物质来杀灭或去除微 生物。消毒剂的选择要依据试验室内的物体种类、操作方式、使用 时间等因素来选择。一般来说，消毒剂会对微生物的酶、细胞膜等 结构造成损害，从而杀死微生物。化学消毒剂包括氯化物、戊二醛、过氧化氢等，实在配方可以参考化学的相关手册或者相关清洁用品 所配备的使用说明书。 （2）物理消毒法：物理消毒法是采纳较高的温度或较强的辐射 来杀灭或去除微生物。物理消毒法包括高温消毒、紫外线消毒等。 高温消毒一般会在微生物试验室使用，其温度可达到121℃左右，
消毒时间以20~25min为宜；紫外线消毒一般适用于试验室内不易处理的小物品，如托盘、试验管等，消毒时间一般为15~30min。 3.消毒处理的步骤 （1）清洗：清洗是消毒前的紧要步骤，是为了去除物体表面的污垢、微生物等，以削减消毒物质的消耗量和提高消毒效果。清洗时应用清水或清洁剂，不使用有毒性的物质进行清洗。 （2）消毒剂选择：选择合适的消毒剂，依据消毒对象、消毒方法和消毒剂的特性进行选择。一般情况下，我们会选用氯化物消毒剂或者过氧化氢等化学消毒剂。 （3）消毒：消毒方法依据试验室内物品的不同实行不同的消毒处理方式，采纳高温消毒、化学消毒、紫外线消毒等方法中的任意一种即可。 （4）验收：验收时要注意检查消毒的效果，包括是否存在死角未消毒、物品是否有异味等。 二、废弃物处理作业引导 1.废弃物处理的目的 微生物试验室废弃物的处理是保障试验室的卫生环境、工作安全的一项紧要内容。废弃物处理的目的是规范废弃物的处理流程，以达到清洁、安全的废弃物处理效果。 2.废弃物的分类 废弃物的分类应依据存在的物质种类、物品性质、不安全程度等来区分。废弃物分为以下几类： （1）一般垃圾：包括废纸、食品残渣和塑料等日常生活垃圾。
微生物学类实验指导书(下)蛋白酶产生菌活力测定及果酒酵母分离纯化
实验一产酶微生物的分离、纯化与选育 酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。 2. 蛋白酶产生菌的分离与纯化 2.1 实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化。 2.2 实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 2.3 实验仪器与材料土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。 2.4 实验方法与步骤 2.4.1 分离 1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液； 2）取1：10土壤悬液5ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌； 3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h； 4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 2.4.2 筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基，再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24-48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径。2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。 2.5 实验结果 在含酪蛋白的平板上，产蛋白酶的芽孢杆菌可形成蛋白质水解圈。自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶活力有很大差异，有些芽孢杆菌酶活力超过4000 U/mL。 1）描述你所分离的蛋白酶产生菌的菌落特征和个体形态特征；2）报告你所分离的蛋白酶产生菌的
微生物学实验操作大全
目录 实验一培养基的配制 实验二消毒与灭菌 实验三显微镜油浸系物镜的使用 实验四细菌形态的观察 实验五细菌的革兰氏染色 实验六放线菌的形态观察 实验七酵母菌的形态观察 实验八霉菌的形态观察 实验九细菌数量的测定(设计性实验)实验十微生物的接种方法
实验一培养基的配制 一、实验目的和内容 目的：学习和掌握配置培养基的一般方法和步骤 内容：1、牛肉膏蛋白胨的配制 2、高氏1号培养基的配制 3、马丁氏培养基的配制 二、实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/l NaOH、1mol/l HCl、KNO3、NaCl 、K2HPO4*3H2O、MgSO4*7H2O、 FeSO4*7H2O。 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布 三、操作步骤 （一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15~20g，水1000ml，pH7.4~7.6 1、称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯，牛肉膏极易吸潮，故称量时要迅速。 2、加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失水分。 3、调pH 检测培养基的pH，若偏酸，可滴加1mol/l NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/l HCl进行调节。PH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不可调过头，以免调回影响培养基内各离子的浓度 4、过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，这步可以省略。
微生物检验作业作业指导书.
1 目的 通过对微生物检测流程的规范确保检验工作有序进行. 2 范围 适用于微生物检测的全过程。 3 职责 3.1 检验人员严格按检测流程做好各项工作。 3.2 检测主管做好监督检查工作. 4 内容 4.1 准备工作 4。1.1 卫生清洁 整理普通检验室内的各类检验物品，检查工作台面和地面卫生。 4.1.2样品收集登记 4。1.2。1与收样员沟通，确定检样品种、数量（如仓库到货的茶原料、内包膜，车间生产的半成品、成品，研发样品,采购样品，稳定性试验的样品、定期跟踪检测的样品）。 4.1.2。2与质保员沟通，确定检样品种、数量（如自来水、纯水、一楼生产过程跟踪的各阶段液体)。 4.1。2。3 按检测计划自行确定的检样品种、数量(如工作间空气、设备内表面、员工手部)。 4.1。2.4各项确定后,收集并登记样品。 4。1.3检测方法的确定 4.1.3。1样品收集后进行分类，确定样品的检测方法，若无方法的要尽快上报或查找相关方法。 4.1。3.2微生物各项目所采用的检测方法（见附表1）
4.2 试剂配制、物品包扎 4。2。1玻璃容器的包扎：灭菌前器皿应包扎紧密完整后才进行灭菌,以防止灭菌后器皿受到污染。 4。2。2平皿、吸管按量分成若干单元用牛皮纸、报纸包扎； 4.2.3试管及三角瓶应塞硅胶塞，在瓶口再用报纸包扎； 4.2.4其它玻璃或金属取样工具也要用报纸包扎; 4。2。5生理盐水按氯化钠加水比例0.84％配制；平板计数琼脂（PCA）、孟加拉红、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）则以标签上规定的比例进行配制。按需要量分装成于不同规格的容器中。 4。3 高压灭菌 4。3。1培养基及器皿的灭菌： 4.3.1.1高压蒸汽灭菌：金属器具、玻璃器皿、基础培养基及其它耐热物品均放入锅内灭菌。 4。3。1.2灭菌参数：121℃（0。1034MPa)，15～20min; 4.3.2染菌培养物：121℃（0.1034MPa),30min； 4.3.3含糖类不耐热培养基（按试剂要求)：115℃（0。0727MPa),15~20min. 4。3。4每次灭菌时均须将灭菌指示带置于灭菌锅内，观察灭菌效果。 4。3.5灭菌锅的使用：参照“仪器使用维护保养作业指导书”的相关内容执行。 4。4 烘干 高压蒸汽灭菌后的物品除培养基及稀释液外的其他物品，如玻璃平皿吸管、金属器具或棉花等均应先置于105℃烘箱内，根据包装大小应保持1h以上，至干燥后使用。 4.5贮存 4。5。1灭菌后处理:灭菌后物品,注意放置场所，严禁与未灭菌物品混放,以
微生物检验作业作业指导书.
微生物检验作业作业指导书.1000字 微生物检验作业作业指导书 一、作业目的 通过学生的自主调研，了解微生物检验的基本概念、方法、流程及 其应用领域，在此基础上，学习相关实验技能，并在实践中提高学 生的实验操作能力。 二、作业要求 1.选择一个与微生物检验相关的主题进行调研（如细菌检验、真菌 检验、病毒检验等），深入了解其基本特征、检验方法、检验流程 及其应用领域。 2.结合所学相关知识，了解微生物检验实验室的基本设备和实验条件，掌握相应的消毒、无菌操作和物品清洗等实验技能。 3.利用自己的调研和实验经验，撰写完成一份微生物检验实验报告。 三、作业步骤 1.主题选择。选择一个与微生物检验相关的主题或者问题，如“医 院细菌检验方法研究”、“河水中大肠杆菌检测技术分析”等。需 要注重主题的实际可行性，避免选择过于宏大或难以完成的主题。 2.调研文献。利用图书馆、网络等资源，收集与选定主题相关的文 献资料，包括学术期刊论文、专业书籍、技术资料等。建议访问一 些专业网站，如中国微生物学会、中国食品科学技术学会等网站， 获取最新的学术信息。 3.实验学习。根据选定的主题和文献资料，了解相关的实验方法和 流程，并在实验室中学习相关的实验技能。了解实验室的基本设备 和实验条件，掌握相应的消毒、无菌操作和物品清洗等实验技能。 需要注意实验过程中的安全问题，确保实验过程的有效性和安全性。 4.撰写实验报告。根据实验结果，撰写一份完整的实验报告。报告 内容应包括所选主题的研究背景、研究目的、实验方法和流程、实 验结果和分析、结论和建议等。需要注意报告的逻辑性和系统性，
确保表述准确、规范、清晰。报告中需要注重科学方法和实验数据 的稳定性和可重复性。 四、注意事项 1.作业选题要求实际可行性和可完成性，避免选择过于宏大或难以 完成的主题。 2.调研过程中要注意文献来源的可靠性和权威性，并及时更新最新 的学术信息。 3.实验过程中要注意安全问题，严格遵守各项实验操作规程和安全 操作程序。 4.撰写报告时要注意逻辑性、系统性和准确性，避免主观臆断或数 据错误等误导读者。 5.最后，要遵守学术道德和规范，确保实验过程的有效性和可靠性，认真完成本次作业。
《微生物学及实验》实验指导书
《微生物学及实验》实验指导书 第一部分 实验目的 《微生物学及实验》实验课是我院情况科学专业学生必修的一门重要的底子实验课，是学生进入我院实验室的第一门实验课。 《微生物学及实验》实验的目的是使学生掌握微生物学的根本实验要领和技能，正确的使用实验的仪器设备，在学生头脑中创建无菌观点和掌握无菌操纵技能是最重要的内容，是学生进行后续课实验和研究的底子。在目前的实验室条件和有限学时的情况下，得到微生物实验技能的根本操纵和技能训练，培养学生动手操纵能力和创新能力。通过微生物学实验课讲授，加深理解和牢固课堂所学的知识，熟悉微生物学实验的根本操纵技能，了解微生物实验的底子知识。通过微生物学实验培养学生视察、思考、阐发问题、解决问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度、创新精神、创新思维和创新能力。 本实验指导书主要内容包罗：微生物个别和菌落形态视察、染色要领、培养基制备和灭菌、无菌操纵、微生物检测和疏散、生理生化反响、影响微生物生长的因素和污染物微生物降解实验，水中微生物漫衍视察等内容。同时也注意和情况微生物学的联系与区别。 整个实验课中贯串了显微镜使用—灭菌要领—无菌操纵—微生物菌种疏散筛选判定、选育—微生物代谢作用这一主线。微生物学需掌握的根本操纵在实验中得到训练，同时加深了学生对所学微生物学根本观点的理解。实验设计贴近生活，可以大大提高同学们学习微生物学的兴趣。实验内容与目录如下： 序 号 实验名称 学时 实验类型 实验一 光学显微镜的使用及活性污泥中生物相的视察 3 底子验证实验 实验二 微生物的染色及视察 3 实验三 培养基的制备和灭菌 3 实验四 纯种微生物的疏散、转种和培养 3 实验五 有机污染物质的生物降解实验* 4 综合性实验 实验六 双歧杆菌口服液的发酵制备* 4 *注：实验六为选做实验。