如何控制快速变化的蓝耳病毒

如何控制持续变化的蓝耳病病毒(PRRSV)
汉斯.诺文克 Hans Nauwynck
比利时根特大学
兽医学院病毒学研究室
80年代后期，欧洲和美加地区猪场出现一种“ 新”病毒 ?造成繁殖障碍 ?与猪呼吸道疾病综合征(PRDC)有关 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) -> 起源?
1961 1989
欧洲基因型 1s2 1s3
2 美洲基因型
80年代末期 使用迷你猪进行研究/宠物 Banna/Wuzhishan
1s1
这么多年之后 ->尽管使用疫苗控制， PRRSV仍造成养猪业极大的困扰与威胁
1

控制 PRRS 相关疾病? 可行方案 1. 2. 3. 4. 使用疫苗 阻断病毒传播 控制并发感染 清群/建群
控制 PRRS 相关疾病? 可行方案 1. 2. 3. 4. 使用疫苗 阻断病毒传播 控制并发感染 清群/建群
2

是否能成功的应用疫苗来对抗病毒性病原? 完全取决于 1. 2. 3. 4. 病毒 致病机制 免疫力 免疫逃逸
~ PRRSV
PRRSV１．病毒
? 分类
套式病毒目 (Order Nidovirales) 动脉炎病毒科 (Family Arteriviridae)
美洲基因型/欧洲基因型 –亚型 I/II/III 每个基因型/亚型 皆具有「高基因变异特性」 持续漂移 病原性的演化-> 适应/合并
?病毒体结构
E GP2 GP3 GP4 GP5 M N Genomic RNA
->封套蛋白很重要
3

PRRSV ORF7 高度变异性 随着时间而增加
PRRSV 2.致病机制
靶细胞: 已分化的巨噬细胞亚群
淋巴结 淋巴结 肺脏 淋巴结
自由病毒体 病毒血症
巨噬细胞 大量流失并失去功能
肺脏 脾脏 淋巴结
持续排毒
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
再活化
感染后(周)
4

感染PRRSV的细胞及邻近 细胞出现细胞凋零现象
肺脏
间质性肺炎
感染PRRSV后5天
肺脏
5

Young monocytes
Sia+ m?
Overlay
感染后 0天
感染后 9天
lungs
感染后 30天
Young monocytes
Sia+ m?
Overlay
感染后 0天
感染后 9天
lungs
感染后 30天
+其他呼吸道病原/毒素
? 其它病毒 (PCV2, SIV, PRCV, ADV) ? 细菌 (Mycoplasma, Streptococcus, Bordetella, Salmonella)
? 脂多糖（LPS）
6

PRRSV 2.致病机制
靶细胞: 已分化的巨噬细胞亚群
淋巴结
高病原性 (美国,亚洲,白俄罗斯)
淋巴结 肺脏 自由病毒体 病毒血症
淋巴结
巨噬细胞 大量流失并失去功能
肺脏 脾脏 淋巴结
持续排毒
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
再活化
感染后(周)
Quantification - Explants PRRSV感染之细胞量
1337 猪1
80
1338 猪 2
80
Positive cells/mm2 2 阳性细胞/mm
Positive cells/mm2 2 阳性细胞/mm
LV Lena
LV Lena
60
60
40
40
20
20
0 0 24 48 72
0 0 24 48 72
hpi
hpi
1339 猪 3
80
2
LV Lena
60
鼻腔黏膜
22 阳性细胞/mm Positive cells/mm
Total 平均
80
LV Lena
60
阳性细胞/mm Positive cells/mm2
40
40
20
20
0 0 24 48 72
0 0 24 48 72
hpi
hpi
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PRRSV感染之细胞量 LV
细胞核 PRRSV
Lena
细胞核 PRRSV
I-I (LV,Belgium) 临床症状 ?发烧 ?综合症状 病毒在上呼吸道进行复制 (->空气传播) 病毒血症 淋巴结 经由 Sia/CD163进入 经由其它路径进入 + + + ++ -
I-III (Lena) +++ +++ +++ +++ ++++ ++ ++ +++
II (Am) ++ ++ ++ ++ ++ + ++ -
II (HFV) +++ +++ +++ +++ ++++ ++ ? ?
->新的靶细胞 ? ->新的进入机制 ? ->新的接受体 ？
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PRRSV –2. 致病机制 病毒进入胚胎
自由病毒体
病毒于子宫内膜 增殖?
PRRSV –2. 致病机制 病毒进入胚胎
自由病毒体
病毒于子宫内膜 增殖?
9

PRRSV – 2. 致病机制 < 80天
自由病毒体
病毒不会在子宫 内膜/胎盘进行 增殖
PRRSV – 2. 致病机制 > 80天
自由病毒体
病毒在子宫内 膜/胎盘进行 增殖
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♀胎儿-肺脏
♂胎儿-肝脏
经胎盘细胞传播 ->感染胎儿
Cell-free virus
剥离＆坏死 胎盘功能异常
?
Cell-free virus
Replication in endometrium/ placenta
-> neutralize virus in the blood
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PRRSV – 3. 免疫力
淋巴结 淋巴结 肺脏 自由病毒体 病毒血症 淋巴结
目标:已分化巨噬细胞亚群
肺脏,脾脏 淋巴结
CD8+不会杀死带有 PRRSV的巨噬细胞 自然杀伤（NK）细 胞活性受损
IFN?
迟发的中和抗体
Cell X
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
感染后(周数)
目前市面上合法登记的疫苗
?减毒活苗 -当疫苗与野毒的基因型相近，则可达到良好免疫效果 -中和抗体的产生较缓慢且受限制 -刺激cell X? -安全问题 ?毒力返强 ?经胎盘传播 ?存在精液中 ?猪群间的传播 - problems with boosting existing immunity - low antigenic mass ?灭活苗 -安全 -对阴性猪效果不佳(不会诱发中和抗体) -boosting existing immunity, when related to circulating virus, but relatively low antigenic mass
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新一代疫苗
安全，有效，适应性强 灭活/亚单位/载体/减毒疫苗
~以研究为基础所开发
->诱导中和抗体生成 ?可辨识病毒进入(贴附/内化/分解作用)靶细胞 的重要蛋白质(+片段) ~诱导中和抗体生成 ?具保护性免疫力的分子剖析 ~抗体-辨识位 ?中和? ->诱发/活化 cell X ? ->毒力的不活化/免疫抑制因子 ?毒力因子的监定(复制能力、免疫逃逸) ?免疫抑制因子的监定
新一代疫苗
安全，有效，适应性强 灭活/亚单位/载体/减毒疫苗
~以研究为基础所开发
->诱导中和抗体生成 ?可辨识病毒进入(贴附/内化/分解作用)靶细胞 的重要蛋白质(+片段) ~诱导中和抗体生成 ?具保护性免疫力的分子剖析 ~抗体-辨识位 ?中和? ->诱发/活化 cell X ? ->毒力的不活化/免疫抑制因子 ?毒力因子的监定(复制能力、免疫逃逸) ?免疫抑制因子的监定
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PRRSV如何进入巨噬细胞? 1.贴附作用 ?贴附于肝黏醣硫酸盐(heparan sulphate) ->MGP5 ?贴附于涎酸粘附素(sialoadhesin，R116) ->MGP5 (涎酸) 2.内化作用 ?经涎酸粘附素(clathrin/dynein) ->MGP5 (涎酸) 3.分解作用 ?藉由pH值下降&蛋白酶 (CatE&SP) ?藉由 CD163 ->EGP2GP3GP4
新一代灭活苗 (I)
?在PRRSV灭活过程中（Q-control），保留贴附/内化/分解作 用片段 ->以巨噬细胞 或 PK15Sia+CD163+进行确认
BEI
% internalized PRRSV particles
150 100 50 0
0
6
12
24
48
72
Time (hours)
14

佐剂
佐剂
=PRRSVBeEsc 4周
4周
PRRSVBeEscIn PRRSVBeEscIn
4周
(梅里亚) Progressis?
4周
(梅里亚) Progressis?
4周
(MSD) Porcilis? PRRS
4周
血中 病毒滴度
6周
(勃林格殷格翰)Ingelvac? PRRS
6周
病毒血症
对照组
病毒滴度(log10TCID50/mL)
攻毒后天数
15

病毒血症
PRRSVBeEscInA
病毒滴度(log10TCID50/mL)
(梅里亚) Progressis?
NAb+
病毒滴度(log10TCID50/mL)
攻毒后天数
NAb-
攻毒后天数
(MSD) Porcilis? PRRS
病毒滴度(log10TCID50/mL) 病毒滴度(log10TCID50/mL)
(勃林格殷格翰) Ingelvac? PRRS
NAb-
攻毒后天数
NAb-
攻毒后天数
新一代灭活苗 (II)
?灭活的程序可适应其他病毒株 ?完全保留PRRSV进入PK15Sia+CD163+上的相对应结合位 -> 良好的保护力 -> 仅需少量病毒来生产疫苗
PRRSVBeEscInB MARC
病毒滴度(log10TCID50/mL) 病毒滴度(log10TCID50/mL)
PRRSVBeEscInB PK15Sia+CD163+
免疫后天数
免疫后天数
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新一代灭活苗 (III)
?减少胎盘、胎儿出现病变
已免疫的后备母猪 (3头母猪;37个胎儿) 未免疫的后备母猪 (3头母猪;40个胎儿)
+++ +++ ++ ++ ++ + ++ ++ +++
19%
++ + + ++ +++ +++ ++
45%
++
+++
新一代灭活苗(IV)
?补强注射可大幅提升母猪的免疫力
1024 256
中和抗体滴度(log2)
对照组 灭活苗07V063 (MSD) Porcilis? PRRS (勃林格殷格翰) Ingelvac? PRRS (梅里亚) Progressis?
64 16 4 0 免疫后天数
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新一代灭活苗 (V)
?补强注射可大幅提升母猪的免疫力，并透过被动免疫来保护仔猪
母猪 中和抗体滴度
64 32 16 8 4 2
灭活苗 (MSD) Porcilis
仔猪 中和抗体滴度
64 32 16 8 4 2
灭活苗
V
60 天 74 天 0 天
Mock
35 天
(MSD) Porcilis
Mock
3周 5周 7周 9周
新一代灭活苗 (V)
?补强注射可大幅提升母猪的免疫力，并透过被动免疫来保护仔猪
出现病毒血症的仔猪头数 number of viremic piglets
仔猪 # piglets 母猪1 Sow 1 4 母猪2 Sow 2 4 母猪3 Sow 3 4 母猪4 Sow 4 4 Sow 5 3 母猪5 Sow 6 3 母猪6 Sow 7 4 母猪7 Sow 8 4 母猪8 Sow 9 3 母猪9 Sow 10 4 母猪10
AUTO VACCINE 仔猪 3W 5W 7W 9W # piglets 0 0 0 0 3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 4 0 0 0 1 3 0 0 0 0 4 0 0 0 1 4 0 0 1 2 4 0 0 0 2 3 0 0 1 1 4 0 0 0 0 4
? (MSD) PORCILIS? PRRS PORCILIS PRRS
3W 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5W 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
7W 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
仔猪 9W # piglets 1 4 0 2 0 1 4 1 4 0 3 0 4 0 4 2 4 3 4
3W 0 0 0 0 0 2 0 0 0
对照组 CONTROL 5W 7W 0 3 0 0
9W 3 0 3 1 2 3 3 3 3
0 0 0 0 0 1 0
3 0 1 2 2 2 0
->我们已有一支适应力强的PRRSV灭活苗!
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新一代疫苗
安全，有效，适应性强 灭活/亚单位/载体/减毒疫苗
~以研究为基础所开发
->诱导中和抗体生成 ?可辨识病毒进入(贴附/内化/分解作用)靶细胞 的重要蛋白质(+片段) ~诱导中和抗体生成 ?具保护性免疫力的分子剖析 ~抗体-辨识位 ?中和? ->诱发/活化 cell X ? ->毒力的不活化/免疫抑制因子 ?毒力因子的监定(复制能力、免疫逃逸) ?免疫抑制因子的监定
GP2
N
?5个线状抗原决定位 (1-2/17) ->2个中和抗体决定位
…
MQWGHCGVKSASCSWTPSLSSLLVWLILPFSLPYCLGSPSQDGYWSFFSEWFAPRFSVRALPFTLPNYRRSYEGLLPNCPDVPQFAVKHPLGMFWHMRV
信号肽
表面区…
… SHLIDEMVSRRIYQTMEHSGQAAWKQVVGEATLTKLSGLDIVTHFQHLAAVEADSCRFLSSRLVMLKNLAVGNVSLQYNTTLDRVELIFPTPGTRPKLTD … …表面区
… FRQWLISVHASIFSSVASSVTLFIVLWLRIPALRYVFGFHWPTATHHSS C 穿膜螺旋 核心区
19

E
0个线状抗原决定位
N
MGSLWSKISQLFVDAFTEFLVSVVDIAIFLAILFGFTVAGWLLVFLLRVVCSALLRSRSAIHSPELSKVL
C
表面区
穿膜螺旋
核心区
GP3
?8个线状抗原决定位(1-13/17) ->2个中和抗体决定位
N
MAHQCARFHFFLCGFICYLVHSALASNSSSTLCFWFPLAHGNTSFELTINYTICMPCSTSQAARQRLEPGRNMWCKIGHDRCEERDHDELLMSIPSGYDNL
…
信号肽 ? 穿膜螺旋?
表面区…
… KLEGYYAWLAFLSFSYAAQFHPELFGIGNVSRVFVDKRHQFICAEHDGHNSTVSTGHNISALYAAYYHHQIDGGNWFHLEWLRPLFSSWLVLNISWFLRRS … …表面区 穿膜螺旋
?? … PVSPVSRRIYQILRPTRPRLPVSWSFRTSIVSDLTGSQQRKRKFPSESRPNVVKPSVLPSTSR C 核心区
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