5、转录调控

分子机制研究套路（五）

转录调控

课题：转录因子A对B基因的转录调控

1．概念介绍：

转录水平的调控是真核生物基因表达调控中重要环节。真核细胞RNA 聚合酶自身对启动子并无特殊亲和力，单独不能进行转录，也就是说基因是无活性的。因此，转录需要众多的转录因子和辅助转录因子形成复杂的转录装置。在基因转录起始阶段，通用转录因子协助RNA 聚合酶与启动子结合，但其作用很弱，不能高效率地启动转录。只有在反式作用因子(基因特异性转录因子）的协助下，RNA 聚合酶Ⅱ和TFⅡ才能有效地形成转录起始复合物。反式作用因子（trans acting factor）在转录调节中具有特殊的重要性。它是能直接或间接地识别或结合在顺式作用元件8～12bp 核心序列上，参与调控靶基因转录效率的一组蛋白质。这类DNA 结合蛋白有多种，能特异性识别这类蛋白的序列也有多种，正是不同的DNA 结合蛋白与不同的识别序列之间的空间结构上的相互作用，以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用构成了复杂的基因转录调控机制的基础。

在真核生物中转录因子的调控是最重要，也是研究得最多的。蛋白质相互作用在转录因子活性的调控方面具有重要的意义。细胞内的反式作用因子都是处于有活性和无活性两种状态，这两种状态是可以转换的。反式作用因子处于无活性状态时，与之相应的基因就不能表达；反式作用因子处于有活性状态、并与相应的顺式作用元件结合时，就可以促进RNA 聚合酶和通用转录因子与相应的启动子结合，形成转录起始复合物。所以，真核基因的表达调控主要是调节反式作用因子的活性，随后反式作用因子调控基因的转录起始。

转录因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子，对基因转录发挥调控作用。大部分转录因子在激活以后与顺式作用元件结合，但也可能有一些转录因子是先结合DNA，

被激活后才发挥调节功能。增强子和上游启动子元件可以结合一些相同的蛋白质，在不同的基因中，存在着同样的顺式作用元件，这表明一些数量有限的基因调控蛋白控制着真核细胞的基因表达。

每一种转录因子结合顺式作用元件后虽然可以发挥促进或抑制作用，但是转录因子对基因表达的调控不是由单一的因子完成的，而是几种因子组合，发挥特定的作用。通常是几种不同的转录因子控制一个基因的表达，一种转录因子也可以参与调控不同的基因表达调控。转录因子的数量是有限的，转录因子的组合作用方式使有限的转录因子可以调控不同的基因表达。2．研究思路：

2.1确定基因B启动子转录核心区域 (3)

2.1.1 扩增基因B上游启动子区 (3)

2.1.2酶切PCR 产物和pGL3-Basic 质粒 (3)

2.1.3 构建pGL3-Basic-基因BP(-1761/+37)质粒P（promoter） (3)

2.1.4不同长度的基因B启动子区的荧光素酶报告基因质粒的构建 (3)

2.1.5双荧光素酶报告系统确定基因B启动子区核心区域 (3)

2.2转录因子A 对基因B的转录调控作用 (5)

2.2.1构建转录因子A真核表达载体 (5)

2.2.2转录因子A 上调基因B的转录表达 (5)

2.2.2.1体外证实转录因子A 结合基因B启动子 (5)

2.2.2.2体内证实转录因子A 结合基因B启动子 (5)

2.2.2.3突变转录因子A 结合位点显著下调基因B转录活性 (6)

2.3转录因子A 对基因B转录激活作用 (6)

2.4转录因子A 参与基因B转录调控 (6)

2.1确定基因B启动子转录核心区域

2.1.1 扩增基因B上游启动子区

以基因B的转录起始位点为+1，扩增基因B启动子区（-1796bp 到+37bp），电泳结果显示条带特异，大小符合预期设计。接着用DNA回收试剂盒回收PCR所得扩增片段，用内部短引物鉴定PCR结果，电泳图显示这两对引物均扩增出位置正确的条带，＿bp和＿bp，提示扩增的1.8kbp的片段确实为基因B启动子。用DNA回收试剂盒回收PCR产物得基因B 启动子(-1796bp 到+37bp)扩增片段。

2.1.2酶切PCR 产物和pGL3-Basic 质粒

因在基因B启动子扩增的引物的两端插入了Nhe I和Hind III酶切位点，故用Nhe I和Hind III 限制性酶酶切后与pGL3-promoter载体上的Nhe I和Hind III粘性末端位点相连。

2.1.3 构建pGL3-Basic-基因BP(-1761/+37)质粒P（promoter）

将酶切的PCR产物连入pGL3-Basic质粒，经转化细菌后，挑取单克隆，用基因B启动子内部引物鉴定，挑取鉴定正确的克隆1、2、3、4、5 送测序。用V ector NTI 10.0（Invitrogen）软件对测序结果进行多序列比对。留取测序正确的菌株冻入-80℃保存。

2.1.4不同长度的基因B启动子区的荧光素酶报告基因质粒的构建

用构建好的pGL3-Basic-基因BP (-1761/+37)为模板扩增不同长度的片段，按上述的

步骤连入pGL3-Basic质粒，测序鉴定正确，-80℃保存。

2.1.5双荧光素酶报告系统确定基因B启动子区核心区域

我们将成功构建的基因B启动子区的荧光素酶报告基因质粒共同转染HEK-293细胞，并同时转入pRL-TK载体作为内对照。48 小时后进行荧光素酶报告基因分析。如图所示：-1761、-1273、-1018、-644、-338、-217 六个不同长度的片段都能够启动基因B的转录，而-217 片段基本丧失转录活性，提示基因B的转录核心区域就位于这段序列中。运用TRANSFAC转

录因子预测网站我们发现在这250bp区域内含有4个转录因子A的结合位点。那么具体是哪个位点对基因B的转录起到关键的调控作用，然后我们又将这250bp的序列截成三部分，检测其荧光报告强度。结果显示当将-108到-42这段序列截掉后，基因B的转录活性基本丧失，这说明基因B的转录核心区域就位于在基因B启动子-108到-42内。这段区域决定了基因B约70%的转录活性。上述实验结果提示，转录因子A可能通过-108到-42kb这60bp 之间序列激活基因B的启动子区转录活性。

注释：如上是寻找转录因子与基因结合位点的套路方案，通过截短不同区域寻找到活性关键区域。

2.2转录因子A对基因B的转录调控作用

2.2.1构建转录因子A真核表达载体

将编码转录因子A的基因序列连入真核表达载体pcDNA3.1(+)后经酶切鉴定，出现了＿bp 目的条带，结果与前期设计相符，证明在真核表达载体中插入了相应的转录因子A蛋白编码序列，命名为pcDNA3.1-转录因子A。

2.2.2转录因子A上调基因B的转录表达

2.2.2.1体外证实转录因子A 结合基因B启动子

为了证明转录因子A可以结合到基因B启动子区的转录因子A 结合位点，我们合成生物素标记的转录因子A 结合位点的寡核苷酸探针，提取cell-1细胞的核蛋白，体外进行了EMSA 实验。结果显示，加入核蛋白后可见明显的迁移条带，说明生物素探针可以和核蛋白结合，这种结合复合物可以被100 倍未标记的探针所竞争而明显减弱。同时我们也合成了突变转录因子A 结合位点的生物素标记探针，突变探针将不会结合核蛋白，说明迁移条带确实是转录因子A和探针所形成的。为了进一步证实转录因子A的结合，超迁移实验显示加入转录因子A特异性抗体后，出现明显的超迁移带，但是加入无关抗体并不出现此条带。EMSA 实验证明转录因子A可以特异地结合到基因B启动子的转录因子A结合位点。

2.2.2.2体内证实转录因子A 结合基因B启动子

染色质免疫共沉淀（ChIP）检测的是活细胞状态下转录因子和顺式作用元件的结合情况，近几年来，该技术被广泛用于基因转录调控的研究。用ChIP 的方法检测了基因B高表达的cell-1细胞和基因B低表达的cell-2细胞中转录因子A的结合情况。用转录因子A抗体沉淀交联复合体，然后经RT-PCR检测转录因子A在基因B启动子上的结合序列。结果显示，加入转录因子A抗体后可以特异地沉淀基因组DNA，通过PCR反应可以特异性扩增出基因B启动子上的目的片段，而加入IgG 的阴性对照未扩增出相应条带。ChIP 实验结果

在体内证实了转录因子A与基因B启动子区的结合。同时我们也发现在基因B高表达的cell-1细胞中转录因子A结合到基因B启动子的量明显高于基因B低表达的cell-2细胞。这也从另一个方面说明转录因子A结合到基因B启动子区，而且基因B的表达量越高其结合转录因子A的量也越高，转录因子A对基因B的表达调控可能起着上调的作用。

2.2.2.3突变转录因子A 结合位点显著下调基因B转录活性

为进一步验证转录因子A通过结合基因B启动子上-108到-42之间的转录因子A结合位点而激活基因B的转录表达，我们构建了转录因子A结合位点突变的基因B启动子荧光报告载体，同时转入pRL-TK载体作为内对照。转染48小时后进行荧光素酶报告基因分析。结果显示，转录因子A结合位点突变的基因B启动子荧光报告载体的转录活性与对照相比显著下降，这部分结果提示，转录因子A通过结合位于基因B启动子上-108至-42之间的转录因子A结合位点，进而激活基因B的转录表达。

2.3转录因子A对基因B转录激活作用

将野生型的pGL3-基因BP(-108/+37) 与转录因子A真核表达载体共转染，结果显示随着转录因子A质粒用量的增加，基因B启动子区的活性逐渐增强，呈现剂量依赖性。上述结果说明转录因子A可以结合到基因B启动子区并对其转录调控起着上调作用。

2.4转录因子A参与基因B转录调控

为了进一步说明转录因子A在基因B转录调控中的生物学作用，我们运用RNAi技术在基因B高表达的cell-1细胞中下调转录因子A的表达，然后观察基因B的变化；反之在基因B低表达的cell-2细胞中通过瞬时转染转录因子A 真核表达载体过表达转录因子A，然后观察基因B的变化。通过RT-PCR和Western blot 的分析，我们发现转入RNA干扰片段后转录因子A 的mRNA和蛋白表达明显下降，同时基因B的mRNA和蛋白表达水平明显被封闭。反之，过表达转录因子A 可以显著地升高基因B的表达水平。上述结果说明转录

因子A参与基因B的转录调控，并且起着重要的作用。

3．应用案例：

1. Kong LM, Liao CG, Fei F, Guo X, Xing JL, Chen ZN: Transcription factor Sp1 regulates

expression of cancer-associated molecule CD147 in human lung cancer. Cancer science 2010, 101(6):1463-1470.

植物转录因子及转录调控数据与分析平台

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转录和转录水平的调控要点

SECTION 5 转录和转录水平的调控 重点： 转录的反应体系，原核生物RNA聚合酶和真核生物中的RNA聚合酶的特点，RNA的转录过程大体可分为起始、延长、终止三个阶段。真核RNA的转录后加工，包括各种RNA前体的加工过程。基因表达调控的基本概念、特点、基本原理。乳糖操纵子的结构、负性调控、正性调控、协调调节、转录衰减、SOS 反应。 难点： 转录模板的不对称性极其命名，原核生物及真核生物的转录起始，真核生物的转录终止，mRNA前体的剪接机制（套索的形成及剪接），第Ⅰ、Ⅱ类和第Ⅳ类内含子的剪接过程，四膜虫rRNA前体的加工，核酶的作用机理。真核基因及基因表达调控的特点、顺式作用元件和反式作用因子的概念、种类和特点. 以及它们在转录激活中的作用。 一．模板和酶： 要点 1．模板 RNA的转录合成需要DNA做模板，DNA双链中只有一股链起模板作用，指导RNA合成的一股DNA链称为模板链（template strand），与之相对的另一股链为编码链（coding strand），不对称转录有两方面含义:一是DNA链上只有部分的区段作为转录模板(有意义链或模板链),二是模板链并非自始至终位于同一股DNA单链上。 2．RNA聚合酶 转录需要RNA聚合酶。原核生物的RNA聚合酶由多个亚基组成:α2ββ'称为核心酶,转录延长只需核心酶即可。α2ββ'σ称为全酶,转录起始前需要σ亚基辨认起始点,所以全酶是转录起始必需的。真核生物RNA聚合酶有RNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种,分别转录45s-rRNA; mRNA(其前体是hnRNA);以及5s-rRNA、snRNA和tRNA。 3.模板与酶的辨认结合 转录模板上有被RNA聚合酶辨认和结合的位点。在转录起始之前被RNA聚合酶结合的DNA部位称为启动子。典型的原核生物启动子序列是-35区的TTGACA序列和-10区的Pribnow盒即TATAAT序列。真核生物的转录上游调控序列统称为顺式作用元件,主要有TATA盒、、CG盒、上游活化序列(酵母细胞)、增强子等等。和顺式作用元件结合的蛋白质都有调控转录的作用,统称为反式作用因子。反式作用因子已发现数百种,能够归类的称为转录因子(TF),相应于RNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ的是TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ。TFⅡ又有A、B、C、D、E、F多种及其亚类。 基本概念： 1.不对称转录: 两重含义,一是指双链DNA只有一股单链用作转录模板(模板链);二是对不同基因同一单链上某些区段作为模板链而另一些区段作为编码链，即模板链并非永远在同一单链上。 2.编码链: DNA双链上不用作转录模板的那一段单链,因其碱基序列除由T代 替U而外,其他与转录产物mRNA序列相同而得名。

转录及其调控作业习题

第三章 转录及其调控 测试题 一 . 单项选择题 1．对于大肠杆菌 RNA 聚合酶的叙述，不正确的是（ ） A ．由核心酶和 σ 因子构成 B ．核心酶由 α 2ββ′组成 C ．全酶与核心酶的差别在于 β 亚单位的存在 D ．全酶包括 σ 因子 E ． σ 因子仅与转录起动有关 2．真核生物 RNA 聚合酶Ⅱ对 α -- 鹅膏蕈碱的反应为（ ） A ．不敏感 B ．中度敏感 C ．高度敏感 D ．低度敏感 E ．不确定 3. DNA 双链中，指导合成 RNA 的那条链称作（ ） A ．模板链 B ．冈崎链 C ．编码链 D ．非编码链 E ．以上都不对 4. 关于转录和复制的区别，说法正确的是（ ） A. DNA 双链均复制和转录 B. 复制的原料是一磷酸脱氧核苷，转录的原料是一磷酸核苷 C. 复制酶是依赖 DNA 的 DNA 聚合酶，转录酶是依赖 RNA 的 DNA 聚合酶 D. 复制需要引物，转录不需要引物 E. 均遵守碱基配对规律，模板中 A 对应的产物是 T 5. ρ- 因子的功能是（ ） A ．结合阻遏物于启动区域处 B ．增加 RNA 合成速率 C ．释放结合在启动子上的 RNA 聚合酶 D ．参与转录的终止过程 E ．允许特定转录的启动过程 6. 下列关于启动子的描绘哪一项是正确的 ? （ ） A ． mRNA 开始被翻译的那段 DNA 顺序 B ．开始转录生成 mRNA 的那段 DNA 顺序 C ． RNA 聚合酶最初与 DNA 结合的那段 DNA 顺序 D ．阻抑蛋白结合的 DNA 部位 E ．调节基因结合的部位 ） B ．核酸酶 C ． RNA 指导的 RNA 聚合酶Ⅱ E ． RNA 指导的 DNA 聚合酶 9. 下列关于 rRNA 的叙述错误的是（ ） A ．原核 rRNA 由 RNA 聚合酶催化合成 B ．真核生物部分 rRNA 由 RNA 聚合酶Ⅲ转录合成 7. 真核细胞中经 RNA 聚合酶 I 催化转录的产物是（ A ． hnRNA B tRNA C ．5S rRNA D ．U4,U5snRNA E ． 5.8S,18S,28SrRNA 前体 8. 转录过程中需要的酶 是（ A ． DNA 指导的 DNA 聚合酶

酿酒酵母中的转录调控网络

酿酒酵母中的转录调控网络 小组成员： 生信1301 唐聪，包健宇，杨帆

摘要：我们已经确定转录因子如何在真核生物酿酒酵母中编码通 过活细胞中的整个基因组基因。正如代谢网络图描述，可以由一个细胞来完成代谢过程的潜在途径，这网络调节基因的相互作用描述了酵母细胞可以通过潜在途径调节全局基因表达程序。我们使用此信息来确定网络结构，最简单的网络结构单元，并且展示了一个可使用基序的转录调控网络的结构组装的自动过程。我们的研究结果表明，真核细胞的功能高度相关联的通过可调节其他转录元件的转录调控元件网络。

实验设计： 第一步：标记并筛选 用全基因组定位分析来研究酵母转录调控因子如何在基因组中绑 定到启动子序列。选定酵母蛋白质组数据库中的且反映出与DNA 结合并拥有转录活性的所有141转录因子用以研究。 方法：酵母转录调节器通过引入了原癌基因的表位标签的编码序列被标记，然后 进入每个调节器正常的基因组位点。以这种方式构建106株酵母菌株，其表达可以在合 适的生长条件进行检测。对106株的进行Chip（染色体免疫共沉淀）。通过ChiP程序富 集的启动子区通过与含有全基因组组酵母启动子区域的芯片杂交被鉴定。

为什么只有106株呢？ ?通过聚合酶链反应和免疫印迹分析证实标记的适当插入和标记蛋白的表达。但标记的导入可能会影响某些转录调节的功能。在141转录因子其中有17个，尽管尝试标记每个调节器三次，也无法获得可行的标记细胞。在酵母细胞在 培养基中生长时，在可检测水平上检测，不是所有的转录调节器都按预期可 检测出表达，通过免疫印迹分析表明，124株标记的调节蛋白只有106株可检 测出。

四、 原核生物种的转录后调控

四、原核生物种的转录后调控 1．稀有密码子对翻译的影响 已知dnaG和rpoD（编码RNA聚合酶亚基）及rpsU（30S核糖体上的S21б蛋白）属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子，而这3个基因产物在数量上却大不相同，每个细胞内仅有dnaG产物50拷贝，而rpoD为2800拷贝，rpsU则高达40 000拷贝之多。细胞通过翻译调控，解决了这个问题。 研究dnaG序列发现其中含有不少稀有密码子，也就是说这些密码子在其他基因中利用频率很低，而在dnaG中却很高。 许多调控蛋白如LacI、AraC、TrpR等在细胞内含量也很低，编码这些蛋白的基因中密码子的使用频率和dnaG相似，而明显不同于非调节蛋白。高频率使用这些密码子的基因翻译过程极容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。 2. 重叠基因对翻译的影响 重叠基因最早在大肠杆菌噬菌体ΦX174中发现，用不同的阅读方式得到不同的蛋白质，丝状RNA噬菌体、线粒体DNA和细菌染色体上都有重叠基因存在。 Trp操纵子由5个基因（trpE、D、C、B、A）组成，在正常情况下，操纵子中5个基因产物是等量的，但trpE突变后，其邻近的trpD产量比下游的trpBA产量要低得多。这种与ρ蛋白无关的表达调控，已被证实是在翻译水平上的调控。研究trpE和trpD以及trpB和trpA两对基因中核苷酸序列与翻译耦联的关系，发现trpE基因的终止密码子和trpD基因的起始密码子共用一个核苷酸。

由于trpE的终止密码子与trpD的起始密码重叠，trpE翻译终止时核糖体立即处在起始环境中，这种重叠的密码保证了同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制。 3. RNA高级结构对翻译的影响 以RNA噬菌体f2的RNA作为模板，在大肠杆菌无细胞系统中进行蛋白质合成时，大部分合成外壳蛋白，RNA聚合酶只占外壳蛋白的1/3。用同位素标记分析RNA噬菌体几种蛋白质的起译过程，发现外壳蛋白起译频率比合成酶至少要高3倍。 研究发现f2外壳蛋白基因的琥珀突变也影响了RNA聚合酶合成的起始。但若该突变不是发生在外壳蛋白接近翻译起始区，而是较靠后的位点，对RNA聚合酶的起译就没有影响。现在一般认为，聚合酶的翻译起始区被RNA的高级结构所掩盖，外壳蛋白的起始翻译破坏了RNA的立体构象，使核糖体有可能与翻译起始区结合，导致聚合酶的起译。用甲醛处理RNA可以增加聚合酶的产量，这说明RNA 的高级结构对基因表达调控的可能性。 4. 魔斑核苷酸水平对翻译的影响 科学上，把培养基中营养缺乏，蛋白质合成停止后，RNA合成也趋于停止这种现象称为严紧控制（rel+）；反之则称为松散控制（rel-）。研究发现，在氨基

转录及其调控作业习题

第三章转录及其调控 测试题 一. 单项选择题 1．对于大肠杆菌RNA聚合酶的叙述，不正确的是（） A．由核心酶和σ因子构成 B．核心酶由α2ββ′组成 C．全酶与核心酶的差别在于β亚单位的存在 D．全酶包括σ因子 E．σ因子仅与转录起动有关 2．真核生物RNA聚合酶Ⅱ对α--鹅膏蕈碱的反应为（） A．不敏感 B．中度敏感 C．高度敏感 D．低度敏感 E．不确定3. DNA双链中，指导合成RNA的那条链称作（） A．模板链 B．冈崎链 C．编码链 D．非编码链 E．以上都不对 4. 关于转录和复制的区别，说法正确的是（） A. DNA双链均复制和转录 B. 复制的原料是一磷酸脱氧核苷，转录的原料是一磷酸核苷 C. 复制酶是依赖DNA的DNA聚合酶，转录酶是依赖RNA的DNA聚合酶 D. 复制需要引物，转录不需要引物 E. 均遵守碱基配对规律，模板中A对应的产物是T 5. ρ-因子的功能是（） A．结合阻遏物于启动区域处 B．增加RNA合成速率 C．释放结合在启动子上的RNA聚合酶 D．参与转录的终止过程 E．允许特定转录的启动过程 6. 下列关于启动子的描绘哪一项是正确的? （） A．mRNA开始被翻译的那段DNA顺序 B．开始转录生成mRNA的那段DNA顺序 C．RNA聚合酶最初与DNA结合的那段DNA顺序 D．阻抑蛋白结合的DNA部位 E．调节基因结合的部位 7. 真核细胞中经RNA聚合酶I催化转录的产物是（） A．hnRNA B．tRNA C．5S rRNA D．U4,U5snRNA E．5.8S,18S,28SrRNA前体 8. 转录过程中需要的酶是（） A．DNA指导的DNA聚合酶 B．核酸酶 C．RNA指导的RNA聚合酶ⅡD．DNA指导的RNA聚合酶 E．RNA指导的DNA聚合酶 9. 下列关于rRNA的叙述错误的是（） A．原核rRNA由RNA聚合酶催化合成 B．真核生物部分rRNA由RNA聚合酶Ⅲ转录合成

第三章 基因表达的调控

第三章基因表达的调控 基因表达：DNA→mRNA→蛋白质的遗传信息传递过程 基因表达的调控 第一节基因的活化 基因的“开关”-染色质的活化 一、活性染色质的结构 间期核染色质： 异染色质(heterochromatin)，高度压缩(不转录)； 常染色质(euchromatin)，较为松散， 常染色质中约10%为活性染色质(更开放疏松)。 活性染色质→←非活性染色质 二、活性染色质的结构特点 (一)DNaseI敏感性 转录活性(或有潜在转录活性)的染色质对DNase I更敏感． DNase I超敏感位点(DNase I HyperSensitive Sites，DHSS) (二)组蛋白H3的CyS110上巯基暴露， 三、活性染色质结构的形成 （一)、核小体位相(Phased positioning) 1．核小体的旋转定位(rotational positioning) 指核小体核心与DNA双螺旋在空间结构中的相互关系，主要包括DNA双螺旋的大沟是面向还是背向核心结构．‘ 2．核小体的平移定位(translational positioning) 指核小体与特定DNA序列的结合位置和方式，特别是转录活性相关的DNA调控元件（启动子、增强子等）序列与核小体的相互位置关系。 (二)、组蛋白修饰 1．H1组蛋白磷酸化 促进染色体包装，影响转录活性， 2．核心组蛋白修饰 乙酰化：常发生在组蛋白的Lys， 一般活性染色质是高度乙酰化的。 （三)HMG蛋白结合 HMG（high mobility group)蛋白—高迁移率蛋白, 如HMG14/HMG17. 与核小体核心颗粒结合，有利转录。 四、DNA甲基化与基因表达． (一)、真核生物基因组DNA的甲基化(Methylation) 哺乳动物基因组中5%的C为甲基化(m C)，m C主要存在于CpG二核苷酸中． CpG二核苷酸序列常成簇聚集并零散地分布于人基因组中，形成CpG岛(CpG islands)．人基因组中约每10Kb就有一个CpG岛． CpG岛常与基因相连(可作为寻找基因的标记)。 (二)DNA甲基化的转录抑制作用。

拟南芥在盐胁迫环境下SOS转录调控网络的构建及分析

HEREDITAS (Beijing) 2010年6月, 32(6): 639―646 ISSN 0253-9772 https://www.wendangku.net/doc/fa17189507.html, 研究报告 收稿日期: 2009–12–24; 修回日期: 2010–02–08 基金项目:农业部公益性行业科研专项(编号：200803034)和国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(编号：2008CB117002)资助 作者简介:谢崇波(1985–), 男, 硕士研究生, 专业方向：作物遗传育种。E-mail: xiechongbo@https://www.wendangku.net/doc/fa17189507.html, 通讯作者:朱军(1949–), 男, 博士, 教授, 研究方向：数量遗传学与生物信息学。 E-mail: jzhu@https://www.wendangku.net/doc/fa17189507.html, DOI: 10.3724/SP.J.1005.2010.00639 拟南芥在盐胁迫环境下SOS 转录调控网络的构建及 分析 谢崇波, 金谷雷, 徐海明, 朱军 浙江大学农业与生物技术学院, 杭州310029 摘要: 研究拟南芥在高浓度盐处理环境下的基因调控网络, 有助于了解其在盐胁迫环境下保持正常生长的防 御机制。针对目前广泛研究的SOS (Salt Overly Sensitive)耐盐机制, 文章整合公共数据库中盐胁迫相关的拟南芥基因组表达谱芯片, 通过反向工程方法构建了拟南芥在盐胁迫状态下的SOS 转录调控网络。所获得的调控网络包含70个盐胁迫相关且高度互作的互作基因, 其中27个转录因子为主要调控节点。进而根据SOS 核心基因的表达特性, 所得调控网络内的不同表达模式得到了鉴别。 关键词: 拟南芥; 盐胁迫; 转录调控网络; 转录因子; 基因表达 Construction and analysis of SOS pathway-related transcriptional regulatory network underlying salt stress response in Arabidopsis XIE Chong-Bo, JIN Gu-Lei, XU Hai-Ming, ZHU Jun College of Agriculture and Biotechnology , Zhejiang University , Hangzhou 310029, China Abstract: Elucidating gene regulatory network of Arabidopsis thaliana under high salt treatment is crucial to understand the defense mechanism of maintaining normal growth rate. Here, an Arabidopsis Salt Overly Sensitive (SOS) transcriptional regulatory network under salinity stress was constructed using a reverse engineering method on published genome-wide expression profiles. In this study, the SOS regulatory network constructed contains 70 genes, of which 27 are highly inter-connected transcription factors. According to the expression feature of key genes in SOS signaling pathway, distinct expres-sion patterns of the regulatory network were identified. Keywords: Arabidopsis thaliana ; salt stress; transcriptional regulatory network; transcription factors; gene expression 目前, 土壤盐渍化问题日趋严重, 并不断影响农业生产和农业生态环境。其对植物的胁迫主要有两方面: 一是土壤的盐分浓度偏高会影响植物根部对水分的吸收; 另一方面是植物内部过高的盐分浓度导致植物细胞离子中毒[1]。 为此, 国内外学者对植物耐盐性机理陆续开展了广泛的研究, 包括SOS (Salt Overly Sensitive)信号途径、Ca 2+信号途径、 MAPK 级联反应途径和脱落酸参与的细胞信号途径等。其中, 朱健康等[2,3]提出的SOS 机理, 即拟南芥(Arabidopsis thaliana )高盐环境下离子平衡与信号传导体系, 是目前研究较为深入的耐盐机理。 目前, 已知参与SOS 信号途径的基因有SOS1、SOS2、SOS3、SOS4、AKT1、NHX1和HKT1[4~8]等。在SOS 途径中, SOS1编码细胞膜上的Na +/H +反转运

第二节真核基因转录水平的调控(精)

第二节真核基因转录水平的调控 一、真核生物的RNA聚合酶 有三种RNA聚合酶：RNA聚合酶Ⅰ；RNA聚合酶Ⅱ；RNA聚合酶Ⅲ。 二、真核基因顺式作用元件 （一）、顺式作用元件概念 指DNA上对基因表达在调节活性的某些特定的调控序列，其活性仅影响其自身处于同一DNA分子上的基因。 （二）、种类 启动子、增强子、静止子 1、启动子的结构和功能 启动子与原核启动子的含义相同，是指RNA聚合酶结合并起动转录的DNA序列。 但真核同启动子间不像原核那样有明显共同一致的序列。而且单靠RNA聚合酶难以结合DNA而起动转录，而是需要多种蛋白质因子的相互协调作用。 RNA聚合酶Ⅱ启动子结构 1）TATA框（TATA frame）：其一致顺序为TATAA(TAA(T。TATA框中心在-30附近，相当于原核的-10序列（pribnow box）。 对大多数真核生物来说，RNA聚合酶与TATA框牢固结合之后才能开始转录。 TATA框的左右富含G┇C 序列，这就有利于该框与RNA聚合酶形成开放性启动子复合物。

2）CAAT框（CAAT frame）：位置在-75附近，一致序列为GG C(TCAATCT。CAAT框可能控制着转录起始的频率。 （3）GC框 在-90bp左右的GGGCGG序列称为GC框。 一个在-30—+15即核心启动子(core promoter element，另一为上游启动子区(upstream promoter element在-150—-50，不同物种的启动子因子有显著差异，启动子区没有和mRNA的TATA和CAAT盒顺序，故物种间大前体-rRNA基因的转录起始是不同的。基因间间隔含一个或几个终止信号可终止其之前的基因的转录而其本身不转录，间隔区含多种反向顺序可作为增强子结合转录因子 2、增强子的结构和功能 增强子（enhancer）：又称为远上游序列（far upstream sequence 。它是远距离调节启动子以增加转录速率的DNA序列，其增强作用与序列的方向无关，与它在基因的上下游位置无关。增强子有强烈的细胞类型选择，即不同细胞类型，增强作用不同。 1）它能通过启动子大幅度地增加同一条DNA链上靶基因转录的频率，一般能增加 10～200倍，有的甚至可达千倍。 （2）增强子的作用对同源或异源的基因同样有效，如把SV40 的增强子连接到兔β-珠蛋白的基因上，可使转录强度增大100倍； （3）增强子的位置可在基因5′上游、基因内或其3′下游的序列中，而其作用与所在基因旁侧部位的方向似无关系，因为无论正向还是反向，它都具有增强效应； （4）增强子所含核苷酸序列大多为重复序列，其内部含有的核心序列，对于它进入到另一宿主之后重新产生增强子效应至关重要；

基因的转录、转录后调控

基因的转录、转录后 加工及逆转录 转录 (transcription)是以DNA单链为模板，NTP为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。与DNA的复制相比，有很多相同或相似之处，亦有其特点，它们之间的异同可简要示于表13-1 转录的模板是单链DNA，与复制的模板有较多的不同特点，引出了下列相关概念。转录过程只以基因组DNA中编码RNA（mRNA、tRNA、rRNA及小RNA）的区段为模板。把DNA分子中能转录出RNA的区段，称为结构基因（structure gene）。结构基因的双链中，仅有一股链作为模板转录成RNA，称为模板链(template strand)，也称作Watson（W）链(Watson strand)、负（-）链(minus strand)或反意义链(antisense strand)。与模板链相对应的互补链，其编码区的碱基序列与mRNA的密码序列相同（仅T、U互换），称为编码链(coding strand)，也称作Crick（C）链（Crick strand）、正（+）链(plus strand)，或有意义链(sense strand)。不同基因的模板链与编码链，在DNA分子上并不是固定在某一股链，这种现象称为不对称转录(asymmetric transcription)。模板链在相同双链的不同单股时，由于转录方向都从5’→3’，表观上转录方向相反，如图13-1。 与DNA复制类似，转录过程在原核生物和真核生物中所需的酶和相关因子有所不同，转录过程及转录后的加工修饰亦有差异。下面的讨论中将分别叙述。 参与转录的酶 转录酶（transcriptase）是依赖DNA的RNA聚合酶（DNA dependent RNA polymerase，DDRP），亦称为DNA指导的RNA聚合酶（DNA directed RNA polymerase），简称为RNA聚合酶（RNA pol）。它以DNA为模板催化RNA的合成。 原核生物和真核生物的转录酶，均能在模板链的转录起始部位，催化2个游离的

第三章 RNA转录

第三章 RNA 转录(RNA transcription) 3.1. Basic concept 3.2. Trancription survey 3.3. Promoter in Eukaryotes and Prokaryotes 3.4. Transcription Termination 3.5. Pre-RNA processing in Eukaryotes 3.1. 基本概念（P64） Basic concept ● 基因表达的第一步 ● 以D. S. DNA 中的一条单链作为转录的模板 某一基因只以一条单链DNA 为模板进行转录（不对称转录） ● 在依赖DNA 的RNA 聚合酶的作用下 ● 按A U ，C G 配对的原则，合成RNA 分子 ● 模板单链 DNA 的极性方向为3’ → 5’, 而非模板单链 DNA 的极性方向与RNA 链相同，均为5’ → 3’. ● RNA 的转录包括promotion, elongation, termination 三个阶段 ● 从启动子（promoter ）到终止子（terminator ）的DNA 序列称为转录单位 （transcriptional unit ） ● 原核生物中的转录单位多为 polycistron in operon 真核生物中的转录单位多为monocistron, No operon ● 转录原点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值 ● RNA 的主要种类及功能：mRNA ——携带编码多肽的遗传信息 tRNA ——将核苷酸信息转化为aa 信息 转运aa 进入核糖体 rRNA ——参与多肽合成 3.2.RNA 转录概况 3.2.1转录的基本过程 1. 模板识别：RNApol 与启动子相互识别并结合的过程 （形成封闭的二元复合物） ? 启动子（promoter ）：DNA 分子上结合RNApol 并形成转录起始复合物的区域，通常也包括促进这一过程的调节蛋白结合位点rich A/T ，易发生DNA 呼吸现象形成单链区 2转录起始：启动子区解链，转录起始 （封闭的二元复合物 开放的二元复合物 三元复合物） 通常在这一过程中RNApol 移动较慢，且易发生脱落——流产式起始 ——决定启动子的强弱 3延伸： 延伸过程中的延宕现象（Eukaryotes ）：Euk genome G/C 分布不均匀 σ脱离全酶（Pro ）/RNApol 脱离转录起始复合物（Euk ） 4终止：在终止子（terminator ）处停止转录 3.2.2 RNApolymerase 1 RNA polymerase in Prokaryotes （以E.coli 为例） 1）构成 ? 核心酶(core enzyme)：2αββ’ DNA 3’----TACTCAT----5’ RNA 5’----AUGAGUA----3’ 5’---ATGAGTA----3’ Non-template (sense strand) template (antisense strand)

真核基因转录水平的调控1-3

真核基因转录水平的调控 一、真核生物的RNA聚合酶 有三种RNA聚合酶：RNA聚合酶Ⅰ；RNA聚合酶Ⅱ；RNA聚合酶Ⅲ。 二、真核基因顺式作用元件 （一）、顺式作用元件概念 指DNA上对基因表达在调节活性的某些特定的调控序列，其活性仅影响其自身处于同一DNA分子上的基因。 （二）、种类 启动子、增强子、静止子 1、启动子的结构和功能 启动子与原核启动子的含义相同，是指RNA聚合酶结合并起动转录的DNA序列。 但真核同启动子间不像原核那样有明显共同一致的序列。而且单靠RNA聚合酶难以结合DNA而起动转录，而是需要多种蛋白质因子的相互协调作用。 RNA聚合酶Ⅱ启动子结构 1）TATA框（TATA frame）：其一致顺序为TATAA(T)AA(T)。TATA框中心在-30附近，相当于原核的-10序列（pribnow box）。 对大多数真核生物来说，RNA聚合酶与TATA框牢固结合之后才能开始转录。TATA框的左右富含G┇C 序列，这就有利于该框与RNA聚合酶形成开放性启动子复合物。 2）CAAT框（CAAT frame）：位置在-75附近，一致序列为GG C(T)CAATCT。CAAT框可能控制着转录起始的频率。 （3）GC框 在-90bp左右的GGGCGG序列称为GC框。 一个在-30—+15即核心启动子(core promoter element)，另一为上游启动子区(upstream promoter element)在-150—-50，不同物种的启动子因子有显著差异，启动子区没有和mRNA的TATA和CAAT盒顺序，故物种间大前体-rRNA基因的转录起始是不同的。基因间间隔含一个或几个终止信号可终止其之前的基因的转录而其本身不转录，间隔区含多种反向顺序可作为增强子结合转录因子

真核生物基因表达调控

真核生物基因表达的调控远比原核生物复杂，可以发生在DNA水平、转录水平、转录后的修饰、翻译水平和翻译后的修饰等多种不同层次。但是，最经济、最主要的调控环节仍然是在转录水平上。 DNA水平的调控 DNA水平上的调控主要指通过染色体DNA的断裂，删除，扩增，重排，修饰（如甲基化与去甲基化，乙酰化与去乙酰化等）和染色质结构变化等改变基因的数量、结构顺序和活性而控制基因的表达。 转录水平的调控 转录水平的调控包括染色质的活化和基因的活化。通过染色质改型，组蛋白乙酰化，染色质变得疏松化及DNA去甲基化以便被酶和调节蛋白作用，基因的表达受顺式作用元件包括启动子及应答元件，转座元件，增强子，抑制子的调控，同时受反式作用因子包括基本转录因子，上游转录因子和转录调节因子等的调控。 转录后调控 转录后调控包括hnRNA的选择性加工运输和RNA编辑 在真核生物中，蛋白质基因的转录产物统称为hn RNA，必须经过加工才能成为成熟的mRNA分子。加工过程包括三个方面：加帽、加尾和去掉内含子。同一初级转录产物在不同细胞中可以用不同方式剪接加工，形成不同的成熟mRNA分子，使翻译成的蛋白质都可能不同。转录后的RNA在编码区发生碱基插入，缺失或转换的现象。

翻译水平的调控 阻遏蛋白与mRNA结合，可以阻止蛋白质的翻译并使成熟的mRNA变为失活状态贮存起来。一些调控作用的micRNAh和siRNA 还可以与mRNA作用降解mRNA，阻止其翻译 此外，还可以控制mRNA的稳定性和有选择的进行翻译。 翻译后调控 直接来自核糖体的线状多肽链是没有功能的，必须经过加工才具有活性。在蛋白质翻译后的加工过程中，还有一系列的调控机制。 1．蛋白质折叠 线性多肽链必须折叠成一定的空间结构，才具有生物学功能。在细胞中，蛋白质的折叠必须有分子伴侣的作用下才能完成折叠。 2．蛋白酶切割 末端切割 有些膜蛋白、分泌蛋白，在氨基端具有一段疏水性强的氨基酸序列，称为信号肽，用于前体蛋白质在细胞中的定位。信号肽必须切除多肽链才具有功能。 多聚蛋白质的切割 有些新合成的多肽链含有几个蛋白质分子的序列，切割以后产生具有不同功能的蛋白质分子。

5、转录调控

分子机制研究套路（五） 转录调控 课题：转录因子A对B基因的转录调控 1．概念介绍： 转录水平的调控是真核生物基因表达调控中重要环节。真核细胞RNA 聚合酶自身对启动子并无特殊亲和力，单独不能进行转录，也就是说基因是无活性的。因此，转录需要众多的转录因子和辅助转录因子形成复杂的转录装置。在基因转录起始阶段，通用转录因子协助RNA 聚合酶与启动子结合，但其作用很弱，不能高效率地启动转录。只有在反式作用因子(基因特异性转录因子）的协助下，RNA 聚合酶Ⅱ和TFⅡ才能有效地形成转录起始复合物。反式作用因子（trans acting factor）在转录调节中具有特殊的重要性。它是能直接或间接地识别或结合在顺式作用元件8～12bp 核心序列上，参与调控靶基因转录效率的一组蛋白质。这类DNA 结合蛋白有多种，能特异性识别这类蛋白的序列也有多种，正是不同的DNA 结合蛋白与不同的识别序列之间的空间结构上的相互作用，以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用构成了复杂的基因转录调控机制的基础。 在真核生物中转录因子的调控是最重要，也是研究得最多的。蛋白质相互作用在转录因子活性的调控方面具有重要的意义。细胞内的反式作用因子都是处于有活性和无活性两种状态，这两种状态是可以转换的。反式作用因子处于无活性状态时，与之相应的基因就不能表达；反式作用因子处于有活性状态、并与相应的顺式作用元件结合时，就可以促进RNA 聚合酶和通用转录因子与相应的启动子结合，形成转录起始复合物。所以，真核基因的表达调控主要是调节反式作用因子的活性，随后反式作用因子调控基因的转录起始。 转录因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子，对基因转录发挥调控作用。大部分转录因子在激活以后与顺式作用元件结合，但也可能有一些转录因子是先结合DNA，