大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定
相类似。
本研究提示SARS 病毒并非来源于人工驯养的野生动物,而是来源于野生动物,其中蛇、鹰、蛤蚧、鳖最为可能。广西原发病例接触病死猫后发病,因而老鼠仍很可能是SARS 病毒的最原始宿主,但其极低携带率和极低病毒量不但难于直接传给人类,而且也难检测到阳性老鼠。SARS 抗体阳性的鹰,蛇、龟、蛤蚧均为食肉动物,而且高空飞翔的鹰和冬眠的蛇均有利于病毒繁殖和携带的低氧分压状态。这些野生动物通过对鼠等动物的猎食而感染、富集。然后在其体内繁殖和携带。当被人类猎捕后,在冬末早春气温较暖湿度大的南方,长途运输严重缺氧使病毒发生变异,形成毒力和侵袭力强的SARS 病毒,在贩运人员和厨师近距离接触和捕杀过程中受伤感染而发病,然后通过家人护理或就医的医院医护人员诊疗中密切接触造成人间传播和暴发流行。2003年我国成功扑灭SARS 的疫情,其中严格禁止捕猎贩运和宰杀野生动物是最主要的措施之一,与本研究结果相吻合。因此,应禁止捕猎贩运和宰杀野生动物、每年冬春季节加强对发热肺炎病人监测,尤其是捕猎贩运和宰杀野生动物史或实验室病源研究史的发热肺炎病人监测排查、同时大搞爱国卫生运动、降低甚至消除鼠类等传播疾病的病原媒介是防范SARS 的发生和控制扑灭SARS 疫情的首要措施。至于疑为SARS 病毒最原始宿主鼠类和蝙蝠及其通过食物链进入二级宿主野生动物的过程和机理仍有待以进一步的研究。(参加本文工作的还有杨庆利、钟革、蓝光华、冯向阳、熊绮梦、陈岳波、韦东禄、刘志高、石友盟、李建民、蒙世安,在此一并致谢)
参 考 文 献
1 王汉章,王茂武,王建伟,等主编1传染性非典型肺炎防
治培训教材(修订版).北京:中国协和医科大学出版社,
2003.3210.
2 廖祯华主编.广西壮族自治区地图集.北京.星球地图出
版社.2003.42247.
广西医科大学学报 2006Feb ;23(1)
3广西区卫生厅资助课题(Z2002098)收稿日期:2005202201
大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定3
滕晓茗 周微雅 黄 燕 周祥祯
(广西壮族自治区人民医院 南宁 530021)
摘要 目的:探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础。方法:用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养;用光镜、电镜及免疫组化检测进行鉴定。结果:分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈“铺路石样”排列,透射电镜可见Weibel 2Palade 小体。第Ⅷ因子相关抗原免疫组化测定阳性。结论:该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞。关键词 脑微血管;内皮细胞;体外培养
中国图书资料分类法分类号 R331;R322113
THE METH ODS OF CU LTURING AN D IDENTIFYING CEREBRAL MICR OVASCU LAR EN 2DOTHE L IAL CE LL IN RATS
Teng Xiaoming ,Zhou Weiya ,Huang Yan ,et al.(The People ’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region ,Nanning 530021China )Abstract Objective :To explore t he met hods of cult uring rat cerebral microvascular endot helial cells (RC 2M ECs ),so as to build up t he basis for t he st udies of vascular endot helial cells.Methods :After t he RCM EC were digested wit h collagenase Πto make suspension which are cultivated ,t he RCM EC were identified by immunohistochemical met hods and observed wit h light micro scope and elect ron microscope.R esult :Isolated RCM ECs grow to mo nolayer after one week of external cultivation.They present polygonal and arrange like pavement stones under light micro scope.Weibel 2Palade (W 2P )body can be seen under transmission e 2lect ron micro scope.Correlation antigens of Ⅷfactor are positive by fluorescent stain.Conclusion :The met hods for t he cultivation and identification of RCM ECs could cultivate cerebral microvascular endot helial
cells.
K ey w ords cerebral microvascular ;endot helial cell ;cultivation in external
?
05?广西医科大学学报 2006Feb ;23(1)
以往体外培养的血管内皮细胞主要来自动物胸、腹大动脉和人脐静脉,随着血管内皮细胞研究的发展,微血管内皮细胞的培养技术越来越受到人们的重视。本文探讨一种酶溶液消化大鼠脑皮质的脑微血管内皮细胞培养方法。
1 材料与方法
111 材料:RPMI 21640培养基、L 2谷氨酰胺、优质胎牛血清
购自美国G ibco 公司;胶原酶Ⅱ型、促内皮细胞生长因子
(ECGF )、D 2Hanks 液购自美国sigma 公司;第Ⅷ因子相关抗
原抗体(福州新生物技术开发公司);右旋糖酐(武汉生命技术有限公司);青霉素、链霉素、肝素(华北制药)。
112 仪器:CO 2孵箱(德国Heraeus 公司);超净工作台(苏
净集团安泰公司);相差显微镜(日本OL YMPS )
113 动物:清洁级Wistar 大鼠2只、雄性,购自广西医科大
学实验动物中心。
114 方法
11411 培养液的配制:取一袋RPMI 21640粉剂溶于950ml
三蒸水中,加210gNa HCO 3、016g L 2谷氨酰胺后充分搅拌使完全溶解,用三蒸水定容至1000ml ,用1mol/L NaO H 调
p H 至618～710,滤过除菌(p H710～712)、分装后于4℃保
存备用。使用时加入20%胎牛血清、ECGF 、肝素25U/ml 、
青霉素100IU/ml 、链霉素100mg/L 及L 2谷氨酰胺2mmol/
L 。
11412 原代内皮细胞的分离及培养:①将大鼠处死,去头
皮。取出头颅并浸入75%的乙醇中消毒约1min ,在无菌状态下迅速取出大鼠大脑。需小心剔除大血管和软脑膜;②将脑皮质剪下放入D 2Hanks 液中,漂洗数次后,将其剪碎。再移入含0105%胰蛋白酶的小瓶内,在37℃水浴中消化10～
20min ;③用有血清培养液中止消化。置于玻璃研磨器内研
磨,制成粗悬液。经孔径为110μm 的尼龙筛网过滤,将滤液以4000r/min 离心10min ;④弃离心后的上清液。给沉淀加入15%右旋糖酐溶液,重新悬浮沉淀后以4000r/min 离心20min 。收集微血管片段;⑤用011%胶原酶消化10～20
min 后加血清终止酶活性,用Hanks 液洗涤并离心去上清液
后,给微血管片段加入RPMI 21640培养液;⑥接种到培养瓶中,置37℃、5%CO 2培养箱中(湿度100%)培养;⑦24h 后换液,将未贴壁的微血管段移入其它培养瓶继续贴壁生长。之后每3d 换液一次,待内皮细胞生长密度达90%时,即可传代。
11413 传代内皮细胞的培养:0125%胰蛋白酶消化液均匀
分布于细胞表面,在相差显微镜下观察见细胞变圆,间隙增大,则用含血清培养液中止消化、轻轻吹打,2000r/min 离心,1传2或3,余培养过程同原代培养。
11414 内皮细胞的观察及鉴定:①相差显微镜下形态学观
察;②电镜下超微结构观察;③细胞生长曲线观察:将细胞
5×104/ml ,分别接种于7只50ml 培养瓶中常规培养,以后
每天取一瓶细胞用0125%胰蛋白酶消化收集细胞,用白细胞计数法[1]计算每瓶细胞每毫升活细胞数,一共观察7d ,并划
出生长曲线;④第Ⅷ因子相关抗原的免疫组化检测。将细胞接种于盖玻片上,用丙酮固定20min ,PBS 冲洗5min ×3次,
011%TritonX 2100内浸20min 之后PBS 冲洗5min ×3次,3%H 2O 22甲醇室温下10min 阻断内源性过氧化物酶,滴加10%非免疫动物血清封闭10min ,加一抗F Ⅷ37℃湿盒孵育1h ,常规冲洗后加生物素标记二抗孵育10min ,加链霉菌抗
生物素一过氧化物酶溶液孵育10min ,DAB 显色,苏木素复染、酒精脱水干燥,中性树胶封固,同时设立非血管内皮细胞为阴性对照组。
2 结 果
211 细胞形态学观察:原代细胞24h 后,大部分细胞贴壁。
传代细胞015～2h 贴壁80%～90%,6～8d 长满瓶壁,呈“鹅卵石样”或“铺路石样”排列生长。细胞呈多角形或扁平梭形,核卵圆形、可见核仁,见图1。
212 透射电镜下可见Weibel 2Palade (W 2P )小体(见图2)。213 细胞生长曲线:3d 后细胞生长旺盛(见图3)。214 第Ⅷ因子相关抗原阳性,胞浆中含棕黄色反应物质(见
图4)。
图1 细胞多角形或扁平梭形,呈“铺路石样”排列,
胞核卵圆形,可见核仁(×100)
图2 W 2P 小体(×15000)
?
15?滕晓茗,等1大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定
图3
内皮细胞生长曲线
图4 S 2P 免疫组化染色法示胞浆中含棕黄色的
阳性反应(×400)
3 讨 论
血管内皮细胞是衬附于血管内壁的一层细胞,它不仅是构成血管细胞间屏障重要成分,而且在调节血管舒缩状态、释放血管活性物质、调节机体内环境的稳定,维护正常生理功能等方面发挥重要作用。因此,血管内皮细胞的研究具有重要意义,来源于大鼠脑微血管内皮细胞因脑皮质薄、血管细小、收集到的血管内皮细胞极其有限而使培养难以成功,选择酶的适宜消化浓度和控制好消化时间是培养成功的关键
[2]
,脑微血管内皮细胞分离是将剪碎的脑皮质浸泡在消化
酶中,酶的消化一般呈由外向里,最后被消化下来的细胞才
是内皮细胞。因此,彻底地消化组织是获得足够微血管内皮细胞的前提,但消化时间过长或酶浓度过高,会带来较多非血管内皮细胞的污染,应反复摸索实验条件。我们在参考有关文献[3]基础上采用浓度011%胶原酶Ⅱ型37℃消化分离内皮细胞10～20min 。在脑组织剪碎后,可先用低浓度的胰蛋白酶(0105%)消化,使微血管与神经组织更易分离。然后,再用胶原酶消化获得微血管段,以去除周边细胞和基底膜,这样既减少胶原酶的用量,降低成本,又不影响微血管内皮细胞的数量。悬液中混有血细胞及神经组织细胞碎片,因其不易贴壁而在换液时被洗掉,故可不作特别处理。
微血管内皮细胞鉴定:①根据器官和组织的来源;②在倒置显微镜下细胞呈多角形或扁平梭形,“铺路石样”排列,无重叠;③第Ⅷ因子相关抗原的免疫组化测定阳性,该检测是鉴定内皮细胞的最有效方法;④透射电镜下在胞浆中可见
W 2P 小体,但由于W 2P 小体在不同种属、部位、培养条件下
培养的血管内皮细胞中形态、结构均有所差异,且出现概率低,故目前认为前三点是鉴定血管内皮细胞的主要依据,W 2P 小体不作为鉴定内皮细胞必要指征。
我们体会:①采用优质胎牛血清,原代用20%,传代可用
10%;②微血管细小,收集到的内皮细胞有限,故原代应高密
度种植,利于细胞间相互影响,通过产生促生长活性物质,互相促进生长;③L 2谷氨酰胺是内皮细胞生长必需成分,其本
身易分解,应用时追加确保培养液终浓度2～4mmol/L ;④选择合适消化液浓度和控制好消化时间。使之能充分消化组织,又减少细胞损伤和非血管内皮细胞污染,此分离细胞培养法可有效培养微血管内皮细胞。
参 考 文 献
1 张卓然主编1实用细胞培养技术.北京:人民卫生出版
社,1999.30.
2 薛庆善主编.体外培养的原理与技术.北京:科学出版社,
2001.428.
3 刘新晖,张锡庆,王晓东,等.兔肾微血管内皮细胞的体外
培养及鉴定方法.苏州大学学报(医学报),2003,23(6):
6582661.
医学中法定计量单位对长度单位的要求
医学中在微小的长度计量中以往常用的A o
、μ(指μ作为单位单独使用,代表微米)不属于法定单位,不宜再用,宜采用法定单位中长度基本单位m 的分数单位,如nm 、pm 等。以往将词头重叠的用法,如m
μm 、μμm 等,不符合法定计量单位使用方法的规则,不宜再用,宜采用只有一个词头与单位构成的分数单位,如nm 、pm 等。以往用X 线波长的X 单位(舍巴恩单位)不是法定单位,不宜再用,宜采用m 的分数单位。
?25?广西医科大学学报 2006Feb ;23(1)
人类输卵管上皮永生化细胞系的建立及鉴定
《中国癌症杂志》2013年第23卷第4期 CHINA ONCOLOGY 2013 Vol.23 No.4 241 人类输卵管上皮永生化细胞系的建立 及鉴定 高雯1,2 臧荣余1 王雁2 杨丽娜2 刘杨1 亓子豪2 尹胜1 杨恭2 1.复旦大学附属肿瘤医院妇科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032； 2.复旦大学附属肿瘤医院实验研究中心，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032 ［摘要］ 背景与目的：最近研究表明卵巢高级别浆液性癌可能起源于输卵管上皮。本课题通过基因沉默和端粒酶导入技术将原代输卵管上皮细胞永生化，为以后建立恶性转化细胞系和卵巢癌动物模型奠定基础。方法：分离并培养输卵管上皮细胞，导入p53和pRb shRNA结合hTERTcDNA，建立p53和pRb基因同时沉默并过表达hTERT的永生化细胞系，并对永生化细胞系进行连续传代、沉默基因的蛋白质印迹法(Western blot)测定、SA-β-gal染色和非停泊生长实验及体内致瘤活性鉴定。结果：我们建立了稳定表达p53、pRbshRNA和hTERT的永生化输卵管上皮细胞系：FTE248116/p53i+pRbi+hTERT及FTE312249/p53i+pRbi+hTERT。结论：可以通过导入端粒酶基因及敲除抑癌基因p53和pRb来建立永生化细胞系,并有望于构建恶性转化细胞系和人类高级别浆液性卵巢癌动物模型。 ［关键词］ 输卵管上皮细胞；p53；pRb；hTERT；永生化 DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.04.00X 中图分类号：R737.32 文献标志码：A 文章编号：1007-3639(2013)04-0241-07 Immortalization of human fallopian tube epithelial cells GAO Wen 1,2, ZANG Rong-yu 1, WANG Yan 2, YANG Li-na 2, LIU Yang 1, QI Zi-hao 2, YIN Sheng 1, YANG Gong 2 (1.Departements of Gynecological Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2.Cancer Research Laboratory, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China) Correspondence to: YANG Gong E-mail: yanggong@https://www.wendangku.net/doc/ff17318089.html, ［Abstract ］ Background and purpose: Recent researches indicate that high grade serous ovarian carcinoma is derived from fallopian tube epithelial malignancy. In this study, we used primary fallopian tube epithelium to establish the immortalized cell lines by silencing of tumor suppression genes and introduction of hTERT, in order to further build malignant cell lines and ovarian cancer animal models. Methods: Primary fallopian tube epithelia were isolated and transfected with a plasmid containing pRb and p53 shRNAs combined with hTERT to establish immortalized cell lines. The resulting cells were validated through examining cell population doublings, p53 and pRb expression, SA-β-gal activity; anchorage-independent growth and in vivo tumorgenesis. Results: We successfully established two immortalized fallopian tube epithelial cell lines: FTE248116/p53i+pRbi+hTERT, FTE312249/p53i+pRbi+hTERT through silencing of p53 and pRb and introduction of hTERT simultaneously. Conclusion: The establishment of immortalized cell lines can be accomplished by introduction of p53 and Rb shRNA and overexpression of hTERT, and these cells may be used to establish the transformed cell lines and ovarian cancer animal models. ［Key words ］ Human fallopian tube epithelia cells; p53; pRb; hTERT; Immortalization 基金项目：国家自然科学基金项目(No: 81171911)。通信作者：杨恭 E-mail:yanggong@https://www.wendangku.net/doc/ff17318089.html, 卵巢癌(ovarian cancer)是致死率最高的妇科恶性肿瘤。在原发性卵巢癌中，75%～90%是上皮性癌。目前越来越多的证据表明：高级别浆液 性卵巢上皮性癌起源于输卵管上皮，卵巢只是继发受累。无论从形态学分析还是经过蛋白组学分析都证实高级别浆液性卵巢癌起源于输卵管上皮［1］。正常上皮细胞在体外连续传代6～15
小鼠肺微血管内皮细胞使用说明
小鼠肺微血管内皮细胞 小鼠肺微血管内皮细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠肺微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠肺微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠肺微血管内皮细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠肺微血管内皮细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
小胶质细胞培养及鉴定
2．1小胶质细胞的原代细胞培养 2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。 第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定 2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。分离后的底层混
合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。 2．1．3免疫荧光鉴定步骤 1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。 2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟 3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右 4)PBS洗3次，每次5分钟 5) 5％BSA室温封闭30分钟 6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜 7)PBS洗3次，每次5分钟 8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时 9)PBS洗3次，每次5分钟 10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟 11)1xPBS洗3次，每次5分钟 12)95％甘油封片
血管内皮细胞体外培养(赵)
血管内皮细胞体外培养 1．概述血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第Ⅷ因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。体外培养中的EC形态呈"鹅卵石样"镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。 2．培养方法EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。 2.1 方法原理用酶消化法，酶消化＋机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。 2.2 介绍几种主要EC的分离 2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离 2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管） a．在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。 b．在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。 c．注入0.1%胶原酶（1型）溶液，待血管内残留的D-Hanks液流尽后，用注射器封注另一端针头，继续注入胶原酶溶液，致血管充盈，放入37℃无菌的D-Hanks液中，消化15min 后取出。 d．收集血管内酶溶液，并且注入含20%小牛血清的M199培养液（pH 7.2）冲洗血管收集合并于同一容器内，以1000r/min离心7～10min。 e．去上清液，加入20%小牛血清的M199培养液重新悬浮细胞备用。 f．其它大血管如牛主动脉，猪主动脉等，可在无菌下分离，然后用线结扎血管各分支，再依上述步骤分离EC。 2.2.2 酶消化法小血管内皮细胞的分离 2.2.2.1 兔主动脉，大鼠主动脉因血管较小，分支极细，不能采用上述方法消化。 a．将动物主动脉取出后放D-Hanks中，将血管外的脂肪细组织分离干净，用丝线结扎血管一端，然后用探针顶住该端，将整条血管翻转，使内膜翻在外面。将另一端折入腔内0.5cm，并用丝线结扎紧，以防外膜外露及避免酶液进入外膜腔内。 b．用D-Hanks液清洗干净外翻的内膜面，然后血管浸泡在含0.1%胶原酶溶液的小瓶内，盖上瓶盖在37℃水浴中轻轻摇荡消化，使EC离散下来，消化15～20min后，见酶液稍有混
实验动物大鼠原代脑微血管内皮细胞
实验动物（大鼠）原代脑微血管内皮细胞 产品编号：RAT-iCELL-n001 产品规格：>5×105细胞数 产品价格：3750 包装规格：T-25培养瓶 细胞详述： 脑微血管内皮细胞是血脑屏障的主要组成成分，能够限制可溶性物质和细胞等从血液进入大脑。大脑微血管内皮细胞与外周内皮细胞相比具有一些相同特性。 脑微血管内皮细胞存在许多细胞间紧密连接，产生很高的跨内皮阻抗，延迟细胞旁的通量；脑微血管的内皮细胞间衔接得十分紧密，不象其他组织的血管内皮细胞那样有较大的缝隙脑微血管内皮细胞缺乏内皮细胞的窗孔结构，其液相物质胞饮水平较低；脑微血管内皮细胞具有不对称定位酶和载体介导转运系统，从而产生“两极分化”的表现型。与外周内皮细胞相同，大脑微血管内皮细胞表面表达细胞粘附分子，调控白细胞进入大脑。由于微血管内皮细胞的器官特异性，内皮细胞通常取源于疾病研究的相关组织。 细胞特性: 1)组织来源于实验动物的脑动脉组织。 2)细胞鉴定：血管假性血友病因子（vWF）免疫荧光染色为阳性。 3)经鉴定细胞纯度高于90%。 4)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。 5)细胞生长方式：铺路石状细胞，不规则细胞，贴壁培养。 产品的运输和保存：
视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。 1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进 行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。 2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生 长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。 推荐培养基： 我们推荐使用iCell原代内皮细胞培养体系（产品编号：PriMed-iCELL-002）作为体外培养原代脑动脉血管内皮细胞的培养基。 产品使用： 1)本产品仅能用于科研 2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核 3)本产品未通过用于活体诊断的审核
血管内皮细胞培养
血管内皮细胞（endothelial cell, EC）体外培养 1．概述血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第Ⅷ因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。体外培养中的EC形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。 2．培养方法EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。 2.1 方法原理用酶消化法，酶消化＋机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。 2.2 介绍几种主要EC的分离 2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离 2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管） a．在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。 b．在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。
脂肪干细胞的提取及鉴定
脂肪干细胞的提取及鉴定 一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定 1、实验技术及原理: 运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。 2、实验用品: 2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠 2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M 2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗 3、细胞培养的方法与步骤:
树突状细胞培养与鉴定
树突状细胞的培养与鉴定 【摘要】目的研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子gm-csf和il-4联合诱导使之分化为树突状细胞（dendritic cells, dcs）的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的dcs的培养方法。方法通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。在细胞因子gm-csf和il-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。结果在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。流式分析发现细胞高表达dc表面特异性抗原 cd80，cd86，hla-dr，并且不再表达单核细胞表面抗原cd14，细胞纯度约为93.12%。淋巴细胞增殖实验显示dcs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。结论通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用 gm-csf和il-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。【关键词】树突状细胞；磁珠；流式 molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes. 【abstract】 objectives：to develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (dcs) from highly purified cd14 + monocytes from human peripheral blood. methods：monocytes were purified by negatively sorting
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定 【摘要】目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞，接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，绘制细胞生长曲线，分析细胞周期，检测细胞表面抗原。结果采用Percoll(1.073 g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期，至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%～70%细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定，可作为组织工程的种子细胞。 【关键词】脐血;间充质干细胞;细胞周期;免疫细胞化学 Abstract: Objective Isolation and cultivation of mesenchymal stem cells (MSCs) in human umbilical cord in vitro, and determine their biological properties. Methods The mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from human umbilical cord blood in sterile condition, and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After the adherent mononuclear cells were obtained, the shape of cells were observed by microscope, then the cell growth curve, the cell cycle and the cell surface antigens were obtained by immunocytochemistry and flow cytometry methods. Results MSCs obtained by Percoll (1.073 g/mL) were similar in size, spindle-shaped or star-shaped fibroblasts-liked cells. Cell growth curve analysis indicated that MSCs were in the exponential stage after 5d and in the stationary stages after 9d. Flow cytometry analysis showed that the CD29 and CD44 positive cells were about 50%～70%. Conclusions The human umbilical cord derived mesenchymal stem cells were grown stably in vitro and can be used as the seed-cells in tissue engineering. Key words:human umbilical cord blood; mesenchymal stem cells; cell cycle; immunocytochemistry 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞来源。寻找来源丰富并不受伦理学制约的间充质干细胞成为近年来的研究热点[1]。脐血(umbilical cord blood, UCB)在胚胎娩出后，与胎盘一起存在的医疗废物。与骨髓相比，UCB来源更丰富，取材方便，具有肿瘤和微生物污染机会少等优点。有人认为脐血中也存在间充质干细胞(Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)。如果从脐血中培养出MSCs，与胚胎干细胞相比，应用和研究则不受伦理的制约，蕴藏着巨大的临床应用价值[2,3]。本研究将探讨人UCB-MSCs体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面，分析UCB-MSCs 作为间充质干细胞来源的可行性。
稳定表达核仁素的H9C2细胞株的建立和鉴定
中的作用提供细胞模型。方法：将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞，使核仁素在细胞内表达，用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株；用双酶切、DNA测序鉴定质粒，用RT-PCR及Western blot检测核仁素基因在靶细胞中的整合与表达。结果：经G418反复筛选的H9C2细胞株中，核仁素基因在mRNA及蛋白质水平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高。结论：用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠心肌细胞，经筛选后可稳定表达核仁素。 【关键词】核仁素；H9C2细胞；基因转染 Abstract Objective:To establish H9C2 cell line that can stably express the nucleolin,whi ch can provide a cell line with which we can analyze the function of nucleolin in apopto sis of cardiomyocytes.Methods:The pCMV-Tag2B-Nuc plasmid was transfected into H9C2 cells with lipofectin,the stable transfectants screened by G418 and the expression of nucleo lin was identified and analyzed by RT-PCR and Western blot.The pCMV-Tag2B-Nuc plas mid was confirmed by double-enzyme digestion and sequencing.Results:After G418 screeni ng, compared with the control group,the mRNA and protein of nucleolin in transfected cel l line were highly expressed, as demonstrated by the RT-PCR and Western blot analysis.C onclusion:The rat H9C2 cell line stably expressing nucleolin was successfully constructed. Key words Nucleolin; H9C2 cell line; Gene transfection 近年来的研究表明，越来越多的心血管疾病发生发展与细胞增殖和凋亡有关。细胞凋亡的发生机制十分复杂，至今仍未完全阐明。核仁素（又称C23）是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质，具有多种生物学功能，它不但直接参与核糖体的生物合成与成熟，还直接或间接参与细胞增殖、生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制与核仁的发生等过程［１］。另有研究表明，核仁素蛋白的断裂和转位改变与细胞凋亡的发生相关［２，3］。因此，本研
小鼠心肌微血管内皮细胞使用说明
小鼠心肌微血管内皮细胞 小鼠心肌微血管内皮细胞产品说明: 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠心肌微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠心肌微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠心肌微血管内皮细胞产品简介: 1、产品名称：小鼠心肌微血管内皮细胞 2、组织来源：小鼠心肌血管组织 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠心肌微血管内皮细胞简介： 小鼠心肌微血管内皮细胞分离自正常小鼠心肌血管组织，血管内皮细胞密切参与包括再生、发育、伤口愈合等一系列生理及炎症反应。 本公司生产的小鼠心肌微血管内皮细胞，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达80%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。 小鼠心肌微血管内皮细胞培养基信息：
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
ERGIC3的稳定表达细胞株的建立与鉴定
ERGIC3的稳定表达细胞株的建立与鉴定 郑翔，刘兴宇，李学英，吴明松* （遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室，贵州遵义563000） [摘要] 目的构建ERGIC3基因的真核表达载体，通过将载体转染支气管上皮细胞株BEAS-2B，筛选并建立ERGIC3稳定表达的细胞株，为进一步研究ERGIC3在肺癌中的作用奠定基础。方法采用RT-PCR方法获取人类ERGIC3基因的ORF 框的DNA序列；构建逆转录病毒载体pLXSN-ERGIC3，用PT-67细胞包装后获得病毒颗粒；用病毒颗粒感染BEAS-2B细胞；通过G418筛选获取整合了外源基因ERGIC3的细胞；单克隆化成为稳定转染ERGIC3细胞株；然后用定量RT-PCR和Western blot进行鉴定后，用划痕实验研究稳定转染细胞株的迁移能力和形态学变化。结果获得了4个ERGIC3稳定表达细胞株，这些细胞株的ERGIC3表达量远高于对照组细胞。稳定转染细胞株的迁移能力显著增强（P<0.05）。结论成功的构建了ERGIC3基因的真核表达载体pLXSN-ERGIC3；筛选出ERGIC3基因稳定转染支气管上皮细胞株且其迁移能力明显增加。 [关键词] ERGIC3；稳定转染；真核表达；肺癌 [中图分类号] Q782[文献标志码] A Construction and identification of cell lines with ERGIC3 gene stable transfection ZHENG Xiang, LIU Xing-yu, LI Xue-ying, WU Ming-song (Department of Cell Biology and Genetics, Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563000, China) [Abstract]Objective To construct a eukaryotic expression vector carrying human gene ERGIC3 and to obtain human bronchial epithelial cell line stably transfected with ERGIC3, which provides the foundation of ERGIC3 in lung cancer. Methods The pLXSN retroviral vector was inserted the DNA fragment of open reading frame sequence (ORF) of gene ERGIC3 which obtained by PCR method. After the constructed pLXSN vector was transfected into the packaging cell, PT67 cell line for 48 hours, the replication-incompetent retroviral particles were harvested and infected the BEAS-2B cells. Screened with G418，the single cell clones were sought out and cultured which were stable transfection cell lines. Then the migration of the cell lines was tested by wound healing scratch assay. Results The vector carrying ERGIC3 was successfully constructed and 4 stable transfection cell lines were obtained, as well as the ERGIC3 expressions were higher than the control by real-time PCR and Western blot. The ability of the stable transfected cell line with ERGIC3 was significantly faster than the control cell (P<0.05). Conclusion The stable cell lines with expression [基金项目] 贵州省科学技术基金（黔科合J字[2013]2319号）；遵义医学院博士启动基金（F-655）。 [通讯作者] 吴明松，男，博士，研究方向：肿瘤细胞分子生物学，E-mail： hanyue4187@https://www.wendangku.net/doc/ff17318089.html,。
小鼠视网膜微血管内皮细胞使用说明
小鼠视网膜微血管内皮细胞 小鼠视网膜微血管内皮细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠视网膜微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠视网膜微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠视网膜微血管内皮细胞产品简介： 1、产品名称：小鼠视网膜微血管内皮细胞（Mouse Retinal Microvascular EndothelialCells） 2、组织来源：小鼠视网膜组织 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠视网膜微血管内皮细胞简介： 小鼠视网膜微血管内皮细胞（Rat Retinal Microvascular Endothelial Cells）来源于成年小鼠视网膜组织，其是组成血管腔面单层扁平上皮样细胞，它所产生和分泌的生物活性物质对维持血管张力，调节血压，抗血栓形成等有重要作用，在视网膜血管疾病的发病机制中有重要病理生理学意义。 本公司生产的小鼠视网膜微血管内皮细胞采用胶原酶消化和密度梯度离心制备而来，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达85%以上，且不含有