MAZ基因启动子区顺式作用元件的EMSA分析
目录
中文摘要.......................................................................................................................................I 英文摘要.......................................................................................................................................I 常用缩写词中英文对照表.......................................................................................................III 缩写名词附表............................................................................................................................IV 前言. (1)
1材料 (3)
1.1主要仪器 (3)
1.2主要试剂及耗材 (3)
1.3主要配制试剂 (4)
2方法 (6)
2.1方法设计思路 (6)
2.2实验流程 (6)
2.3THP-1细胞的培养及核蛋白的提取 (7)
2.3.1THP-1细胞的复苏 (7)
2.3.2THP-1细胞的换液与传代培养 (8)
2.3.3THP-1细胞的冻存 (8)
2.3.4THP-1细胞核蛋白的提取 (8)
2.3.5BCA法测定核蛋白浓度 (9)
2.4MAZ启动子区转录因子结合位点的预测及screen探针设计 (9)
2.5Screen probe的EMSA试验 (12)
2.5.1生物素标记探针 (12)
2.5.24.9%聚丙烯酰胺凝胶的制备 (12)
2.5.3EMSA结合反应——探针与核蛋白的结合 (13)
2.5.4聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 (13)
2.5.5转膜及紫外交联 (14)
2.5.6化学发光法检测生物素标记探针 (14)
2.6突变探针的设计及EMSA实验 (15)
2.7竞争性EMSA试验 (18)
3结果 (20)
3.1MAZ启动子区转录因子结合位点的软件预测结果 (20)
3.2Screen probe的EMSA鉴定结果 (21)
3.3Mutant screen probe的EMSA鉴定结果 (22)
3.4Second mutant screen probe15的EMSA鉴定结果 (23)
3.5Screen probe15的竞争性EMSA结果 (24)
4讨论 (26)
4.1MAZ启动子区DNA序列的EMSA鉴定结果 (26)
4.2EMSA试验成功的关键因素 (29)
4.3EMSA技术的局限性 (31)
4.4PROMO对转录因子结合位点的预测 (31)
5结论 (33)
参考文献 (34)
综述 (39)
致谢 (48)
在学期间承担/参与的科研课题与研究成果 (50)
个人简历 (51)
山西医科大学硕士学位论文
MAZ基因启动子区顺式作用元件的EMSA分析
摘要
目的：
MAZ参与细胞生理、病理状态下多种基因的转录调控，被调控的基因如基质金属蛋白酶、血清淀粉样蛋白A等与类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心脏疾病、癌症等疾病的发生密切相关。目前研究报道多集中于MAZ介导下游基因的表达调控，而有关MAZ基因的转录调控的研究较少见。该基因的转录受到其启动子区的调控，多种转录因子参与其中。因此，本课题旨在通过对MAZ基因启动子区DNA序列进行转录因子结合位点分析，以发现潜在的转录因子顺式反应元件，并通过突变、竞争及EMSA技术研究这些顺式元件，为揭示MAZ基因转录调控机制奠定基础。
方法：
1.抽提细胞核蛋白：培养THP-1细胞，收集细胞，使用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒提取核蛋白，并通过BCA法进行蛋白定量。
2.设计探针及生物素标记：通过PROMO软件分析MAZ基因转录起始点上游948bp DNA序列潜在的转录因子结合位点，设计覆盖该序列的探针，并进行生物素标记。
3.EMSA试验：标记探针与核蛋白进行结合反应，电泳分析，转膜及化学发光显色。
4.设计突变探针并进行EMSA分析。
5.使用明确的转录因子结合元件进行竞争性EMSA分析。
结果：
1.本试验研究的MAZ基因启动子区DNA序列可能结合转录因子有40种之多，设计的32条探针仅有11条出现明显的DNA与蛋白结合条带。
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