全长cDNA的获得_RACE及其他方法进展
全长cDNA酶切和连接体系
用测序时所构建的各片段重组质粒作模板，用新合成的加有连接酶切位点的引物扩增出需要连接的各片段。LF1在扩增时，由于片段比较长，故分为两步进行扩增，第一步扩增后，连接到pMD-18T载体上，再用此作模板进行第二次扩增。得到所需的加有酶切位点和启动子序列的目的片段，再将其克隆到pMD-18T载体上。使用时每次从载体上切取目的片段进行连接。 F5、F6和F7片段的连接，F5(Not I/ Fsp I)、F6(Fsp I/Csp45 I)、F7(Csp45 I/Sal I)分别进行酶切，将载体pGEM5zf同时进行Not I/Sal I双酶切，分别将各酶切产物进行纯化回收。由于F5片段和载体pMD18-T大小相近，故无法回收酶切后的目的片段，所以F5片段直接采用 酶切buffer F5用buffer D、F6用buffer B、F7用buffer D F21和F22的连接，将F21和F22 PCR测序片段分别用Nhe I酶切后，回收目的条带，将二者用T4 DNA酶连接后，克隆到T-easy载体上。即为连接全长所用的F2片段。连接时，直接用设计时的两端酶切位点。 LF3和LF4同样用Acc III酶切后，用T4 DNA连接酶连接，再克隆到pMD-18T载体上，用于5’半长的连接。 F21、F22连接酶切体系： Nhe I 1μl；10×M buffer 2μl；DNA 17μl； F3、F4连接酶切体系： Acc III 1μl；10×F buffer 2μl；BSA 0.2μl；DNA 16.8μl。 37℃3h酶切。纯化回收时，注意各种限制性酶的灭活(65℃,10min)。 连接体系： T4 DNA连接酶buffer 2μl；T-easy(F2) or pMD-18T(F34) 2μl；回收DNA片段15μl；T4 DNA连接酶1μl。16℃6h，再4℃过夜。转化感受态JM109。
cDNA文库
cDNA文库 以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的c DNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。 [编辑本段] cDNA文库 真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难. 高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mR NA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多. 定义: (cDNA Library) 某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组,储存于某种受体菌中,该群体就称该生物基因组的cDNA文库. 原理 :将带poly(A)的mRNA经酶促反应转变为双链DNA,再与原核载体连接. 一,制备用于克隆cDNA的mRNA 1,mRNA的制备 动物细胞mRNA的制备 植物细胞mRNA的制备 2,mRNA的来源 选用mRNA含量高的组织材料,或通过药物等方法提高mRNA的含量 3,mRNA完整性的检测 1)mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(C ell-free translation system)，又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为"溶胞粗制品翻译系统". 无细胞提取物的制备: 用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心出去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统.
构建全长cDNA文库
构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。无论怎样，应当注意如下几个方面： 一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA 后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA 相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。 二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。 三、反转录后至包装到噬菌体外壳蛋白之前的诸多步骤的操作相对容易，但其中的层析柱cDNA分级很关键。这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。这一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。获得的每一级的cDNA量很少，检测时带型很暗，所以要用新鲜做的透明薄胶检测，根据检测结果一定要舍弃太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因为短片段太多会严重影响后面的连接转化效果及文库质量）。 四、噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率高低直接关系到文库构建是否成功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。一般的片段克隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的目的DNA连接，目的基因cDNA长的有10kb以上，短的只有500bp或更短。一系列长度不等的cDNA与载体在一起连接的结果，不同长度cDNA的连接效率就不一样。有的专家的经验是，根据分级结果，有意识地将长度不同的cDNA群分别与载体连接，再分别转化或转染大肠杆菌，分别完成滴度检测，最后将不同长度级别的文库混合在一起供杂交筛选。
全长cDNA文库的构建—SMART技术
【共享】全长cDNA文库的构建—SMART技术 全长cDNA文库的构建—SMART技术 真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA 的末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。 常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。 SMART技术的出现是一个新的里程碑。这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA 单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5'帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。 这个专利的方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，只要单管，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA 库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA（RACE），和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。 我们在这里分别介绍几个采用SMART技术的产品： 一、SMART PCR cDNA Synthesis Kit 这个试剂盒是采用SMART技术将少至25ng的mRNA或者50ng的Total
全长CDNA克隆方法
全长CDNA克隆方法 以MITF基因为例,简述全长CDNA克隆的方法. 方法分三步: 1.克隆中间片段 2.克隆3’片段 3. 克隆5’片段,然后再将3者重复序列删除,拼接起来. 1.中间序列克隆 提取锦鲤的皮肤组织的mRNA,然后跑胶检测。如果有2根带,则显示mRNA 提取成功. 然后反转录成CDNA，检测B-actin。 首先在NCBI上查找mitf基因,获取该基因的序列,CDS区,基因编号.并且保存,以备以后比对序列用.选取斑马鱼的mitf a 为模板. 引物合成:用Primer 5设计 a.引物长度:长度一般在18-30个碱基。一般都是18-24个左右。 b.GC含量：一般引物GC含量为40%-60%，一对引物的GC含量和TM值要协调。 如果引物存在严重的GC或者AT倾向，可以在引物最后加适当A.T.C.G尾巴c.退火温度：退火温度需要比解链温度低5度。适当提高引物退火温度可以使 PCR的特异性增加。一般设计一对引物的TM值应该要比较接近，一般在0-4度以内，不会影响PCR的产率。温度在55-75度之间。 d.避免扩增模板的二级结构区域，一对引物之间不应该存在4个连续碱基的同 源性或者互补性。选取时尽量选取分高的组合。 设计引物时，尽量增加克隆的中间片段长度，为避免5‘和3’克隆出现长片段。 引物设计好以后，根据引物的TM值，首先设计温度，做梯度PCR. 比如TM为65度，设计梯度时可以设计63,64,65,66. 4个梯度。然后根据跑胶结果确定大体系的TM值，如有目的带，直接胶回收。然后进行链接，转化。送公司测序。 测序结果出来后，用Chmas软件打开，并将其转化为TXT格式的碱基序列。 用Jellyfish里面，找特异性的正向，反向引物。找完正向后，将序列反过来再找反向引物。只有都能找到2个引物的序列才能算测序成功。将特异性引物两端的序列全部删除，（那是对应载体的序列）。保存克隆的中间序列，然后跟斑马鱼的序列对比，一般重复性在90%以上。若有几组序列满足要求，用着几组进行对比突变的地方按照重复多的碱基最为标准。尽量选2组以上序列。 2. 3‘克隆 克隆3‘的时候要重新用mRNA做反转录，在做反转录的时候要加上3‘接头。（接头由自己合成）。 设计引物：正向的外侧引物和内侧引物 反向的UPM和NUP 一般设计特异性引物的TM值为接近60度，最后60度以上。 首先用外侧引物和UPM做10ul体系的下体系。然后用其PCR产物模板稀释10-40倍。用作内侧引物+NUP的PCR反应模板。做大系统检测最适合TM值。找到以后直接进行胶回收，链接转化，测序。 第一轮的TM值需要摸索，第一轮以后通常是弥散的条带。如果多次尝试还是不
全长cDNA主要构建方法的比较
全长cDNA主要构建方法的比较 摘要全长cDNA文库的构建是进行功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径,克服了传统cDNA 文库的缺点,本文主要介绍了两种较为实用的方法，分别是SMART法和Cap trapper法。 关键词：全长cDNA构建SMART法Cap trapper法 随着测序技术和计算机科学的不断发展，大部分生物和人类的基因组全序列测定高速完成。cDNA作为基因克隆的一种重要工具，在帮助人们更好的发现新基因和研究基因功能上发挥了巨大的作用。但是，由于传统的cDNA由于反转录能力差，cDNA酶切位点保护不彻底和非cDNA片段插入导致克隆片段短、无效克隆多和全长率低等缺点,因而无法满足大规模、高通量、高效的功能基因组研究需要。而全长cDNA序列大多数拥有5’和3’端非编码区序列,因而弥补了传统cDNA文库构建方法的缺陷,成为目前基因克隆的一种重要方法。 目前主要有CAPture法，Oligo capping法，SMART法，Cap jumping法以及Cap trapper 法。本文主要介绍优点突出的两个方法，SMART法和Cap trapper法。
SMART 方法 SMART 方法是Chenchik 等1996 年提出的[3]，该方法利用PowerscriptTMRT 反转录酶的反转录、末端转移活性和内切酶sfiⅠ的特性，快速、简单地构建全长cDNA 文库。PowerscriptTMRT 反转录酶是M-MLVR点突变而来的，丧失了RnaseH 的活性，但保留着野生型聚合酶转移酶的活性，能够长距离的反转录，又可识别mR-NA5’帽子结构。原始一链合成中，转移酶的活性低，延伸效率低。用于反转录的5’端poly(A)引物和延伸模板分别含有sfiI（A）、sfiI（B）识别位点的寡聚核苷酸序列。而截短的一链cDNA，反转录酶没有识别到mRNA5’帽子结构，一链cDNA3/ 端不能被延伸、合成和扩增二链。两端含有sfiI 识别位点的全长cDNA，经两种类型（A、B）内切酶sfiI 酶切，使两端产生不同的粘性末端，而全长cDNA 内部由于sfiI 识别位点在基因组中很少见而得以保护，这样就实现了目的全长基因的高效定向克隆。与其他方法相比，此方法有其独特的优点（1）所需起始材料少，一般0.5~1μg mRNA（2）mRNA 在合成cDNA 前无需任何酶反应或化学反应处理，不会导致处理过程中mRNA 的降解和损耗。（3）实验过程快速、简单，整个过程没有对mRNA 和中间产物的复杂处理。（4）全长比例较高[13]。SMART 方法也有其自身明显的缺点（：1）PCR 扩增具有选择性，不利于长片段序列的扩增，使一些长片段的全长基因丢失，不易得到大于3kb 片段和低峰度 全长基因[13]2）dG 加尾效率低，导致文库中基因信息丢失，文库缺乏代表性。在实际应用中，该方法快速、简单的优点使之广受青睐[14~17]，尤其是在医学领域中应用较广[18~20]。 4 CAP- trapper 方法
构建cDNA文库应注意的事项
构建全长cDNA文库时应当注意事项 构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。但都应当注意以下四个方面： 一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。 构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。 二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。 这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。
全长cDNA在功能基因组学中的意义
全长cDNA在功能基因组学中的意义 cDNA（complementary DNA）是指从mRNA反转录而得到的DNA，是mRNA的一个可靠的拷贝。由于cDNA已经经过了剪接，而且含有完整的CDS，因此cDNA是研究基因功能以及基因结构的重要资源。采用一般的方法构建的cDNA文库，其全长的比例往往比较低，主要是因为在cDNA第一链的生成过程中，反转录酶在还没有生成完整的第一链的情况下就脱离了反应，以致得到不完整的cDNA。CDNA第一链的生成一般使用polyT作引物，因此，一般cDNA文库中，含有大量的3’端EST，而mRNA5’端的信息较少。但在功能基因组的研究中，5’端序列更有意义。因此，构建富含全长的cDNA克隆的文库显得更加重要。 1富含全长cDNA的文库的构建 （sequence 全长cDNA就是含有完整的3’和5’端的cDNA，mRNA的3’端具有polyA作为“标签序列” tag）用于辩别mRNA或cDNA是否含有完整的3’端。在生成第一链cDNA的过程中一般采用polyT 作引物，所以，得到的cDNA克隆一般都含有完整的3’端。mRNA的5’端与3’端不同，它没有高度保守的序列可用作“标签序列”来通过DNA/DNA或DNA/RNA杂交进行5’端鉴定，只有帽子结构（CAP）。因此为了分离到全长cDNA克隆，研究者一般利用“帽子结构”在mRNA的5’端加上一段序列或者其他标记物。 1．1．1 常规方法 这里说的常规方法，也就是够建一般的cDNA文库所采用的方法。分离出mRNA后，以mRNA为模板、带接头的polyT作引物合成第一链cDNA，再以用第一链作模板合成双链cDNA，加上5’端接头，便可连到载体上。 1．1．2 Oligo—CAP的方法 Oligo—CAP的方法是在mRNA的5’端加上一段寡核苷酸取代5’CAP。具体过程如图1所示。其原理是在BAP（bacterial alkaline phosphatase）和TAP（tobacco acid pyrophosphatase）的作用下，完整的mRNA（含CAP）的5’端的G被切除，剩下一个一个磷酸基团，可以在RNA连接酶的作用下与Oligo adapter连接；而不含CAP的mRNA的5’端则是一个羟基，无法与Oligo adapter连接。这样，mRNA的5’端也有了可识别的“标签序列”。 1．1．3 CAP—Select的方法 如图2所示，在生成cDNA第一链时，引物中带锚定序列，同时加入MnCl2。在MnCl2存在时，反转录酶会在有CAP的mRNA为模板的第一链cDNA的3’端加上三至四个dCMP，然后在末端转移酶的作用下加上三到四个dAMP，在3’端形成一粘端。这样，在RNA连接酶的作用下加上3’接头。这样，在5’和3’端都有特异的序列用于PCR扩增及全长cDNA的筛选。 1．1．4 CAP—Traper select的方法
CDNA文库构建的注意
构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二 者大同小异。无论怎样，应当注意如下几个方面：一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot 的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA 进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不 是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子 要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这 是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录， 则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的 一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。 反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相 当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少 部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而 很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手
关于cDNA文库
1 cDNA 文库的构建 1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的cDNA 文库，获得高质量的mRNA 是至关重要的，所以处理mRNA 样品时必须仔细小心。由于RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA 酶的环境对于制备优质RNA 很重要。在获得高质量的mRNA 后，用反转录酶Oligo(dT) 引导下合成cDNA 第1链，cDNA 第2链的合成(用RNA 酶H 和大肠杆菌DNA 聚合酶I，同时包括使用T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA 连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链DNA 克隆到载体中去、分析cDNA 插入片断，扩增cDNA 文库、对建立的cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是λ 噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。 1.2 cDNA 全长文库 经典cDNA 文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上的DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的cDNA。为了克隆到真正的cDNA 全长，建立富含全长的cDNA 文库具有重要意义。为此，必须克服仅用mRNA 的PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长cDNA 文库，是指从生物体内一套完整的mRNA 分子经反转录而得到的DNA 分子群体，是mRNA 分子群的一个完整的拷贝。全长cDNA 文库不仅能提供完整的mRNA 信息，而且可以通过基因序列比对得到mRNA 剪接信息，此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。目前所报道的对全长文库的构建一般按照美国CLONTECH 公司的SMART cDNA Library Construction Kit 方法或GeneRacer 试剂盒(Invitrogen，USA) 使用说明进行。判断一个cDNA 文库中的cDNA 序列是否是全长基因的cDNA，主要方法有以下几种。 1.2.1 直接从序列上评价
cDNA获取方法
索取条款 本着科研工作者之间互通有无的原则，非营利性质的研究机构的科研人员可向本实验室索取我们收集的人类全长cDNA，请在索要cDNA前，详细阅读本索取条款。 1.索取人不得将cDNA转让于第三方或用于商业用途。 2.按照本实验室提供的方法，索取人可以使用PCR方法方便快速地克隆相应 基因，但我们不能保证所提供的cDNA一定能够满足索取人的实验要求，不过我们欢迎索取人的反馈。 3.本实验室收集的cDNA数量众多，信息繁杂，不便查询，无法提供除cDNA 序列以外的任何信息，请勿询问。 4.本实验室对提供cDNA不收取任何费用，请索取人自付邮资（邮资到付）。 此外，因本实验室人力有限，索取的样品一般情况下不能多于10个/次，如有特殊需求，可以直接跟我们联系协调。本实验室每周寄出一至两次样品，在寄出样品后，我们会邮件通知。本校实验室凭打印的邮件直接来本实验室领取。 5.通过该网站仅能索取我们收集的cDNA，如需要我们发表的文章中所用到的 质粒，请另外来信索取。 6.请严格按该方法通过PCR来扩增cDNA，否则可能将无法得到需要的cDNA。
cDNA获取方法 本实验室提供的cDNA样品为100 μL含抗生素的菌液。收到菌液后，请先确认菌液是否浑浊，若菌液澄清，请先在37度摇床上过夜培养后再使用。另外，由于我们在建库时，每管中可能含有不只一种cDNA，因此不推荐将菌液在平板上划线后挑取单克隆进行扩增。根据我们的测试，使用此方法获取目的cDNA的概率达95%以上。 具体方法如下： 1.取1 μL菌液为模板，PCR扩增全长cDNA。我们网站上的核酸序列为cDNA的实际序列，因此设 计引物时，请严格按照我们提供的序列设计引物。 PCR体系一定要有去污剂（如，Triton X-100），我们推荐的PCR体系如下： 菌液模板 1 μL 10× PCR buffer 5 μL 10 mM dNTP mix 1 μL 10 μM Forward Primer 1 μL 10 μM Reverse Primer 1 μL Taq 2.5 U H2O 至总体积50 μL 提示： 1)实际上，很多（但不是全部）商业化的高保真酶同样可以用来扩增该cDNA，但是必须确保反应的体系中含有去污剂。 2)若使用其它PCR反应体系无法得到所需cDNA，请按上述推荐体系重新进行一次PCR。 3)若使用上述推荐体系仍无法得到所需cDNA，在我们实验室，我们采用北京全式金生物技术有限公司的TransStart Taq DNA Polymerase（货号AP141），按照公司附带的说明书使用，可以获得很好的效果。 4)若用以上方法仍无法扩增出所需cDNA，可取10 μL菌液接菌至1.5 mL含抗生素的LB中过夜培养后提取质粒，再进行PCR。 5)若仍无法得到所需的cDNA，请更换另一种DNA聚合酶或PCR缓冲液重新尝试，或更改PCR引物。 2.用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，即可获得全长cDNA。