酵母菌鉴定试剂盒(比色法)说明书

生物化学实验报告-酵母RNA的提取与鉴定

实验五酵母RNA的提取与鉴定 一、实验目的 1.掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。 2.了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。 二、实验原理 1.酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于2%。 2.RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。 3.用碱液提取的RNA有不同程度的降解 三、实验仪器 1.离心机 2.水浴锅 3.电炉 4.烧杯 5.量筒 四、实验试剂 1.干酵母粉 2.0.2%氢氧化钠溶液：2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 3.乙酸 4.95%乙醇 5.无水乙醚

6.10%硫酸 7.氨水 9.5%硝酸银溶液：5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。 1.苔黑酚-三氯化铁溶液： 将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl 3.6H2O。 临用时配制。 五、实验步骤 1.RNA的提取： （1）称取2g干酵母粉于100ml烧杯中，加入 0.2%氢氧化钠溶液10ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌（如沸水浴过程中溶液蒸干可再加5~10ml氢氧化钠）。然后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（pH 试纸检验），离心10-15分钟（4000r.p.m）。 （2）取上清液，加入2倍体积的95%乙醇，边加边搅，加毕，静止，待完全沉淀，过滤。 （3）滤渣先用95%乙醇洗2次，每次约5毫升，再用无水乙醚洗2次，每次也约5ml。 （4）洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可鉴定。 2.鉴定： （1）取上述RNA约 0.5g，加10%硫酸5ml,加热至沸1—2分钟，将RNA水解。

3种酵母样真菌鉴定方法的比较

1　进修生 收稿日期:2001-04-103种酵母样真菌鉴定方法的比较农生洲　韦柳宏1　陈松峰 (广西壮族自治区人民医院检验科　南宁　530021) 为综合评价目前我国实验室常规手工发酵鉴定法(常规法)、生物梅里埃A T B Fug us卡鉴定法(仪器法)和近年国内开始应用的科玛嘉(CHRo M ag ar)酵母样真菌显色培养基鉴定法(显色法)等3种酵母样真菌鉴定方法的优劣。我们同时用这3种方法对实验室保存的122株酵母样真菌标准菌株进行了鉴定比较,报道如下。 1　材料与方法 1.1　菌株来源:122株实验菌为实验室历年保存的标准菌株,其中白假丝酵母菌53株,热带假丝酵母菌31株,光滑球假丝酵母菌18株,近平滑假丝酵母菌11株,克柔氏假丝酵母菌3株,季也蒙假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌各2株,粘红假丝酵母菌、酿酒假丝酵母菌各1株。 1.2　试剂:沙氏培养基和各种手工用发酵管均购自杭州天和微生物试剂公司;Fug us卡及其配套仪器A T B Ex pressio n 为法国生物梅里埃公司产品;显色培养基则购自郑州搏赛科技有限责任公司。 1.3　鉴定方法:常规法鉴定按卫生部医政司颁发的《全国临床检验操作规程》进行;Fug us卡法按配套的操作手册取菌制成悬液,加样后置37℃培养24h后上机鉴定;显色法则取F ugus卡法剩余的悬液直接接种于显色培养基制成的平板上,置37℃培养,每隔24h观察一次结果,据菌落颜色进行判定;翠绿色为白假丝酵母菌,兰灰色为热带假丝酵母菌,紫红色边缘模糊有微毛为克柔氏假丝酵母菌菌,整个菌落湿润且紫红色为光滑球假丝酵母菌,白色为其它假丝酵母菌。 2　结　果 2.1　培养鉴定耗时:常规法和仪器法需预先用沙氏培养基培养出真菌,平均耗时大约72h,再加上鉴定耗时又分别平均约需72h和24h,常规法培养鉴定总共平均约需6d,仪器法约需4d;显色法集培养与鉴定于一体,耗时平均约需4 d。 2.2　鉴定结果:122株酵母样真菌的鉴定中,三法对53株白假丝酵母菌鉴定全部正确。其它69株菌中,常规法有11株无法鉴定到种,占总株数9.0%(11/122)。此外有5株热带假丝酵母菌鉴定错误,3株错定为光滑球假丝酵母菌,2株错定为近平滑假丝酵母菌。有3株光滑球假丝酵母菌鉴定错误,1株误定为热带假丝酵母菌,2株误定为近平滑假丝酵母菌。有2株近平滑假丝酵母菌鉴定错误,1株误为热带假丝酵母菌,1株误为光滑球假丝酵母菌。除无法鉴定到种的11株菌后,鉴定错误率仍有9.0%(10/111);显色法对白假丝酵母菌等该法能鉴定的6种酵母样真菌鉴定准确率达100%,其它菌株却无法鉴定到种,占总株数4.1%(5/122); F ugus卡法全部菌株均可鉴定到种,且准确率达100%。详见表1。 表1　122株酵母菌样真菌3种方法鉴定结果比较(株) 菌名菌株数常规法显色法仪器法 白假丝酵母菌　53　53　53　53 热带假丝酵母菌31273131 光滑球假丝酵母菌18171818 近平滑假丝酵母菌11111111 克柔氏假丝酵母菌3133 粘红假丝酵母菌1111 季也蒙假丝酵母菌2102 葡萄牙假丝酵母菌2002 酿酒假丝酵母菌1001 2.3　成本核算:常规法鉴定每一株菌平均约需10元,仪器法平均约需50元,显色法平均约需15元。 3　讨　论 当前酵母样真菌引起的临床感染正呈逐步增加之势,临床医师急需实验室准确快速地检出病原体以协助诊治[1]。纵观本试验结果,加上预先真菌培养时间常规法鉴定耗时总共需要至少6d左右,且操作繁琐,生化结果判定较困难,即使是标准菌株,结果仍极易出错。而如F ugus卡等仪器测试卡法,虽然鉴定耗时较短,操作也简便,鉴定结果准确率又高且可配套进行体外药敏试验,但因仪器和试卡均为进口产品,价格昂贵,只适合在有大量标本的大型综合性医院应用。从本研究可看出,显色法培养加鉴定耗时平均仅需48h,与应用仪器法耗时基本相等,且培养基制备方便,价格适中,结果判定简便快速准确,虽然有一部分菌株无法鉴定到种,但已能鉴定出目前临床感染95%以上的3～4种酵母样真菌感染[2],故不失为一种替代常规法在中小医院普及开展的酵母样真菌检验方法。 参　考　文　献 1　周贵民,谢　灵.国内酵母菌感染和实验室诊断的现状及建议.中华医学检验杂志,1996,19(5):301-303. 2Pfaller M A,Housto n A,Co ffman S.A pplicatio n of CHR OM ag ar Ca ndida for r apid scr eening o f clinical specimens for Candida A lbicans,Candida tro picalis, Candida K rusei,and Candida(T or ulopsis)glabrata.J Clin M icr o bilo l,1996,34(1):58-61. ? 764?广西医科大学学报 JOURNA L OF GU ANGXI M EDICAL UNIVERSIT Y 　2002Oct;19(5)

食品中霉菌和酵母分布检测和鉴定-福建疾病预防控制中心

食品中霉菌和酵母分布、检测和鉴定 福建省疾病预防控制中心马群飞 1. 霉菌和酵母的基本特性 霉菌和酵母这种称谓仅是为了方便起见，将小型真菌有真正菌丝的称为霉菌，没有菌丝的称酵母，并没有分类学上的依据。相对于低等的细菌来说，霉菌和酵母生长缓慢，竞争能力较弱，故霉菌和酵母常在不利于细菌生长繁殖的环境中形成优势菌群。由于霉菌和酵母的细胞较大，新陈代谢能力强，故10２～10４个酵母即可引起一克食物的变质，而细菌则需要100倍于此数的细胞。 通常霉菌和酵母适合在高碳低氮有机物如植物性物质上生存。适合的pH 3～8，有些霉菌可以在pH2，酵母在pH 1.5时生活。水活度要求0.99～0.61，霉菌0.85时最适宜，某些嗜渗酵母和霉菌常引起糖果类食品的变质。一般的霉菌的生长温度为20～30℃，部分霉菌可以在不低于－7℃的温度下生长。酵母一般在0～45℃时生长。耐热能力较差，酵母细胞55～56℃几分钟就被杀死。少数霉菌的孢子（如丝衣霉）则可在90℃中耐受 几分钟。霉菌和酵母很多可以耐受防腐剂。如乳酸、醋酸、CO ２和SO ２ 等。有些酵母酯酶 活性高并能合成B族维生素。 2. 食品中酵母的常见类群 在食品中能分离出各种酵母菌，但它们很可能没有什么意义，因为其中多数来源于外界的偶然污染。仅有非常有限的几个酵母属可使经过加工并正常生产工艺包装的食品腐败。比如抗SO ２ 熏蒸的酵母，就是饮料、葡萄酒变质的常见因素。耐受保鲜剂的毕赤酵母，高度嗜氧，可以形成泡菜和酱油的表面膜。 当然，如果不按照标准的生产程序进行食品生产，那么许多外界污染的酵母都将在食品中大量繁殖，这种情况下，就谈不上优势菌群问题了，也不必进行酵母的分类鉴定。处理方法只有一个，恢复正常的生产程序。 2.1 乳制品：鲜奶易因细菌污染而腐败，酵母菌不是重要问题。当鲜奶被加工成奶油、乳酪、酸奶等制品后，由于细菌被抑制，酵母可相应地成为优势菌。它们使奶油、乳酪产生怪味和气体，使黄油产生有味物质，并可使酸奶和酸乳酪腐败。在实验室中，汉逊德巴利酵母、布提利假丝酵母、多孢丝孢酵母和红酵母均能导致固体和液体乳酪的腐败。 2.2 肉类与肉制品：通常情况下，这类制品适于细菌的生长，酵母不是引起变质的主要原因。某些德巴利酵母可使冷冻的猪、牛肉香肠和午餐肉表面出现令人不愉快的粘滑感觉。

酵母菌的死活细胞鉴定

酵母菌的死活细胞鉴别与镜检计数 一、实验目的 1.掌握鉴别酵母菌细胞死活的染色方法。 2.了解血球计数板的构造，掌握利用它进行酵母菌计数的方法。 二、实验步骤 1.酵母菌血球计数板镜检计数 1)取一块盖玻片，加盖在血球计数板中央计数室上方。 2)用滴管吸取菌悬液滴于盖玻片的边缘，通过毛细作用渗入计数室，注意不能有 气泡产生，然后放置于载物台，静止5min，使细胞全部沉降到其表面。 3)高倍镜镜检，数对角线上5个中方格中细胞的总数，再计算出菌悬液浓度。为 了减少误差，应注意对样品适当稀释，以每个小方格中平均4~6个细胞为佳； 另外，也可对同一样品重复计数，取其平均值。 附:计数板的结构及测定原理 利用血球技术板镜检技术是一种常用的计数方法。血球计数板是一块比普通载玻片厚的特质玻片，其上有四条凹槽，构成三个平台，中间比较宽，其中央又被一短横槽隔成两半，每半边各有一个计数区，其上有9个大方格，只有中央的一个大方格为计数室供计数用。这一大方格的长宽各为1mm。加盖盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的距离为0.1mm，因此计数室的容积为0.1mm3。 目前血球计数板常用的是25格×16格型，其计数室被分成25个中格，其中每个中格又分为16个小格，故计数室共有400 小格。 计数时，首先把适当浓度的菌悬液注入计数室，然后在显微镜下计数，一般数对角线上5个中方格（共80个小方格）中细胞总数再根据下式求得菌悬液的浓度 细胞个数=5000A×B 式中A---5个中方格中细胞总数 B---菌悬液的稀释倍数 三、实验结果

个数:30 37 11 25 21 24 17 27 28 25

酵母菌死活鉴定和显微镜检测

实验二酵母菌的死活鉴定和显微镜计数 一、实验目的 学习血球计数板使用的原理与方法，学习区别死活酵母的方法。 二、原理 测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微直接计数和平板计数法。 镜检计数法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，菌体较大的酵母或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌采用彼得罗夫?霍泽细菌计数板，两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察，而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。 血球计数板的构造 血球计数板是一块特制厚玻片。玻片上由四道槽构成三个平台，中间的平台分成两半，其上各刻一个相同而有一定面积的小方格网。方格的刻度有两种规格。一种是25×16，称为希里格式血球计数板，分为25大格，每大格又分为16小格；另一种是16×25，称为麦氏血球计数板，分16大格，每大格分为25小格。总数都是400小格（如图所示）。 每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3，使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每毫升（或每克样品）中微生物细菌的数量。

三、实验材料 1、菌种：酵母菌 2、仪器：显微镜、血球计数板 3、材料：盖玻片、吸水纸、滴管 4、染料：美蓝染液 四、实验步骤和内容 1、视待测菌液浓度，加无菌水做适当稀释，以每小格菌数5-10个为宜，准确计算稀释 倍数。 2、取清洁干燥的血球计数板，加盖玻片盖住网格和两边的槽。 3、将待测菌液充分摇匀后，用无菌吸管吸少许，由盖玻片边缘或槽内加入计数板来回推压盖玻片，使其紧贴在计数板上，计数室内不能有气泡。静置5-10分钟。 4、在低倍镜下找到小方格网后更换高倍镜观察计数，上下调动细螺旋，以便看到小室内不同深度的菌体。位于分格线上的菌体，只数两条边上的，其余两边不计数。如数上线就不数下线，数左边线就不数右边线。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因为观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。凡酵母菌芽体达到母细胞一半时，即可作为两个菌体计算。 5、计数时若使用刻度为25×16（大格）的计数板，则数四角的4个大格（即100小格）内的菌数。如用刻度为16×25（大格）的计数板，除数四角的4个大格外，还需数中央1个大格的菌数（即80小格）。 6、每个样品重复计数2-3次，取其平均值，按下式计算样品中的菌数。 刻度为25×16（大格）的计数板：

酵母菌分类方法研究张金龙

酵母菌分类方法研究 学生姓名：张金龙 系别：农学系 专业班级：生物技术2班 学号： 0701024228 指导老师：卢显芝 2010年6月

摘要：酵母菌是一个复杂的类群,其分类系统经数代酵母菌分类学家的努力正日趋完善,分类学方法也随着科学技术的进步而不断深化, 尤其是近年来发展起来的分子分类学方法给整个生物系统学和进化研究方法注入了活力,也使酵母菌的系统发育研究更接近于生物起源的本质。 关键词：酵母菌分类方法化学分子生物学技术 酵母菌是一类单细胞的真核微生物的通俗名称，并非是系统分类单元。酵母菌属于真菌，是具有核膜与核仁分化的较高等的微生物，细胞内有线粒体等较复已杂的细胞结构。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子（子囊孢子和担孢子）的能力，可将酵母菌分成3类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌。在真菌分类系统中分别属于子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类。[1]与其他微生物相比，尤其是细菌和丝状真菌，酵母菌的种数很少，但是其分布范围却很广泛。酵母菌大多数为腐生，生活在含糖量较高和偏酸性的环境中，如水果、蔬菜、花蜜及植物叶子上，尤其是果园、葡萄园和菜园的土壤中较多。 由于酵母菌拥有丰富的酶系统和蛋白质，对高糖环境、高碳环境、高渗透压环境等具有较强适应性，可以为其他生物体提供营养物质，可以代谢重金属或者降解某些难降解的物质，维持生态环境的稳定。[2]因此分类研究作为其他各方面研究的基础，研究手段不断改进，分类系统不断更新。 其中大致有三种分类方法：传统分类方法、化学分类方法、分子生物学分类方法。 1 传统分类方法 传统分类学方法是酵母菌分类学方法的基础 ,包括形态学特征和生理生化特征。形态学特征包括宏观特征(菌落特征)、微观特征(细胞形态、无性繁殖方式、有性生殖方式、孢子类型、假菌丝的形成)等；生理生化特征包括对糖发酵和碳、氮源化合物同化的能力 ,对外源维生素的依赖性和不同温度下的生长能力等生理学特性。经典分类学方法在酵母菌分类学中占有重要地位 ,当前权威的酵母鉴定系统就是在此基础上建立并发展起来的。 然而,它存在的局限性也是不容忽视的。酵母菌形态学特征可能随着培养基的改变而发生变化,因此必须采用标准化方法;有些种类或结构不同的碳水化合物具有相同的代谢途径 ,它们所反映的遗传基础是有限的;有些双糖、寡糖和多糖代

实训五 酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定

实训五酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定 一、实验目的 1、观察酵母细胞的形态结构及出芽繁殖； 2、掌握鉴别死活酵母细胞的染色技术； 3、学会水浸制片观察酵母菌。 二、实验原理 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，细胞一般呈球状、卵圆状、椭圆状、柱状或分枝状的假菌丝。其细胞核与细胞质有明显分化，菌体较细菌大几倍甚至十几倍，在高倍显微镜下即可观察到胞内有明显的细胞核和内含物。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种。无性繁殖大多是以出芽的方式进行，也有分裂繁殖；有性繁殖则是通过接合产生子囊孢子。酵母菌的母细胞经过一系列的芽殖后，如长大的子细胞不与母细胞分离，就会形成藕节状的假菌丝，成为假丝酵母。 用生理盐水（或水-碘液染色液）制作水浸片可以观察酵母菌的形态和出芽繁殖方式。用美蓝染色液制水浸片可鉴别酵母细胞的死活状态。美蓝是一种弱氧化剂，氧化时呈蓝色，还原后呈无色。用美蓝对酵母菌进行染色时，活酵母细胞因新陈代谢不断进行，胞内具有很强的还原能力，能将进入细胞的美蓝还原，使得细胞呈无色。因此，具有还原能力的酵母活细胞为无色，而老化细胞还原能力弱，染色后呈淡蓝色，死细胞则失去还原能力，被染料染成蓝色。 三、实验材料 1、菌种：啤酒酵母或葡萄汁酵母（制成斜面培养物或液体培养物） 2、试剂：0.1%吕氏美蓝染色液、0.05%吕氏美蓝染色液、水-碘液染 色液（革兰氏染液用碘液：水=1：3）、0.85%生理盐水 3、仪器及其他：显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、 滴管、酒精灯、蒸馏水、吸水纸等 四、实验时间 2课时

五、实验步骤 （一）生理盐水浸（封）片（酵母菌的形态观察） 1、在载玻片中央加1滴无菌生理盐水（不宜用无菌水制作水浸片， 否则细胞易破裂），然后以无菌操作从斜面培养基上用接种环取少量啤酒酵母菌苔与生理盐水混匀，使其分散成云雾状薄层。 2、用镊子取洁净盖玻片，先将其一边与菌液接触，然后缓慢地将盖 玻片放下，避免产生气泡影响观察。 3、在显微镜下，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察酵母菌的形态、 大小及出芽情况。 （二）水-碘液浸片（酵母菌的形态观察） 1、在洁净载玻片中央滴1滴水-碘液，用接种环在火焰区以无菌操作 方式从斜面培养基上取出少量菌种（或加1滴酵母菌悬液），与载玻片上的水-碘液相混合。 2、以同样方法盖上盖玻片后镜检。 （三）美蓝染色液制水浸片（酵母菌的死活细胞鉴别） 1、在洁净载玻片上加一滴0.1%吕氏美蓝染色液，用接种环以无菌操 作挑取少量酵母菌苔放在美蓝染色液中，混合均匀，染色2-3min。 2、取一块洁净的盖玻片，先将一边与染液接触，然后慢慢将盖玻片 放下，避免产生气泡，并将多余染液用吸水纸吸干。 3、先用低倍镜观察，然后用高倍镜观察酵母的形态、出芽情况和着 色情况。着色清晰的是死细胞，无色的是活细胞，淡蓝色的是老龄细胞。 4、染色约0.5h后再进行观察，注意观察死细胞数量是否增加。 5、用0.05%吕氏美蓝染色液重复上述操作，比较两个浓度的美蓝染 液的染色结果。 注意事项 1、如用酵母菌的液体培养物，先稍微振荡使酵母菌上浮，再用接种 环以无菌操作方法取培养液。 2、美蓝浓度不宜过高，染色时间不宜过长，否则对细胞活性有影响。 3、美蓝染液不宜过多或过少，否则在加盖玻片时菌液溢出或有气泡。

酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定

实验七酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定 一、实验目的 1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。 2.学习鉴别死活细胞的实验方法。 二、实验原理 酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。 三、试剂与器材 1.材料酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2天左右的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。 2.试剂0.05％和O.1％吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。 3.器材显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。 四、实验内容 1.美蓝浸片观察酵母培养→制片→染色→镜检→30分钟后再镜检 2.水-碘浸片观察 五、关键步骤及注意事项 1.染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液溢出或出现大量气泡。 2.用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。 六、思考题 1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响?试分析其原因。 2.在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌? 实验七酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定 一、实验目的 1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。 2.学习鉴别死活细胞的实验方法。 二、实验原理 酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微

实验八 酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别

实验八酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别 一、实验目的 1.观察酵母菌的形态及出芽生殖方式； 2. 学习区分酵母菌死活细胞的实验方法； 3.掌握酵母子囊孢子的观察方法。 二、实验原理 1. 酵母菌 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，不必染色即可用显微镜观察其形态。但由于细胞个体大，采用涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片法或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。 大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，也可以通过接合产生子囊孢子进行有性繁殖。本实验通过美蓝染液水浸片法来观察酵母的形态和出芽生殖方式，并对酵母细胞进行死活染色鉴别。 2. 美蓝染液 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝溶液对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。 三、实验材料 1. 菌种 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)培养1天的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。 2. 溶液或试剂 0.1%吕氏碱性美蓝溶液、5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、95%乙醇，等。3．器材 显微镜，擦镜纸，吸水纸，载玻片、盖玻片、酒精灯、接种环、镊子等等。 四、实验步骤 1、酵母菌出出芽方式的观察及死活鉴定

（1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作接种蘸取取少量液体酵母放在染液中，混合均匀，染液不宜过多。 注：染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡。 用接种环将菌体与染液混合时，不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。 （2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。 注：盖玻片不宜平放，以免产生气泡。 （3）将制片立即放在显微镜下镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。 （4）将制片放置约5min后镜检，注意死细胞数量是否增加。 （5）染色约30min后再次观察，注意死细胞数量是否增加。 2、酵母菌子囊孢子的观察 （1）涂片在载玻片中央加一滴蒸馏水，然后按无菌操作接种环挑取少量酵母菌放在染液中，混合均匀，染液不宜过多。 （2）干燥固定用夹子夹住载玻片，在酒精灯上方来回移动，注意不要将载玻片距离火焰太近，以免烫死酵母菌。 （3）染色用5%孔雀绿水溶液覆盖1.5～2min；水洗；95%乙醇脱色30s；水洗；0.5%番红水溶液覆盖1min；水洗；干燥。 （4）镜检将制好的装片放在显微镜下镜检，由低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察。 五、实验报告 1、实验结果 （1）酵母菌的死活鉴别 （2）形态 酵母菌一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬性。菌落形态与细菌相似，但较大较厚，呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。

酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别 4学时

实验一酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别 预习内容： 1. 光学显微镜的使用（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，23-27页） 2. 酵母菌的美蓝染色观察（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，91-95页）预习思考题： 1. 随着物镜放大倍数的增加，视野的亮度是增强还是减弱？应如何调节？视野范围是如何变化的？ 2. 制作水浸片时如何避免产生气泡？ 3. 影响活菌数目的因素有哪些？染液浓度、染色时间及染色时的pH等因素对死活细胞数目比例有什么影响？ 4. 如何测定酵母菌死亡率？简述其原理。 5. 标本片上的某一物象，第一次看到后如何再次找到它? 一、实验目的与要求 1. 了解普通光学显微镜的构造及原理，正确掌握使用显微镜的方法； 2. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式； 3. 学习区分酵母菌死活细胞的实验方法； 4. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、实验原理 1. 酵母菌 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，不必染色即可用显微镜观察其形态。但由于细胞个体大，采用涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。 大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式，并对酵母细胞进行死活染色鉴别。

2. 美蓝染液 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。 图1：酵母菌美蓝浸片观察3min（10×40）图2：酵母菌美蓝浸片观察30min（10×40） 三、实验设备及材料 1. 菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2 天左右的豆芽汁液体培养物(需稀释)。 2. 溶液或试剂：0.1%和0.05%吕氏碱性美蓝溶液(或0.01%美蓝水溶液)，革兰氏染色用碘液等。 3．器材：显微镜，擦镜纸，吸水纸，盖玻片、酒精灯、接种环、镊子、胶头滴管、小烧杯、洗瓶等等。 四、实验步骤与内容 1．美蓝浸片的观察 （1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作接种环挑取少量酵母菌放在染液中，并用接种环将其混合均匀，酒精灯上灼烧清洗接种环。 注：染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡。用接种环将菌体与染液混合时，不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。

实验六 酵母菌形态的观察及死活细胞的鉴定

实验六酵母菌形态的观察及死活细胞的鉴定 一.实验目的与要求. 1、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法； 2、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二.基本原理 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见的细菌大几倍甚至十几倍，大多数的酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片来观察酵母菌的出芽生殖方式。 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原力的酵母活细胞是无色的，而死或代谢作用微弱的衰老细胞则呈现蓝色或淡蓝色，即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。 三.实验材料和用具 1、菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养约2d的麦芽汁（或豆芽汁）斜面培养物。 2、溶液或试剂：0.05%和0.1%吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液。 3、仪器或用具：显微镜.擦镜纸.接种环.酒精灯.载玻片.盖玻片.吸水纸.小滴管 一. 操作步骤： 1、美蓝浸片的观察 ①在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。 ②用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。 ③将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高位镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。 ④染色约0.5h后再进行观察，注意死细胞数量是否增加。 ⑤用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。 2、的观察 在载玻片中央加1小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水-碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。 五．实验报告： 1．结果 绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。 2．思考题 ①吕氏碱性美蓝染液的浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。 ②在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌。

1株耐辐射酵母菌的鉴定及其生长特性和产物的检测

1 株耐辐射酵母菌的鉴定及其生长特性和产物的检测 摘要：对未知菌种的鉴定是研究挖掘此菌种功能用途以及产 物的基础之一。根据形态学、生理生化鉴定以及26S rRNA的D1/D2 区域的测序、5.8S rRNA-ITS的RFLP分析等对1 株酵母菌进行了鉴定，并探究了其特殊的生长特性与产物。研究结果，该酵母菌被鉴定为圆形或者卵圆形，以出芽生殖为主，菌落为乳白色、圆形、凸起、边缘光滑的浅白隐球酵母；经过研究还发现，该酵母菌能在较大的pH 值范围（pH 值3?13）内生长，能在比较高的温度（39 C）以及强 酸强碱下生长，检测到其产物为多糖，与以往浅白隐球酵母的产物有区别。 关键词：耐辐射；酵母菌；鉴定；核糖体序列分析中图分类号：TQ920.1 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）07- 0320-05 传统的也是权威的酵母菌鉴定方法是首先依据形态学特征和生理生化进行分析。20 世纪90 年代开始应用的商业化Biolog 系统[1-2] ，即测试微生物在鉴定板各孔中对不同碳源的代谢能力进行菌种鉴定，这种鉴定也被称为代谢指纹图谱分析。但该方法对于那些并 未得到很好分离纯化的酵母菌，在特殊条件（如强辐射、光照、酸碱 条件等）下产生变异的新菌种，其遗传密码和代谢途径可能发生了变 化有时也难以辨别。与传统分类法互补的分子生物学方法研究酵母菌

的基因型，主要以遗传物质核酸作为研究对象，更能反映其遗传本质，对酵母菌的多样性分析能够提供基因水平的详细信息，使鉴定更具准确性和遗传特异性。目前，常用分子生物学鉴定酵母菌株的遗传信息最直接检测对象为：染色体基因组 DNA、核糖体DNA、线粒体DNA,具体方法主要有基于聚合酶链反应（PCR的酵母核糖体基因序列分析，例如26S rRNA 的D1/D2区域基因序列测序，5.8S rRNA-ITS-RFL分析等。本研究对于1 株未知菌株从表型到代谢图谱到基因型多种手段进行的鉴定，得出此菌株为浅白隐球酵母菌。由于其独特的生长环境，该酵母菌各方面的特性都比较好，产物中有含量比较高的多糖，而多糖的存在可能是菌体对环境中普遍存在的抗菌物质的反应，如表面活性物质、细菌毒素、噬菌体、抗生素、抗体等，所以野生菌株产生的胞外多糖对细菌的黏附以及在竞争环境中的存活和生长都具有重要的作用[3]。近年来，研究发现多种细菌的胞外多糖具有很强的生物学活性和医学作用，然而浅白隐球菌一般是一种病原菌，有进一步分析多糖的潜在研究价值。 1材料与方法 1.1材料 菌株：实验室保藏编号为J2002 的菌株（由罗布泊地区 分离得到）；酵母菌基因提取试剂盒：OMIGA 公司产品；PCR 引物：由金斯瑞公司合成；KOD-Plus DNA Polymerase，dNTPs：TOYOBO公司产品；Hhal、Hae『Hinf I 3 种酶：TOYOBO 公司产

酵母菌筛选的方案

第一部分：酵母筛选收集 一．土样中酵母的分离： 1．土壤的采集处理 采用五点取样法从葡萄地土壤中取样。由于土壤中的微生物一般在5-25cm的土层里，所以先用灭菌铲除去土壤的表皮，然后采取土壤200-300g，至于无菌塑料袋内，并标明采取地点、日期。将其运回实验室后至于冰箱中保存，备用。 将采回的样品用四分法获取样品20-30g，将其置于研钵中研磨均匀。 2. 土壤中菌种的分离： 称取1 g土壤，置于液体培养基灭菌葡萄汁，经28 ℃，12 h，180 rpm摇床富集培养。取1 ml富集培养液，分别进行五个梯度稀释（1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个梯度做三个重复。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。 为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。 观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。 二．葡萄果表酵母的分离: 1. 葡萄的采集： 葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此在采收葡萄时，将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。 2. 菌种分离步骤： 将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。 随机选取并称量约10g成熟葡萄，放入盛有90ml 无菌水的三角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养30min后静置，制