小鼠睾丸不同的生精阶段

PAS和Hematoxylin染色显示小鼠睾丸不同的生精阶段

第一期：圆形精子出现原初染色呈现红色顶体泡；SSCs和少量的pachytene,圆形精子和小的长形精子细胞（小的精子头）。

第二期：圆形精子出现2-3个染色呈现红色的顶体泡；pachytene与SSCs距离较近。

第三期：圆形精子膜上红色顶体泡合并，仍然在精子膜上，不与核膜相连；中期的pachytene 核，带有sex body;SSCs核呈现异染色质状。

第四期：红色顶体接触核膜，呈现线条状或扁平；SSCs处于有丝分裂状态，小型的B型SSCs 出现。

第五期：红色的顶体沿着圆形精子膜呈现月牙状或括弧状；B型SSCs核呈现异染色质状态。第六期：顶体呈现帽状，覆盖圆形精子的三分之一的表面，成熟的精子几近管腔；成熟的精子靠近管腔。

第七期：顶体继续扩散，顶体并不全部朝向基膜（红色顶体不全部向基膜分布），成熟精子完全到达管腔边缘。

第八期：圆形精子顶体大多朝向基膜，管腔内无精子，新一轮精子形成开始。

第九期：spermatids精子核开始延长；圆形精子细胞，Leptotene, pachytene, round spermatocytes。

第十期：精子扁平，并继续延伸，大部分精子头染色较浅；无圆形精子细胞，Leptotene, Zygotene, pachytene。

第十一期：精子头变薄，精子头Hematoxylin深染色。

第十二期：减数分裂明显，出现中期分裂象的次级精母细胞, Diplotene spermatocytes（显示细胞核呈现长条状，分裂相）。

小鼠睾丸支持细胞分离培养

小鼠睾丸支持细胞分离培养 一、材料和器械： 1、材料：小白鼠（18~ 20 日龄）1只 2、配液： PBS 1L，高压灭菌 细胞洗液：DMEM+双抗 消化液：0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，0 1%( 质量分数) 胶原酶 细胞培养液：DMEM+10%FBS+双抗 3、器械： 镊子、手术剪、手术刀各3-4把，高压灭菌 500mL烧杯2个，高压灭菌 25 mL离心管、5 mL离心管各20个，高压灭菌 酒精棉一瓶 细胞培养皿若干 冰块若干 二、操作步骤： 1、处死小鼠颈椎脱臼法处死； 2、消毒置于含75% ( 体积分数) 乙醇平皿中浸泡2 min, 然后置于超净台上； 3、取睾丸用中剪剪开下腹部皮肤, 眼科剪从下腹部附睾部剪断精索, 取出双侧睾丸, 放入含预冷细胞洗液的培养皿中； 4、取实质修剪睾丸附带的精索。剥除睾丸被膜, 将睾丸实质剪成约1 mm 1 mm 1 mm 碎块, 静置3~ 4 min； 5、消化转入25mL 离心管中。吸出上层细胞洗液, 每只睾丸加入1 5mL 37 预温的0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，37 高速振荡消化15~ 20min, 直到残存的间质消化成粘液状, 可见成片断的曲细精管； 6、终止消化加入入少许血清终止消化,； 7、离心1000 r/ min离心5 min, 倾去上层胰酶。加入DMEM/ F12 培养基重悬, 1000r/min 离心5min。倾去上层培养液； 8、再消化每只睾丸加入1 mL 37 预温的0 1%( 质量分数) 胶原酶, 37 低速

缓慢振荡消化20~ 25min； 9、铜网过滤取滤液800 r/ min 离心5min, 2 次去除胶原酶, 用培养液洗涤； 10、接种往离心管加入细胞培养液5ml左右，吹打均匀，接种到两个30细胞培养皿中，补加培养液到培养皿1/3~1/2,培养皿标记显微观察后放入36CO2培养箱培养。 三、换液纯化，计数结果鉴定

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用 杨彩荣 魏延昌张 岩郑可佳 李 宁严云勤* (东北农业大学动物细胞与发育生物学教研室，哈尔滨150030) 摘要哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin ，mTOR)是一种Ser/Thr 激酶，属于PIKK 超家族，对调节细 胞周期、蛋白质合成等具有重要作用，是细胞生长、增殖、分化、凋亡的中心调控器，但在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以小鼠卵母细胞为研究对象，采用免疫荧光为主要研究方法，对mTOR 在小鼠卵母细胞中的表达进行研究，并通过mTOR 的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin ，RAPA )对卵母细胞进行处理，对mTOR 在卵母细胞成熟过程中的作用进行研究．结果显示：小鼠卵母细胞成熟过程中，生发泡(germinal vesicle ，GV )期mTOR 主要集中在核膜处表达，生发泡破裂(germinal vesicle breakdown ，GVBD )后mTOR 伴随染色体分布，第二次减数分裂中期(second metaphase ，M Ⅱ期)mTOR 伴随纺锤体分布；雷帕霉素处理后，小鼠卵母细胞的成熟受到抑制，且这种抑制作用具有浓度依赖性，同时其mTOR 的表达部位和形态也发生变化．研究表明，在小鼠卵母细胞成熟过程中，mTOR 在各个时期的表达及分布具有阶段特异性，并对小鼠卵母细胞GVBD 的发生和第一极体的排放都具有重要作用． 关键词雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，小鼠卵母细胞，雷帕霉素，免疫荧光学科分类号 Q2 DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00446 生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophysics 2009,36(10):1334~1339 https://www.wendangku.net/doc/5710524305.html, 研究报告 Research Papers *通讯联系人. Tel:0451-********,E-mail:yanyunqin@https://www.wendangku.net/doc/5710524305.html, 收稿日期：2009-07-23，接受日期：2009-09-04 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)结构与功能上高度保守，是一种存在于哺乳动物细胞中的Ser/Thr 激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase ，PIKK)家族成员．mTOR 信号通路可以汇聚和整合来自于营养、生长因子、能量和环境胁迫对细胞的刺激信号[1～3]，通过其下游的靶蛋白核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6kinase 1，S6K1)和蛋白质翻译起始因子eIF4E 结合蛋白1(eIF4E binding protein 1,4EBP1)调控蛋白质的翻译，加快细胞G1期/S 期的转换，促进细胞生长和增殖，抑制细胞凋亡[4～6]．mTOR 信号通路紊乱与肿瘤的形成及细胞的恶性转化密切相关[7]． 雷帕霉素(rapamycin ，RAPA ，RPM)是一种大环内酯类抗生素和免疫抑制剂，它进入体内后与胞浆受体FKBP12结合形成复合物，此复合物能够结合在mTOR 蛋白羧基端的FRB 结构域内，形成三元复合物，使得mTOR 的激酶催化域失去接近并磷酸化下游靶蛋白的能力，从而抑制mTOR 的生物学功能[8～10]． mTOR 在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的研究较少，且大多集中在海星、海胆等动物中[11,12]， 而在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以往的研究表明，mTOR 与一些蛋白质的合成有关[12]，而特定蛋白质的合成对卵母细胞成熟具有重要的作用，因此我们推测，mTOR 可能在哺乳动物卵母细胞成熟过程中有重要作用．所以本研究以小鼠卵母细胞为研究对象，观察了mTOR 在卵母细胞成熟各个阶段的表达及分布情况，同时通过雷帕霉素的处理观察mTOR 对卵母细胞成熟的重要作用，为进一步探索mTOR 在小鼠卵母细胞成熟过程中的分子机制提供实验依据． 1材料与方法 1．1 实验材料 本实验选用昆明白品系6～8周龄性成熟雌鼠，购自哈尔滨肿瘤医院实验动物中心． 1．2 主要试剂 α-MEM 购自Gibco 公司；雷帕霉素购自江苏碧云天生物技术研究所；孕马血清(pregnant mare

PLA生物细胞免疫激活疗法

【权威疗法】--PLA生物细胞免疫激活疗法 “PLA生物细胞免疫激活疗法”运用现代纳米技术，萃取出纳米小分子“PLA生物细胞”，发现该分子细胞可将发炎增厚的组织溶解代谢掉，运用到治疗风湿方面，将大量PLA生物细胞通过特异通道到达病灶部位，通过预处理方案中的超大剂量的生物细胞破坏和阻断患者体内所有自身免疫T淋巴细胞克隆和记忆细胞营养供给，清除T淋巴细胞使其失去活性并排出体外。 并能有效阻滞相应神经，使椎间隙拉宽，迅速减轻疼痛，同时在修复免疫功能分子的作用下恢复弹性，承受受压能力。由于输入的PLA生物细胞含有大量营养神经细胞及清除无菌性炎症的药物，可使受压损伤的神经细胞在3-5天内重新再生，使局部创面得到愈合，使由于压迫刺激导致的神经根及椎管内水肿得到消退，疼痛症状消失。 由于PLA生物细胞免疫激活疗法治疗风湿病，不经过血管，而是运用超导向活检实施治疗，比其他方式更容易到达病变位置，药物在病变局部高度集中，随着药物浓度升高，疗效越显着。由于在病变部位进行治疗，所以药物对病变位以外的周围组织影响甚小，避免了全身用药的负面危害，大大减少了药物本身的毒副作用。 【技术优势】--PLA生物细胞免疫激活疗法 (1)、不开刀、不手术、不住院。避免传统开刀手术带来的大创伤、易感染、难除根的弊端。 (2)、避免吃药带来的副作用。避免了患者长期用药所造成的心脏、肾脏、肠胃等损伤出现。 (3)、直达病灶除病根，预防复发。直接清除炎性病原体，修复受损骨组织，提升免疫机能。 (4)、治疗更快捷、效果稳定持久。30分钟就可实现一次性治疗，防止了骨组织再次受破坏。 (5)、真正的“绿色”治疗方式。对关节周围正常组织无损伤，保持整个关节功能的完整性。 【治疗步骤】--PLA生物细胞免疫激活疗法 1、精准定位：通过影像学仪器，针对患者病情的个体差异，进行病灶的准确定位。 2、靶向介入病灶点：通过纳米技术，提取PLA生物细胞迅速分布于病灶部位，直达病灶除病根。 3、清理T淋巴细胞：PLA生物细胞到达病灶，分解大量免疫因子和修复因子，能够迅速杀灭病变的T 淋巴细胞并清理出体外。解除受到炎性病原体浸泡的关节滑膜及软骨组织，使疼痛僵硬状态随着炎性物质的消除而消失。 4、修复软骨恢复免疫平衡：快速修复受损组织，防止骨质遭到破坏，同时促进健康滑液再生，使坏死、病变组织得以修复并及时的生出新的骨组织，从而恢复正常生理功能、提升免疫力、调节抗体平衡、预防病原体再次入侵的目的。 【显著疗效】--PLA生物细胞免疫激活疗法 1.30分钟止疼痛。

小鼠精巢细胞减数分裂标本制备与观察

小鼠细胞分裂标本的制备与观察 一、实验目的 a)掌握小鼠精巢染色体标本制作法。 b)观察减数分裂过程中不同时期的染色体。 c)观察腹水瘤细胞有丝分裂中不同时期的染色体形态。 二、实验原理 a)减数分裂（Meiosis）是发生于生殖细胞的一种特殊的细胞分裂方式，DNA 复制一次，而细胞连续分裂两次，形成单倍体的精子和卵子。减数分裂 远比有丝分裂复杂，经两次细胞分裂，分别称减数分裂Ⅰ、减数分裂Ⅱ， 两次分裂间又一个较短的间期，这个间期DNA不复制。 b)雄性动物精子发生于睾丸曲精细管的生精上皮细胞，由其中的精原细胞 经多次有丝分裂和生长，形成初级精母细胞，初级精母细胞经减数分裂 形成次级精母细胞，次级精母细胞有丝分裂成精细胞，再经一系列变化 成精子。 c)因此，通过分离曲细精管、剪碎并加入液体吹打，可使官腔各种细胞游 离出来，然后经过低渗、固定、染色等过程就可制成包含减数分裂各期 的标本。 三、实验试剂及仪器 a)材料：成年雄性小白鼠 b)用品：注射器、平皿、尖头镊子、剪刀（普通剪刀、眼科小剪刀）、吸管、 离心管、离心机、玻片等。 c)试剂：1、100mg/ml秋水仙素。 2 、2％柠檬酸钠溶液 3、 0.075M的KCI 4、3:1甲醇:冰醋酸及1:1甲醇:冰醋酸（应现配） 5、PH6.8，0.01M的PBS缓冲液 6、Gimesa原液 7、Gimesa工作液：1份Gimesa原液加9份PH6.8，0.01M的PBS缓 冲液，混匀。工作液应现用现稀释。 四、实验步骤 a)细胞收集 i.小鼠精巢细胞收集 1.注射秋水仙素，增加中期分裂相。 (试验前4－5小时，小鼠腹 腔注射秋水仙素0.5ml（100mg/ml）。 2.取睾丸并清洗。断颈处死小鼠，剖开腹部，取出肾形睾丸，放 入盛有4－5 ml2％柠檬酸钠溶液的平皿中，洗去污血，去掉胞 外脂肪等物。 3.挑出曲细精管并剪碎。弃污液，另加柠檬酸钠溶液 1 ml，用尖 头镊尖将曲细精管拉出，并用眼科剪尽量将其剪碎。

天津市河北区2020届高三总复习质量检测(一)(一模)生物试题 Word版含答案

河北区2019-2020学年度高三年级总复习质量检测（一） 生物 第Ⅰ卷 本卷共12题，每题4分，共48分，每小题给出的4个选项中，只有一项是最符合题目要求的 1.下列关于细胞结构、功能及生理活动的说法正确的是 A.遗传信息贮存在DNA或RNA中 B.细胞中都具有复杂的生物膜系统 C.胰岛B细胞的高尔基体参与分泌胰岛素 D.骨骼肌细胞的细胞质基质中葡萄糖分解为酒精 2.下图表示某兴趣小组将长势相似的不同种的植物甲和乙，分别置于两个规格相同的密 闭透明容器内，在适宜的光照强度和温度等条件下培养一段时间后测得容器内CO2浓度的 变化情况。下列有关叙述错误 ．．的是 A．与C点相比，A点时的植物甲在暗反应过程中［H］消耗较多 B．C点对应的时间点之后，植物甲和乙都能进行光合作用积累有机物 C．C点对应的时间点之前，植物乙积累的有机物比植物甲积累的多 D．如甲、乙植物呼吸强度相同，在B、C点对应的时间段内，植物乙的叶肉细胞中 C5的消耗量比植物甲的大 3.胃壁细胞质中含有H+-K+泵的囊泡，当人体摄入食物后，这些囊泡会转移到细胞膜上。 胃壁细胞通过H+-K+泵逆浓度梯度向胃液中分泌H+同时吸收K+，如下图所示。下列分析不． 正确的是 A．H+-K+泵专一性转运两种离子与其结构的特异性有关 B．H+-K+泵属于载体蛋白，其形成与内质网、高尔基体密切相关 C．胃壁细胞分泌H+使胃液的酸性增强，分泌过程不消耗能量 D．胃壁细胞质中的H+、K+不能通过自由扩散的方式运输到胃液中

4.抗酒石酸酸性磷酸酶（ TRACP）是一种含铁蛋白，在破骨细胞和活化的吞噬细胞中表 达。测定血清中 TRACP浓度，有助于了解骨代谢状况。下列相关叙述正确的是 A.可用双缩脲试剂来检测破骨细胞中 TRACP的氨基酸含量 B.重金属盐作用可直接使 TRACP的氨基酸排列顺序发生改变 C.TRACP基因及相关mRNA只存在于吞噬细胞、破骨细胞中 D.细胞中内质网、高尔基体的参与使 TRACP具有特定的功能 5.某同学将活酵母菌和淀粉溶液装进饮料瓶，预留1/3的空间后密封，观察酵母菌发酵 的变化并用表格进行记录。下列分析不．正确的是 条件原料变化产物呼吸作用场所酵母菌10g（25℃）淀粉溶液瓶子膨胀，溶液出现气泡，溶液变暖甲乙 A.甲包括水、酒精和CO2，乙为细胞质基质和线粒体 B.酵母菌一般以葡萄糖作为呼吸作用的底物 C.溶液出现气泡和瓶子膨胀是产生大量的CO2结果 D.有机物经酵母菌无氧呼吸分解后只转化为ATP和热能 6.除减数分裂外，在某些体细胞的有丝分裂中也会发生同源染色体配对，其非姐妹染 色单体也可发生片段交换，该现象称为有丝分裂交换，如图所示（其中 D 和 d、E 和 e、F 和 f 表示同源染色体上的三对等位基因）。下列相关叙述正确的是 A．如果该图是产生体细胞时发生的过程，则其子细胞基因型可能相同，也可能不同B．该现象发生在有丝分裂和减数分裂，对于后代遗传多样性的影响是相同的 C．如果该图是产生精细胞时发生的过程，则该精原细胞会产生2种基因型共4个精子D．无论是发生在有丝分裂还是减数分裂，交换后的同源染色体均分离进入子细胞中

小鼠睾丸发育过程中Si1基因表达的研究

云南大学学报(自然科学版),2007,29(2):208～212CN53-1045/N　ISSN0258-7971 JournalofYunnanUniversit y Ξ 小鼠睾丸发育过程中Si1基因表达的研究 罗　兰1,2,李水冰1,余　敏1,谭德勇1 (1.云南大学生命科学学院生物化学与分子生物学实验室,云南昆明　650091; 2.昆明医学院基础医学院细胞生物学暨医学遗传学教研室,云南昆明　650031) 摘要:以1天龄、未成熟(3周龄)、成熟期(10周龄以上)的昆明正常小鼠睾丸组织为实验材料,利用地高辛标记的Si1基因探针在其组织切片上进行DNA-mRNA分子原位杂交,探讨Si1基因在小鼠睾丸发育过程中的表达变化.同时,分别在生后15,20d及25d的昆明小鼠睾丸组织切片上进行凋亡细胞原位检测,验证小鼠睾丸上述发育时期的细胞凋亡情况.结果发现:①Si1基因在1天龄小鼠的睾丸组织生精上皮内无杂交信号; 在未成熟小鼠的睾丸组织部分生精上皮内有极强的杂交信号;在成熟小鼠的睾丸组织生精上皮内无杂交信号. ②小鼠睾丸组织生精上皮内,凋亡细胞数从生后第15～20天呈增加趋势,于生后第20天出现峰值,生后第25 天又降低.上述结果表明Si1基因可能参与了小鼠睾丸的发育过程,在小鼠睾丸发育的特定时期发挥作用,由于Si1基因的表达与小鼠生精细胞凋亡发生的时期同步,表明该基因可能与小鼠睾丸发育过程中的细胞凋亡有关. 关键词:小鼠;睾丸;Si1基因;基因表达;凋亡 中图分类号:Q344.13 文献标识码:A 文章编号:0258-7971(2007)02-0208-05 Si1基因是一个新的功能基因(GenBank接受号:AY050169),目前对于Si1基因的功能还知之甚少,以往的研究中表明它与细胞周期的增殖调控有关,可能是一个细胞生长抑制基因,即一个细胞周期负调控基因[1].在肿瘤中,一个SNP位点被发现,该位点在非肿瘤人群中的分布频率为14%,而在肠癌中的分布频率达到51.5%.表明该基因与肠癌有密切关系[2]. 生殖细胞的发育是一个极为特殊的分化过程,也是一个极特殊的细胞周期运行过程.在这一过程中,既有生殖细胞本身的频频分裂增殖,又有其不断地发育分化和死亡[3].研究细胞周期调控基因在生殖细胞发育过程中的表达既可探讨生殖细胞的发育机制,也可从另一个角度探讨细胞周期调控机制,并可探讨细胞周期调控基因在生殖细胞发育过程中的生理功能.此外,近年来的研究表明,小鼠睾丸发育过程不仅存在细胞的生长和分化过程,也涉及了生精细胞的退化过程.有形态学及生化研究表明,生精细胞的退化主要通过细胞凋亡来实现[4].有学者对不同发育阶段小鼠生精细胞的凋亡作了系统的研究,发现凋亡细胞数从生后1d到生后3周有增加的趋势,于生后第3周出现峰值,之后降低[5]. Si1基因既然与细胞周期和肿瘤发生有关[1,2],它与发育过程也许有一定的联系.探讨Si1基因在小鼠睾丸生殖细胞发育过程中的表达,对探讨小鼠睾丸中生殖细胞发育的分子机制有重要的参考意义.由于小鼠睾丸生精细胞在发育过程中存在退化,因此本文同时考察小鼠睾丸生精细胞发育过程的凋亡,以探讨Si1基因与生精细胞凋亡过程的联系. 1　材料与方法 1.1　生物学材料 Ξ收稿日期:2006-06-10 　基金项目:国家自然科学基金资助项目(39960030,30360040);云南省应用基础研究基金资助项目(1999C002Z).　作者简介:罗　兰(1973-),女,湖南人,硕士,主要从事细胞生物学及医学遗传学方面的研究.

生精细胞凋亡及其可能的信号通路

生精细胞凋亡及其相关内容 细胞凋亡又叫程序性细胞死亡，是细胞在一系列内源性基因的调控下发生的自然或生理性死亡的过程。细胞凋亡过程是受基因的精确调控而完成的，其具体的过程机制尚不明确，Bcl-2 是一种细胞膜蛋白，主要存在于线粒体膜、滑面内质网和核膜上，高水平的Bcl-2 蛋白有抑制细胞死亡等作用，是细胞凋亡调控机制中的一个关键蛋白。Tanaka等证实Bcl-2 能抑制睾丸生精细胞的凋亡和分化。CytC 是一个线粒体起源的细胞凋亡信号，Bcl-2可通过抑制CytC从线粒体的释放入细胞质，而Bax、Bak可与Bcl-2结合，止其对CytC释放孔道的抑制作用，从而促进CytC从线粒体释放，引起凋亡。CytC通过接头分子使caspase（胱冬肽酶）分子募集并相互酶解活化，进而诱导细胞凋亡。caspase-3是介导细胞凋亡的关键效应酶，是凋亡执行的重要效应分子。正常情况下，caspase-3以酶原的形式存在于细胞质中，无活性，当细胞接受凋亡刺激时，其被激活，而诱导凋亡。caspase-3是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点，它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志。 检测生精细胞凋亡的技术 4．1 形态学检测 透射电镜检测：处死大鼠，取出睾丸。取出左侧睾丸少量组织，迅速在冰浴上切成1mm×1mm×2mm小块，置于预冷的2%戊二醛溶液中固定，标本经锇酸固定、脱水、树脂包埋、超薄切片和醋酸双氧铀染色后，在透射电镜下观察。可见细胞质空泡化，核膜增厚，核周隙增宽；染色质浓缩，附着于核边缘呈新月形；严重者染色质固缩、断裂, 出现凋亡小体。4．2 琼脂糖凝胶电泳 通过观察DNA梯状电泳带或定量检测DNA片段，可测定凋亡。凋亡细胞DNA 在核小体连接处规律性降解，形成以180 bp一200 bp为最小单位的寡聚体片段，琼脂糖凝胶电泳时呈典型的“梯状带”。但Singh等琼脂糖凝胶电泳检测到青年人生精细胞DNA迁移呈圆形，老年人凋亡生精细胞DNA迁移呈彗星状。 4．3 DNA缺口原位标记法 处死大鼠，取出睾丸。置于10%中性福尔马林溶液中固定24ｈ，常规石蜡包埋、切片（4μm），用于原位末端标记法（TUNEL）检测。主要以精原细胞凋亡为主。可见曲细精小管中各级生精细胞大量凋亡，管腔变薄，管腔中可见大量凋亡的分裂晚期的精子细胞。DNA 缺口原位标记(TUNEL)法可用于检测凋亡细胞。此方法是将细胞的外源性核苷酸(dUTP)结合到单股断链的3′粘性未端上，标记的DNA 再用荧光或显色法检出。该法可检测早期细胞凋亡，特异性和敏感性都很高。E renpreisa等用甲苯胺蓝(tolui di ne blue，TB)、吖啶橙(acridine orange，A0)和TUNEL法检测人生精细胞DNA的完整性，证实这3种方法具有一致性。 4．4 流式细胞术 流式细胞(flow cytometry，FCM)可进DNA 、RNA含量分析，细胞周期、细胞表面标志和细胞受体分析。凋亡细胞的DNA裂解，FCM的DNA图上呈亚二倍体核型峰特点。应用DNA 染色剂穿透正常和凋亡细胞膜的能力，及其与凋亡细胞DNA 结合能力不同以区分正常细胞、凋亡细胞。FCM 还可定量检测凋亡标记蛋白的表达。吞噬凋亡细胞和未吞噬凋亡细胞的巨噬细胞群可利用带有荧光染料反应物的FCM 区分。 4．5 免疫组化法 利用抗原抗体特异性结合测定凋亡相关物质以检测凋亡。凋亡蛋白抗体或抗单链DNA 抗体标记观察凋亡细胞可检测凋亡标记蛋白Fas／FasL、Bc1-2／Bax、p53、p2l、caspases等以鉴定细胞凋亡。 死亡受体途径

小鼠卵母细胞的孤雌激活

卵母细胞的孤雌激活 将体外成熟卵母细胞（COCs要提前脱卵丘）分别用M2液及含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液洗3遍，然后将卵母细胞置于含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液中培养2.5小时，之后转入不含SrCl2的无糖CZB液中继续培养3.5小时，即在激活处理6小时后观察原核统计激活率。为了维持孤雌激活胚胎的二倍性，激活液和6小时检查原核前短期培养的培养液中均添加5μg/ml的CB。 激活的判定：2原核或2-细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活；卵质膜破裂者判断为死亡；胞质分裂一次或多次但不出现原核者判断为碎裂（fragmentation）。本实验将碎裂卵均归为未激活卵。对照组为未经激活处理，但与激活组培养相同时间的卵母细胞。每次实验，只有当对照组卵母细胞无一激活时，实验组数据才有效。 实验原理：利用氯化锶抑制第二极体的排出 实验用品：培养12小时并老化12小时，即24小时后的卵【要提前脱卵丘】，透明质酸酶，M2操作液，10摩尔每毫升的氯化锶，含钙CZB, 孤雌激活实验步骤 1,，第一天上午杀鼠取卵，培养卵。假设只有一个培养孔的卵，一个孔里最好有20至30个卵，留置第二天孤雌激活。 2,，第二天上午，算好时间，用紫外线照射两个培养孔，15分钟后加液，一个孔里放激活液，【激活液的组成是CB加氯化锶加无钙CZB】，

配置激活液的方法问师兄。另一个孔里放培养液【含钙的CZB】。3，注意激活液不能预热太长时间，CB热时间长会影响效果，【君佐师兄的加法是无钙CZB450微升加上氯化锶50微升平衡20分钟，然后加上氯化锶做滴平衡20分钟就可以放卵了】，在配置激活液时最后应该用枪打一打，好充分混匀。至于放培养液的孔可以以后考虑，激活需要6个小时。把握好时间，脱卵丘后就马上激活。同时预热上需要的药品，包括M2，含钙的CZB，再照上两个中平皿。 4，开始做时先用透明质酸酶处理培养的卵1至3分钟，脱卵丘。再用M2洗3至4遍，再用激活液洗3至4遍，再移入含有激活液的培养孔中。移入培养箱中激活6个小时。 5，假设上午9点做完，下午3点就可以观察。激活的判断方法是2原核或2细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活。卵质膜破裂者判断为死亡。胞质分裂一次或多次，但不出现原核者判断为碎裂，本实验将碎裂卵均归为未激活卵。 6，将激活成功的卵母细胞用含钙的CZB培养液洗5至6遍，再转移如含钙CZB的培养孔中培养，理论上48小时后就可以看到4细胞期，此时再转入含糖含钙CZB胚胎培养液中培养，即可以到达囊胚期。

Oct4在不同时期牛睾丸组织中的表达

Oct4在不同时期牛睾丸组织中的表达 黄伟玲，宋锐，陶勇，张运海，曹鸿国*，章孝荣* （安徽农业大学动物科技学院，安徽地方畜禽遗传资源保护与生物育种省级实验室，安徽合肥230036） 摘要：为探明不同时期牛睾丸组织中干细胞的表达特点，以2.5月龄、4月龄牛胎儿和出生后1年牛、2年牛睾丸为试验材料，通过HE染色和免疫组化法染色，探讨了不同时期牛睾丸的组织学特征及Oct4在睾丸组织中的表达。结果显示，早期胎儿阶段的牛睾丸组织细胞呈现团状，睾丸组织中细胞随着年龄增长逐步分化形成管状，在2.5月龄和4月龄胎牛睾丸组织中，Oct4阳性细胞广泛分布于睾丸组织生精小管细胞团和睾丸间质中；在出生后1年牛睾丸组织中，阳性细胞主要分布于牛睾丸组织生精小管基底膜，在睾丸间质中数量较少或没有；在出生后2年牛睾丸组织中，仅在睾丸组织生精小管基底膜的少量细胞呈现Oct4阳性。试验证实了随着牛年龄的增长，牛睾丸组织中Oct4阳性细胞逐渐减少或消失。关键词：Oct4；牛；睾丸组织 中图分类号：S814.1文献标识码：文章编号：0529-5130（2011）01-0036-03 睾丸组织是生殖系统的重要组成部分，Guan 等［1］和Valenzuela等［2］先后从睾丸组织中分离出具有胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）特性的多能性细胞，为干细胞的分离培养和应用奠定了基础。Oct4又称Oct3或Pou5f1，是由Pou5f1基因编码产生的，是POU（Pit-Oct-Unc）结构域的转录因子家族中的一员［3］，Oct4作为干细胞的主导基因广泛表达于各种类型的干细胞，本次试验采用免疫组织化学方法探讨Oct4阳性细胞在不同时期牛睾丸组织中的分布及表达，为从牛睾丸中分离培养多能性干细胞奠定基础。 1材料与方法 1.1试验材料 PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒和显色用浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Oct4兔多克隆抗体购自Abcam公司。 牛睾丸分别取自2.5月龄、4月龄的黑白花奶牛胎儿以及出生后1年、2年的黑白花奶牛；12.5d昆明白小鼠胎儿生殖嵴用作阳性对照。 1.2切片制作与观察 试验材料取出后，用生理盐水冲洗，4%多聚甲醛固定48h，将固定好的各睾丸组织样本流水冲洗24h后，依次经梯度酒精脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋、切片等处理，然后将切片贴于预先用多聚 收稿日期：2010-02-24；修回日期：2010-10-25 基金项目：国家“863”重点项目（2008AA101003）；安徽农业大学资助引进与稳定人才科研启动项目（yj2007-10）。 作者简介：黄伟玲（1984-），女，硕士研究生。 *通讯作者：曹鸿国，副教授，主要研究方向为动物干细胞与胚胎工程，E-mail：caohongguo1@https://www.wendangku.net/doc/5710524305.html,；章孝荣，教授，主要研究方向为动物胚胎工程，E-mail：zxr@https://www.wendangku.net/doc/5710524305.html,。赖氨酸处理过的干净载玻片上。选取连续相邻的四张切片分别作HE、免疫组化染色、免疫染色阴/阳性对照。 石蜡切片60?烤30min，经二甲苯脱蜡，酒精梯度复水。用含Triton X-100和双氧水的通透液孵育10min，柠檬酸缓冲液中微波抗原修复20min，0.025%Triton X-100的TBS冲洗，3%双氧水孵育10 min，含1%BSA的TBS封闭30min，1?2500稀释的Oct4一抗湿盒4?孵育过夜，二抗添加按照试剂盒操作说明书进行，DAB显色1min。显色后的切片经苏木精衬染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下观察拍照。 2结果 2.1不同年龄牛睾丸组织的结构特征 在2.5月龄牛胎儿睾丸组织中，未形成曲细精管结构，不同类型的细胞开始分区，原始生殖细胞聚集明显，呈现明显的团状细胞集落，各细胞集落之间被支持细胞分隔（图1A）。4月胎牛睾丸组织中生精小管结构初步显现，生精小管的管腔还没有形成，睾丸组织间质分布于生精小管周围（图1B）。1年牛睾丸组织生精小管结构形成，但生精小管管腔仍处于闭锁状态，睾丸间质细胞呈梭形分布于生精小管周围，精原细胞沿生精小管基底膜整齐分布（图1C）。2年牛睾丸组织中生精小管的管腔已经形成，管腔壁上有多层细胞分布（图1D）。 2.2Oct4在不同年龄牛睾丸组织的表达 表达Oct4是干细胞的普遍特征，牛睾丸组织切片免疫组织化学检测显示在2.5月龄和4月龄胎牛睾丸组织中，在牛睾丸组织生精小管细胞团和睾丸间质细胞中Oct4阳性细胞较多，阳性细胞在睾丸组织的实质和间质中均有较多分布（图2A，2B）；伴随着 · 63 ·Animal Husbandry＆Veterinary Medicine2011Vol.43No.1

生物细胞渗透修复疗法

“细胞渗透修复疗法”的问世，是武警海南省细胞渗透修复中心科研专家成员数年的科研成果。“这个疗法的问世的确使我们非常的欣慰，但我们最希望看到的是它能够把患者从病痛折磨中彻底的解救出来”。科研专家的一席话深刻的验证了“医者父母心”。 在疗法研发成功之后，武警海南省细胞渗透修复中心于09年力邀国内外数位顶尖再生医学专家来院进行对“细胞渗透修复疗法”的权威认证。在经过数天对疗法的反复推理、鉴别、认证。一致认为由武警海南省细胞渗透修复中心历时数年攻关的“细胞渗透修复疗法”攻克了传统疗法难以企及的医学难关，是神经系统疾病治疗史上的一次革命性突破。英国再生医学peter·c教授表示：中国再生医学的发展迅猛，从武警海南省细胞渗透修复中心“细胞渗透修复疗法”的研发过程中可以看到中国再生医学光明的未来，世界再生医学的发展需要依靠中国的力量，更需要像武警海南省细胞渗透修复中心科研专家这样优秀、对患者负责任的医学团队。

国内外数位顶尖再生医学专家对“细胞渗透修复疗法”的认同，让武警海南省细胞渗透修复中心科研专家欣喜不已。在喜悦的同时更感觉到肩上的担子更重了，“疗效才是硬道理，我们等着“细胞渗透修复疗法”能够给众多的脑病患者带去健康”，科研专家孟教授信心百倍的告诉笔者。再生医学作为一门世界前沿医学科技，慢慢的开启了攻克各种难治性传统顽疾的大门，我们希望看到更多的切实有效的疗法的诞生，为中国再生医学的发展再创新篇，为世界再生医学的发展添砖加瓦，让更多的顽疾患者重获健康。 党中央国务院十分重视生物细胞技术的发展，生物细胞技术对于保证人口健康和延长寿命意义重大，我们国家在中长期发展规划中，把生物细胞技术研究及临床应用作为重点领域和优先发展的主题。《国家中长期科学和医学技术发展纲要》提出了把生物细胞技术作为未来医学研究的重点。《国民经济和社会发展第十一个五年规划纲要》也要求把生物细胞技术结合我们国家特有的资源优势和技术优势。我们国家在各个方面的关注与支持之下，生物细胞技术的研究也取得了重大发展。在海南成立了首个细胞治疗中心——海南省细胞渗透修复中心，生物细胞技术近期通过了美国AABB(美国血库协会American Association of Blood Banks)认证。表明了我国的生物细胞技术已经在国际上处于领先地位。 “生物细胞渗透修复疗法”是海南省细胞渗透修复中心的科研人员响应国家号召经过八年的课题攻关及临床研究所独创的疗法。该项技术是目前国际上最权威、最先进的的生物技术。生物细胞渗透修复疗法创造性地将生物细胞移植技术与药物及康复理疗相结合，首先在脑部疾病、肌肉疾病及脊柱疾病治疗领域取得了突破，开启了临床医学治疗历史的又一里程碑。细胞渗透修复疗法自诞生以来受到了全世界医学界的广泛关注，美国脑瘫病协会专家Rachel George;美国Bio cell实验室资深专家Eddie Connar;细胞临床应用研究领域的国内著名

新生小鼠精原干细胞诱导分化精子样细胞

新生小鼠精原干细胞诱导分化精子样细 胞 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 作者：毕聪明，王珅，王军，费东亮，肖银霞 【摘要】目的探讨小鼠精原干细胞体外诱导分化精子样细胞的可行性。方法以7～8日龄小鼠睾丸为材料，采用小鼠睾丸支持细胞作为饲养层，应用维甲酸诱导、成年小鼠睾丸组织液诱导以及低温诱导精原干细胞分化，应用流式细胞仪分析诱导精子样细胞的染色体倍性。采用显微注射法将精子样细胞注射到卵母细胞和去核卵母细胞，观察受精卵的发育状况。结果三种方法诱导精子样细胞比例分别为5.9%、1.6%、0.35%；流式细胞仪分析维甲酸诱导单倍体比率为19.3%；诱导精子样细胞能激活卵母细胞，囊胚发育率20.36%。结论新生小鼠精原干细胞体外可以诱导分化为精子样细胞，并具有激活卵母细胞的能力。 【关键词】精原干细胞分化单倍体小鼠 Abstract: Objective To discuss the possibility of SSCs of Newly-born mice inducing the differentiating Sperm-like cells. Methods Taking the testis of male mice of 7～8 days for material

and adopting the testis of mice , SSCs differentiating were induced by using retinoic acid, tissue fluid of adult mice and low temperature. Flow cytometry was used to analyse the ploidy of chromosome inducing sperm-like cells. Microinjection was used to inject the sperm-like cells into oocytes and enucleate oocytes to observe the development situation of zygotes. Results The proportions of sperm-like cells induced by the three methods were 5.9%,1.6%,0.35% respectively. The rate of Flow cytometry to analyse retinoic acid haploid is 19.3% .The sperm-like cells achieved could activate bovine oocytes by sperm injection (ICSI), and the development rate of blastosphere was 20.36%. Conclusions SSCs of newly -born mice can be induced and differentiated into sperm-like cells and are also capable of activating oocytes. Key words:SSCs; differentiating; haploid; mice 在生精过程中，原始生殖细胞在胚胎期迁移到生殖嵴，经有丝分裂，迅速增殖形成精原干细胞（spermatogoial stem cells， SSCs），然后进一步形成精原细胞。吴应积等［1］利用曲细精管体外共培养法长期培养精原干细胞自分化为精子样细胞，另外应用外源基因修饰的雄性生殖细胞系或青春期的精原干细胞也可分化出精子样细胞［2－5］，通过体内移植使无内源性精子的动物产生精子。但在体外研究

小鼠睾丸支持细胞使用说明

小鼠睾丸支持细胞 小鼠睾丸支持细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠睾丸支持细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠睾丸支持细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠睾丸支持细胞产品简介： 产品名称：小鼠睾丸支持细胞 组织来源：小鼠睾丸 产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠睾丸支持细胞细胞简介： 睾丸支持细胞又称sertoli细胞。它是生精细胞的支架,为其提供必需的营养物质,能合成与分泌雄激素结合蛋白,为其提供高浓度的雄激素环境等,还具有构成血-睾屏障,形成睾丸内微环境,调节精子发生等功能。制备高活率的sertoli 不仅对sertoli的基础研究有重要价值,而且在精子发生等领域有重要意义。本研究旨在建立小鼠sertoli的快速高效分离方法,并根据其分泌FasL的特性,采用细胞免疫化学方法对分离的小鼠sertoli进行鉴定,以期为进一步研究和应用sertoli奠定基础。

PLA生物细胞免疫激活疗法——治疗风湿新技术

PLA生物细胞免疫激活疗法——风湿指定技术 PLA生物细胞免疫激活疗法治疗原理 “PLA生物细胞免疫激活疗法”源于孙思邈《千金要方》对风湿病治疗的100余种药剂记载，但由于只要根据经验抓药，造成起效慢，一定程度上延缓了治疗。后经历代不断革新，逐渐形成了由68味药物为主的治疗方案，并沿袭至今。 2009年，联合全国百名风湿专家，对百年药方进行科研论证的基础上，运用现代纳米技术，萃取出纳米小分子“PLA生物细胞”，发现该分子细胞可将发炎增厚的组织溶解代谢掉，运用到治疗风湿方面，将大量PLA生物细胞通过特异通道到达病灶部位，通过预处理方案中的超大剂量的生物细胞破坏和阻断患者体内所有自身免疫T淋巴细胞克隆和记忆细胞营养供给，清除T淋巴细胞使其失去活性并排出体外。 并能有效阻滞相应神经，使椎间隙拉宽，迅速减轻疼痛，同时在修复免疫功能分子的作用下恢复弹性，承受受压能力。由于输入的PLA生物细胞含有大量营养神经细胞及清除无菌性炎症的药物，可使受压损伤的神经细胞在3-5天内重新再生，使局部创面得到愈合，使由于压迫刺激导致的神经根及椎管内水肿得到消退，疼痛症状消失。 由于PLA生物细胞免疫激活疗法治疗风湿病，不经过血管，而是运用超导向活检实施治疗，比其他方式更容易到达病变位置，药物在病变局部高度集中，随着药物浓度升高，疗效越显着。由于在病变部位进行治疗，所以药物对病变位以外的周围组织影响甚小，避免了全身用药的负面危害，大大减少了药物本身的毒副作用。 PLA生物细胞免疫激活疗法优势 PLA生物细胞免疫激活疗法不仅实现了国际上倡导“能微创不开刀”的绿色治疗理念；同时，该技术将现代临床医学、生物分子学、分子免疫学、微创医学、自身免疫学相融合，

小鼠睾丸生殖细胞标本制作及减数分裂期染色体观察

Isolation and staining of mouse meiotic metaphase chromosomes 小鼠睾丸生殖细胞标本制作及减数分裂期染色体观察 xx 2011级生科四班201100140120 同组者：xx 【实验目的】 1、learn to isolate mouse testes cells and stain with Giemsa. 学会分离小鼠睾丸细胞并用Giemsa染液染色 2、Observe the number and morphology of mouse chromosomes 观察小鼠染色体的数目及形态特征 【实验材料】 【Reagents】 秋水仙素colchicine solution 吉姆萨染液Giemsa stains solution 生理盐水physiological saline 氯化钾溶液KCl solution 固定液fixation solution 【Tools and equipments】 Dissecting tray，beaker，centrifuge tube，microscope，glass slide，pipette，scissors，forceps，copper mesh. 解剖盘，烧杯，离心管，显微镜，载玻片，吸管，剪刀，镊子，铜网 【实验原理】 meiosis is a process of reductional division in which the number of

chromosomes per cell is cut in half. In animals, meiosis always results in the formation of gametes, while in other organisms it can give rise to spores. 减数分裂是细胞分裂染色体数减半的过程，在动物中,减数分裂的结果总是在形成配子,而在其他生物可以产生孢子。 Testosterone is the place where the male germ cell develop and mature,it is the organ that produce sperm. After sexual maturation, sex cells of mammals in the testis is always mature partially. Therefore,have an appropriate treatment to testis enables us to get a variety of chromosomes of different process. 睾丸是雄性动物生殖细胞发育和成熟的部位，是产生精子的器官。哺乳动物在性成熟以后，精巢内的性细胞总是在分批分期不断的成熟，因此，对哺乳动物的精巢进行一定的技术处理，随时都可以获得减数分裂过程中各个时期染色体的标本。 Inject an amount of colchicine solution into the abdomen cavity can prevent the formation of the spindle fiber, so that a large amount of cells in the process of meiotic metaphase can be accumulated. By the normal way of making specimen,we can observe the chromosomes of mouse testosterone 用适量的秋水仙素溶液注入动物腹腔内，可以阻止分裂细胞纺锤丝的形成，从而积累大量处于分裂中期的细胞。利用上述原理，通过常规的制片方法，观察小鼠睾丸细胞的染色体。 Chromosomes are not visible in the cell’s nucleus—not even under a microscope—when the cell is not dividing. However, the DNA that makes up chromosomes becomes more tightly packed during cell division and is then visible under a microscope. Most of what researchers know about