质粒构建流程
质粒构建流程
一、引物设计
1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI
2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。
3）
4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。
5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。
6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。
7）引物设计完成，送公司合成。
二、目的片段获取
1. RNA提取
试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）
准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套
操作步骤：
1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。
2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。
3）4℃，12000rpm离心10min。
4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）
5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀
6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s
7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s
8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s
9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s
10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min
11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min
12）4℃，12000rpm离心60s
13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×
14）-20℃保存
2.RNA反转录
试剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser（-20℃保存）
准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管
操作步骤：
1）基因组DNA去除（10μl体系）
② 5×gDNA eraser buffer 2μl
① gDNA eraser 1μl
Total RNA 4μl(可根据RNA浓度调整)
⑥ RNase free water 3μl
PCR仪中进行，程序：42℃，2min→4℃
注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入
2）反转录反应（20μl体系）
④ 5×primerScript buffer 2 4μl
③ primerScript RT enzyme mix I 1μl
⑤ RT primer mix 1μl
⑥ RNase free water 4μl
1）反应液 10μl
PCR 仪：37℃，15min →85℃，5s →4℃
注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中
-20℃长期保存
3. PCR 扩增
高保真酶primerstar 扩增，50μl 体系如下：
5×PS buffer 10μl
dNTP 4μl
μl
μl
cDNA 1μl(可变)
R-primer 1μl
F-primer 1μl
点样：5μl PCR 产物+ 1μl 6×
4. PCR 产物纯化
1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）
试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol(OMEGA bio-tek) D6293-01
①
② 转移至HiBind MicroElution DNA 柱（套收集管），室温离心10000g ，1min 。
③ 弃废液，加700μl DNA wash buffer （含乙醇）到柱子，室温离心10000g ，1min 。 ④ 弃废液，重复③
⑤ 弃废液，空管离心13000g ，1min
⑥ 柱子放入新EP 管，加10-20μl Elution buffer 到膜上，室温孵育3-5min ，离心10000g ，1min
⑦ 电泳检测
2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）
①
② 加等体积（1g=1ml ）binding buffer （XP2）,60℃金属浴7min 左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min
③ 溶液加入离心柱，离心10000g ，1min ，废液倒回再离一次
④ 弃废液，加300μl binding buffer （XP2），离心10000g ，1min
⑤ 弃废液，加700μl SPW washing buffer ，离心10000g ，1min
⑥ 重复⑤
⑦ 空管离心13000g ，2min ，弃废液，柱子转移到新EP 管
⑧加入30-50μl elution buffer 于膜上，室温孵育1min ，离心13000g ，1min
⑨ 电泳检测
三、双酶切
30μl 反应体系如下：
PCR 纯化产物 15μl
10×M/L/K buffer 3μl
3dH2O 10μl
酶A 1μl
PCR 程序： 95℃ 5min 95℃ 30s 56℃ 30s 35cycle 72℃ 1min 72℃ 10min 注：可根据不同基因调节退货温度，延伸时间，Vector 12μl 10×M/L/K buffer 3μl 3dH2O 13μl 酶A 1μl 酶B 1μl
酶B 1μl
反应条件：takara 酶30℃水浴1h →65℃金属浴10min 终止反应
注：buffer 类别依使用的酶具体选择，见附表
四、连接
1）双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2μl
2）酶切产物液相纯化
3）20μl 连接体系（皆可）
PCR 产物 5μl
μl
10×T4buffer 2μl
T4 ligase 1μl
3dH2O 10μl
PCR 仪中进行：22℃，30min →4℃冰箱过夜
注：连接产物-20℃可长期保存
五、转化
准备：碎冰，灭菌EP 管、LB 空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42℃
1）将感受态细胞置于冰上，待其融化
2）超净工作台中，将连接产物10μl 加入100μl 感受态细胞，或质粒1-3μl 加入100μl 感受态细胞
3）轻混匀，冰浴30min
4）热击水浴42℃，45s ，冰浴1min
5）加900μl LB 空培养基，摇菌150rpm ，37℃，1h
6）浓缩离心13000rpm ，1min ，上清液留约200μl 重悬菌体，部分涂板（50-100μl ）
7）完全吸收后，37℃倒置培养12-16h
六、菌落PCR
1）以rTaq 酶50μl 体系配制PCR 反应液，每个PCR 管分装15μl ，体系如下：
μl 10×buffer 5μl MgCl2 3μl dNTP 4μl μl R-primer 1μl F-primer 1μl 2）灭菌牙签挑单菌落放入PCR 体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。新划的板37℃倒置培养12-16h 。
3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，记录含目的条带的菌落号备用。
七、测序
1. 摇菌
1）PCR 检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌
2）三角瓶中分装10ml LB 抗性液体培养基
3）用10μl 枪头挑起选择的菌落打到培养基中
4）37℃。250rpm 摇菌12-16h
2. 送样
每瓶取1ml 箘液，送华大基因测序
3. 比对
μl μl 10×T4buffer 2μl T4 ligase PCR 程序：
95℃ 5min
95℃ 30s
56℃ 30s 35cycle
72℃ 1min
72℃ 10min
注：程序与DNA 扩增一样
将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。
（注：数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试）
八、菌种保存
菌种比对成功，则可保存菌种备用。
1）μl 80%灭菌甘油。
2）再加入800μl 箘液，轻混匀。
3）液氮冻存。（一个基因冻2管即可）
九、质粒提取
菌种比对成功，冻存菌种后，箘液用于提取质粒。
试剂盒：AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep
操作步骤：
1）取3-5ml箘液，室温下离心10000g，1min
2）弃上清，加250μl solution I/ RNase A 重悬菌落，混匀
3）加250μl solution II，倒置轻混匀，孵育2min。（整个裂解反应不超过5min）
4）加入250μl solution III，立即倒置混匀，直到生成白色絮状沉淀。
5）室温离心13000g，10min
6）上清液小心转入HiBind miniprep column(有套管)，室温离心10000g，1min
7）弃废液，加500μl buffer HB，室温离心10000g，1min
8）选择性步骤：重复第7步
9）弃废液，空管室温离心13000g，2min
10）柱子转入新EP管，加30-50μl elution buffer或3dH2O到膜上，室温孵育1-2min 11）室温离心13000g，1min
12）提取的质粒-20℃保存备用
附：
感受态制备方法（皆采用LB空白培养基）：
1. 菌种活化
1）α菌种，在LB平板上划线，37℃倒置培养16h
2）挑单菌落转到2-10ml LB液体培养基中，摇菌37℃，250rpm，12-16h
3）取1ml箘液加入到100ml LB液体培养基，摇菌37℃，250rpm，3h
4）检测箘液OD
≤
600
2.感受态制备
4℃预冷。
准备： CaCl
2
步骤：
1）将箘液用50ml离心管分装，调平，4℃离心3000rpm，8min
10ml重悬（冰水中进行，动作轻），两管合成一管
2）弃上清， CaCl
2
3）冰上放置一段时间，4℃离心2500rpm，8min
4）弃上清， CaCl
10ml重悬，4℃冰箱过夜沉淀
2
5）上清液取出8ml，剩2ml，加670μl 80%甘油（箘液：80%甘油=3:1），轻混匀6）μl ，液氮冻存。
试剂配制：
琼脂糖粉
1×TAE 50ml
微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1μl gold view核酸染料，混匀，倒板1.电泳缓冲液TAE（50×）
2mol/L tris-碱 242g
二蒸水至1L
×溶液使用。
2.LB培养基
Yeast extract（酵母提取物） 1g
Tryptone 2g
NaCl 2g
Agar powder（琼脂粉） 3g
二蒸水 200ml
灭菌20min，冷却后加入抗生素。
（）
3.CaCl
2
CaCl
2
H
O 100ml
2
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤 令狐采学 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与
载体构建流程
载体构建SOP流程: GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒 I.获取目的基因/序列片段 一.获取序列信息 通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。 PCR引物的设计原则： ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。 ⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。
⑩避免在引物的3’端使用碱基A。 在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。 二.制备模板 1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可
专升本药学选择题
专升本药学选择题 本题答案：c 第2题下列哪种片剂不宜用硬脂酸镁作润滑剂 本题答案：c 第3题专门治理的药品是指 本题答案：d 第4题湿法制粒工艺流程图为 本题答案：b 第5题用以补充体内水分及电解质的输液是 本题答案：e 第6题舌下片应符合以下哪一条要求 本题答案：D 第7题调配处方时，如发觉处方书写不符合要求或有差错，药剂人员的正确做法是 本题答案：A
第8题关于医院制剂叙述错误的是 本题答案：A 第9题药材含水量一样为多少，大量生产浸出制剂应结合生产体会，定出含水量的操纵标准（）。 A．8%～lO% B．3%～5% C．9%～16% D．12%～20% E．30%～50% 本题答案：C 第10题欲称取0.1g药物，按规定其相对误差不超过±10%，选用天平的分度值为 本题答案：C 第11题某药物的组织结合率专门低，讲明 本题答案：D 第12题非处方药分为甲、乙两类的按照是 本题答案：D 第13题西药或中成药处方，每张处方不得超过 本题答案：B
第14题口服缓释制剂可采纳的制备方法是 本题答案：D 第15题PVP是指 本题答案：B 第16题我国的药品质量监督治理的原则不包括 本题答案：C 第17题OTC分为甲、乙两类的要紧依据是 本题答案：D 第18题《药品治理法》规定，医疗机构配制制剂必须取得 本题答案：E 第19题禁止公布广告的药品是 本题答案：C 第20题甲氧氯普胺增加对乙酰氨基酚的吸取速度，其机制是本题答案：A
第21题栓剂的吸取途径中通过肝脏的首过作用的是 本题答案：A 第22题仅供皮肤使用的液体剂型是 本题答案：E 第23题关于纳米载药系统叙述错误的是 本题答案：A 第24题《药品治理法实施条例》规定，个人设置的门诊部、诊所等医疗机构不得 本题答案：A 第25题乳剂中，若水为分散相，油为连续相，则会制成何类型的乳剂 本题答案：B 第26题《医疗机构制剂许可证》的有效期为 本题答案：D 第27题我国药品技术监督的最高机构是 本题答案：D
载体构建的基本步骤
载体构建 一．原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二．操作步骤 1．摇菌 取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。2．提质粒 依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。 3．酶切 按下表加入试剂。 反应所需试剂体积（单位：ul） 质粒10 所需内切酶反应缓冲液 2 所需限制性内切核酸酶 1 H2O 7 将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度） 4．电泳检测 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。 5．连接 如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接，连接体系如下： 双蒸水5μL 10×T4 DNA连接缓冲液1μL 载体2μL 酶切后的目的基因1μL T4DNA连接酶1μL 总体积10μL 置于温箱，12-16℃，保温8-16h 6．转化 依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。 7．单克隆检测 （1）挑单克隆
先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。 （2）单克隆检测 以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL，加到3ml（有LB液体培养液，AMP+）试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序，并保种。 注：①挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑。 ②别忘记往培养基中加AMP。 ③用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌。 三．注意事项 1．连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验； 2．在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间； 3．连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控制好连接温度。 4．进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制DNA 片段的自身环化。 参考： 1.刘进元，常智杰，赵广荣,等.分子生物学实验指导[M].北京:清华大学出版社，2002 2.周俊宜.分子生物学基本技能和策略[M].北京：科学出版社，2003：117-120 3.李海英，杨峰山，邵淑丽,等.现代分子生物学与基因工程[M].北京:化学工业出版社，2008:138-142 4.朱旭芬.基因工程实验指导[M].北京：高等教育出版社，2006:134-139
片剂的题目
片剂 一、名词解释 溶出度；泡腾崩解剂；湿法制粒；稀释剂；粘合剂；崩解剂；糖衣片；肠溶衣片； 口腔贴片；分散片；口含片；植入片； 二、判断题 1. 片剂加入表面活性剂后，可改善其润湿性，加快其崩解。 2．片重差异受压片时颗粒流动性的影响。 3. 咀嚼片常用甘露醇作为稀释剂,通常情况下不加崩解剂。 4. 片剂径向加压测得破碎所需之力称为表面硬度。 5. 片剂制备必须具备的三个条件是流动性、压缩成型性、良好的崩解 性 6．片剂包糖衣的步骤：包粉衣层、包糖衣层、包有色衣层、打光。 7. 片剂中最常用的润滑剂是轻质氧化镁 8. 片剂中包衣前后，均需进行片重差异的检查。 9. 片剂包糖衣过程中常用虫腊作打光层。 10. 环糊精是常用的片剂稀释剂。 三、填空题 1、根据辅料的作用特点，片剂的辅料可分为稀释剂、、润湿 剂、和润滑剂等 2、可供粉末直接压片的填充剂有、、等 3、制粒过程中常用的润湿剂主要有、。 4、淀粉浆的制备方法有和两种。
5、崩解剂的加入方法有法、法和法。 6、广义的润滑剂包括、、三种。 7、干法制粒有和法。 8、片剂崩解迟缓的原因主要有、、 和压力过大的原因等。 9、凡检查的制剂，不必检查片重差异，凡检查的制剂，不必检查崩解度。 10、CAP是指邻苯二甲酸醋酸纤维素、在片剂中用作__________材料。 11、片剂中根据崩解剂的种类不同其崩解的作用机理有__________、__________、 __________、酶解作用。 四、单选题 1、下列片剂的叙述错误的为( )。 A.片剂为药物与辅料均匀混合后压制而成的片状制剂 B.片剂的生产机械化，自动化程度较高 C.片剂的生产成本及售价较高 D.片剂运输、贮存、携带及应用方便 2、下列是片剂的特点的叙述，不包括 A.体积较小，其运输、贮存及携带、应用都比较方便
药剂学期末复习试题库附答案_(1)
药剂学期末复习试题库附答案_(1) 题目：药剂学概念正确的表述是 答案A 研究药物制剂的处方理论、制备工艺和合理应用的综合性技术科学 答案B 研究药物制剂的基本理论、处方设计、制备工艺和合理应用的综合性技术科学答案C 研究药物制剂的处方设计、基本理论和应用的技术科学 答案D 研究药物制剂的处方设计、基本理论和应用的科学 题目编号： 0102 第 1 章 1 节页码难度系数： A 题目：中国药典中关于筛号的叙述,哪一个是正确的（）。 药剂学期末复习试题库附答案_(1) 答案B 一号筛孔最大,九号筛孔最小答案C 最大筛孔为十号筛 答案D 二号筛相当于工业200目筛 药剂学期末复习试题库附答案_(1)题目：下述中哪相不是影响粉体流动性的因素（）。 药剂学期末复习试题库附答案_(1) 答案B 含湿量答案C 加入其他成分答案D 润湿剂 药剂学期末复习试题库附答案_(1) 题目：用包括粉体本身孔隙及粒子间孔隙在内的体积计算的密度为（）。 药剂学期末复习试题库附答案_(1) 答案B 真密度答案C 粒密度答案D 高压密度 药剂学期末复习试题库附答案_(1)题目：下列关于胶囊剂的叙述哪一条不正确（）。 药剂学期末复习试题库附答案_(1) 答案B 可提高药物的稳定性答案C 可避免肝的首过效应答案D 可掩盖药物的不良嗅味 药剂学期末复习试题库附答案_(1) 题目：配制含毒剧药物散剂时,为使其均匀混合应采用（）。 药剂学期末复习试题库附答案_(1) 答案B 振摇法答案C 搅拌法 答案D 等量递增法 药剂学期末复习试题库附答案_(1)题目：药物剂量为0.01-0.1g时可配成（）。 药剂学期末复习试题库附答案_(1)答案B.1:100倍散答案C.1:5倍散
慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
药剂学-第4章.doc
第四章固体制剂-1（散剂、颗粒剂、片剂、片剂的包衣） 固体制剂常用的固体制剂包括：散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、膜剂等 固体制剂的共性：（1）物理、化学稳定性比液体制剂好，生产制造成本较低，服用与携带方便；（2）制备过程前处理的单元操作经历相同；（3）药物在体内首先溶解后才能透过生理膜，被吸收入血。 固体剂型的制备工艺流程图 对于固体制剂来说 药物需溶解后才能被胃肠道所吸收，特别是对一些 口服制剂吸收的快慢顺序：溶液剂> 混悬剂> 散剂> 颗粒剂> 胶囊剂> 片剂> 丸剂 三、Noyes-Whitney方程 ●药物溶出速度可用Noyes-Whitney方程描述： dC/dt=KS (C S-C) K=D/Vδ 式中：K- 溶出速度常数S-溶出界面面积D-药物的扩散系数CS-药物的溶解度δ-扩散边界层厚C-药物的浓度V-溶出介质的量 改善药物溶出速度的措施： （1）增大药物的溶出面积（粉碎，崩解）（2）增大溶解速度常数（加强搅拌）（3）提高药物的溶解度（提高温度，改变晶型，制成固体分散物等） 粉碎技术、药物的固体分散技术、药物的包合技术等可以有效地提高药物的溶解度或溶出表面积。 对于难溶性药物提高溶出度的有效方法是： 第二节散剂 ●散剂（Powders）系指一种或数种药物均匀混合而制成的粉末状制剂，可外用也可内服。 特点:①粉碎程度大，比表面积大、易于分散、起效快；②外用覆盖面积大，可以同时发挥保护和收敛等作用；③贮存、运输、携带比较方便；④制备工艺简单，剂量易于控制，便于婴幼儿服用。此外还有飞散性、附着性、团聚性、吸湿性等特点 散剂的制备物料前处理→粉碎→过筛→混合→分剂量→质量检查→包装储存 ●固体药物的粉碎是将大块物料借助机械力破碎成适宜大小的颗粒或细粉的操作。 ●粉碎度或粉碎比（n）n = D1/D2 D1粉碎前的粒度D2粉碎后的粒度 粉碎操作的意义： ●有利于提高难溶性药物的溶出速度以及生物利用度； ●有利于各成分的混合均匀； ●有利于提高固体药物在液体、半固体、气体中的分散度； ●有助于从天然药物中提取有效成分等。 粉碎机有（1）研钵（2）球磨机（3）冲击式粉碎机（4）流能磨等 （三）筛分 筛分法（sieving method)是借助筛网孔径大小将物料进行分离的方法。筛分的目的是为了获得较均匀的粒子群（四）混合 ●混合（mixing）将两种以上组分的物质均匀混合的操作统称为混合。混合操作以含量的均匀一致为目的，是保证制剂产品质量的重要措施之一。混合度（degree of mixing）是表示物料混合均匀程度的指标。大小介于0~1之间。混合机理：对流混合、剪切混合、扩散混合。三种混合方式在实际的操作过程中并不是独立进行，而是相互联系的。 混合的影响因素
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 （4） P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使 G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。
制药工艺流程
海蛤壳、厚壳贻贝抗炎清火口含片 制药工艺设计 专业：生物技术（海洋生物制药） 2015年 7 月 9 日
目录 1 工艺概述....................................................错误!未定义书签。 设计背景.................................................错误!未定义书签。 片剂特点.................................................错误!未定义书签。 海蛤壳、厚壳贻贝抗炎清火口含片特点.......................错误!未定义书签。 湿法制粒压片工艺特点.....................................错误!未定义书签。 2 处方设计及工艺流程..........................................错误!未定义书签。 处方设计.................................................错误!未定义书签。 工艺流程图...............................................错误!未定义书签。 工艺设计.................................................错误!未定义书签。 粉碎.................................................错误!未定义书签。 筛分.................................................错误!未定义书签。 混合.................................................错误!未定义书签。 制湿颗粒.............................................错误!未定义书签。 压片.................................................错误!未定义书签。 包衣.................................................错误!未定义书签。 包装.................................................错误!未定义书签。 储存.................................................错误!未定义书签。 3 物料衡算....................................................错误!未定义书签。 物料衡算概念.............................................错误!未定义书签。 基本程序.................................................错误!未定义书签。 损耗率计算...............................................错误!未定义书签。 实际年产量...............................................错误!未定义书签。 所需生产能力.............................................错误!未定义书签。 物料衡算的意义...........................................错误!未定义书签。
质粒构建流程
质粒构建流程 一、引物设计 1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI 2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。 3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1(+)， 4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。 5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。 6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。 7）引物设计完成，送公司合成。 二、目的片段获取 1. RNA提取 试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存） 准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套 操作步骤： 1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。 2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。 3）4℃，12000rpm离心10min。 4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl） 5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀 6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s 7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s 8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s 9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s 10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min 11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min 12）4℃，12000rpm离心60s 13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。14）-20℃保存 2.RNA反转录 试剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser（-20℃保存） 准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管 操作步骤： 1）基因组DNA去除（10μl体系） ② 5×gDNA eraser buffer 2μl ① gDNA eraser 1μl
湿法制粒设备综述
湿法制粒设备综述 班级：学号：姓名： 摘要：所有的固体制剂的制备过程几乎都离不开制粒过程。而制粒方法大体分两大类，湿法制粒和干法制粒。传统的湿法制粒是目前制粒的主要方法。湿法制粒设备主要有这几种：挤压式制粒机、转动制粒机、高速搅拌制粒装置、流化床制粒机、喷雾制粒机、复合型制粒机等。 关键字：湿法制粒，湿法制粒设备，制粒机，复合型制粒设备 制粒是把粉末、熔融液、水溶液等状态的物料经加工制成具有一定形状与大小粒状物的操作。几乎所有的固体制剂的制备过程都离不开制粒过程。所制成的颗粒可能是最终产品，如颗粒剂；也可能是中间产品，如片剂。而制粒方法大体分两大类，湿法制粒和干法制粒。传统的湿法制粒是目前制粒的主要方法。 目前，常用的湿法制粒设备有挤压式制粒机、转动制粒机、高速搅拌制粒机、流化床制粒机、喷雾制粒机。此外，对制粒技术及产品的要求越来越高，为了发挥流化床制粒的优势，出现了一系列以流化床为母体的多功能的新型复合制粒设备。 1.挤压式制粒机 挤压式制粒机是将药物粉末与处方中的辅料混合均匀后加入黏合剂制软材，然后将软材用强制挤压的方式过筛制粒。这种制粒设备有螺旋挤压式、旋转式挤压式、摇摆挤压式等。 特点： 1）颗粒的大小由筛网的孔径大小调节，可制得粒径范围在0.3～30mm做左右，粒度分布较窄，粒子形状多为圆柱状、角柱状； 2）颗粒的松软程度可用不同黏合剂及其加入量调节，以适应压片的需要； 3）制粒前必须混合、制软材等，程序多、劳动强度大，不适合大批量和连续生产； 4）制备小粒径颗粒时筛网的寿命短。 在挤压制粒过程中，制软材（捏合）是关键步骤，黏合剂用量过多时软材被挤压成条状，并重新黏合在一起。黏合剂用量过少时不能制成完整的颗粒，而成粉状。因此，在制软材的过程中选择适宜黏合剂及适宜用量是非常重要的。 挤压式制粒机的工作原理以哈尔滨科海制药设备厂出售的这一款制粒机为例做介绍。 粉末物料经配料混合后，由专用加料机（气动上料或机动上料）从制粒机顶端加料口加入料仓内，送料仓上下端各配有一套料位计，根据物料加入量的变 化自动加料，粉末物料经一根横向螺旋送料浆将物料推送入另一根 枞向螺旋送料浆，将物料挤压入下部的压辊间挤压成型，当粉末物 料通过这两段横向纵向螺旋送料浆时，由于两根浆叶的直径和转速 不同，粉末与物料会形成预挤压，在物料挤压过程中，如果物料中 的空气没有经过有效的去除，那么压合成型的物料会出现开裂和破 碎，碎片和细粉量将会大大增加。故本机另配有真空脱气系统，真 空除气装置会去除物料中含有的空气量，从而有效的解决这一问题。 在某些案例中，可以使产量提高4-5倍，压合效率提高40%。挤压
湿法制粒干燥连线
文件编号生效日期设备编号版本号分发部门 湿法制粒干燥连线 用户要求标准 设备编号：
文件编号生效日期设备编号版本号分发部门 修订索引 修订号日期修订理由 附录号图文号详细内容
文件编号生效日期设备编号版本号 分发部门 内容目录 1.0批准签名 (4) 2.0综述 (5) 2.1项目介绍 (5) 2.2项目标准 (5) 2.3设备描述 (5) 2.4设备参考标准/指导方针 (5) 3.0设备要求与需求参数 (6) 4.0生产要求 (9) 5.0安全要求 (10) 5.1概要 (10) 5.2电力故障和恢复 (10) 6.0GMP要求 (10) 6.1工艺控制 (10) 6.2故障探测 (11) 6.3清洁要求 (11) 6.4资格要求 (11) 6.5结构材料 (12) 6.6润滑油使用 (12) 6.7GMP (12) 6.8数据完整性 (12) 6.9批记录打印 (12) 6.10所需文件 (13) 6.11培训 (14) 6.12GMP要求（其它） (14) 7.0技术要求 (15) 7.1 基础技术要求 (15) 7.2 特殊要求 (15) 8.0 良好工程规范 (16) 8.1 检查和试验 (16) 9.0约束 (16) 9.1设备位置和可利用空间 (16) 9.2可利用公用设备 (16) 9.3时限 (17) 9.4 包装要求 (17) 9.5 服务 (17)
文件编号生效日期设备编号版本号 分发部门 批准签名 该文件是在山东罗欣药业口服固体制剂项目经理的授权下，由山东罗欣药业项目组起草的。因此，该文件生效前，应由山东罗欣药业QA批准，项目主管审定。 起草人 姓名/职务签名日期 设备安全员 审核人 姓名/职务签名日期 使用部门经理 设备设施管理部经理 质量保证部经理 运营副总经理 生产副总经理 质量副总经理 批准人 姓名/职务签名日期 分厂总经理
图文转换之流程图
图文转换之流程图 广州市80中学高三备课组刘少军 【教学目的】：1．回顾图文转换漫画类、表格类做题方法； 2．了解图文转换各种题型； 3．掌握图文转换中流程图、方位图的做题方法。【教学重点】：掌握图文转换中流程图、方位图的做题方法。【教学难点】：让学生答题更规范。 【教学方法】：练习法、讨论法、点拨法。 【教学手段】：多媒体课件 【课时安排】：一课时 【教学过程】： 一．导入（从回顾考点入手） 1、这一类是什么题型？（漫画类） 2、这一类又是什么题型？（图表类） 3、这个考点考什么能力？（回顾考点） 图文转换即将图画、图表等材料转换为文字表述。图文转换综合考查考生对材料的的分析能 力，要求从图画、图表等材料中筛选信息，进行分析、综合，并运用简明的语言概括出观点。这种 题型在最近的广东、全国卷中都出现了，应该引起足够的重视。 近年高考语文科的命题，更加突出对考生语文综合能力的考查，注重考生创造能力的发挥， 试题注意情境的设置，内容更贴近现实生活，题型更加灵活，体现语用题“稳中求新”特点，大家
应该注意这些命题的动向。 考查能力：属于语言表达应用能力，D级。 二卷主观题，分值一般为2—6分。 题型：包括把“图”信息直接表述为文字和对“图”信息推断总结两类。 二、回顾图文转换漫画类、表格类做题方法： （一）审题干（不漏一字----读出答题暗示） （二）观察理解 ? 1、注意图中出现的所有文字? 2、注意挖掘隐含的深意 图画（漫画） 3、注意细节（特别是变化情况）? 4、注意画面主体（从此角度陈述）? 5、注意联想和想象 ? ? 1、注意表格的标题注释等重要信息 图表 2、分析数据，观察变化情况，寻找规律，同类归在一起 ? 3、据题目要求对信息舍次留主? 4、据题目要求进行总结推断? （注意调查者的目的） （三）表述（注意字数、句式、内容的要求） （四）检查 三、讲练结合，在练习中使学生掌握流程图的特点和解题思路 1、06年广东高考题 科学家培根等人曾提出一种科学知识增长的模式(如下图)。请你用简洁的语言表述这一模 式。
第七章 片剂习题#(精选.)
第七章片剂 一、A型题(最佳选择题) 1、下列是片剂的特点的叙述，不包括 A、体积较小，其运输、贮存及携带、应用都比较方便 B、片剂生产的机械化、自动化程度较高 C、产品的性状稳定，剂量准确，成本及售价都较低 D、可以制成不同释药速度的片剂而满足临床医疗或预防的不同需要 E、具有靶向作用 2、下列哪种片剂是以碳酸氢钠与枸橼酸为崩解剂 A、泡腾片 B、分散片 C、缓释片 D、舌下片 E、植入片 3、红霉素片是下列那种片剂 A、糖衣片 B、薄膜衣片 C、肠溶衣片 D、普通片 E、缓释片 4、下列哪种片剂要求在21℃±1℃的水中3分钟即可崩解分散 A、泡腾片 B、分散片 C、舌下片 D、普通片 E、溶液片 5、下列哪种片剂可避免肝脏的首过作用 A、泡腾片 B、分散片 C、舌下片 D、普通片 E、溶液片 6、下列哪种片剂用药后可缓缓释药、维持疗效几周、几月甚至几年 A、多层片 B、植入片 C、包衣片 D、肠溶衣片 E、缓释片 7、微晶纤维素为常用片剂辅料，其缩写和用途为 A、CMC粘合剂 B、CMS崩解剂 C、CAP肠溶包衣材料 D、MCC干燥粘合剂 E、MC填充剂 8、粉末直接压片时，既可作稀释剂，又可作粘合剂，还兼有崩解作用的辅料 A、甲基纤维素 B、微晶纤维素 C、乙基纤维素 D、羟丙甲基纤维素 E、羟丙基纤维素 9、主要用于片剂的填充剂是 A、羧甲基淀粉钠 B、甲基纤维素 C、淀粉 D、乙基纤维素 E、交联聚维酮 10、主要用于片剂的粘合剂是 A、羧甲基淀粉钠 B、羧甲基纤维素钠 C、干淀粉 D、低取代羟丙基纤维素 E、交联聚维酮
11、最适合作片剂崩解剂的是 A、羟丙甲基纤维素 B、硫酸钙 C、微粉硅胶 D、低取代羟丙基纤维素 E、甲基纤维素 12、主要用于片剂的崩解剂是 A、CMC—Na B、MC C、HPMC D、EC E、CMS—Na 13、可作片剂崩解剂的是 A、交联聚乙烯吡咯烷酮 B、预胶化淀粉 C、甘露醇 D、聚乙二醇 E、聚乙烯吡咯烷酮 14、片剂中加入过量的哪种辅料，很可能会造成片剂的崩解迟缓 A、硬脂酸镁 B、聚乙二醇 C、乳糖 D、微晶纤维素 E、滑石粉 15、可作片剂的水溶性润滑剂的是 A、滑石粉 B、聚乙二醇 C、硬脂酸镁 D、硫酸钙 E、预胶化淀粉 16、可作片剂助流剂的是 A、糊精 B、聚维酮 C、糖粉 D、硬脂酸镁 E、微粉硅胶 17、一贵重物料欲粉碎，请选择适合的粉碎的设备 A、球磨机 B、万能粉碎机 C、气流式粉碎机 D、胶体磨 E、超声粉碎机 18、有一热敏性物料可选择哪种粉碎器械 A、球磨机 B、锤击式粉碎机 C、冲击式粉碎机 D、气流式粉碎机 E、万能粉碎机 19、有一低熔点物料可选择哪种粉碎器械 A、球磨机 B、锤击式粉碎机 C、胶体磨 D、气流式粉碎机 E、万能粉碎机 20、一物料欲无菌粉碎请选择适合的粉碎的设备 A、气流式粉碎机 B、万能粉碎机 C、球磨机 D、胶体磨 E、超声粉碎机 21、湿法制粒压片工艺的目的是改善主药的 A、可压性和流动性 B、崩解性和溶出性 C、防潮性和稳定性 D、润滑性和抗粘着性 E、流动性和崩解性 22、湿法制粒工艺流程图为 A、原辅料→粉碎→混合→制软材→制粒→干燥→压片 B、原辅料→粉碎→混合→制软材→制粒→干燥→整粒→压片 C、原辅料→粉碎→混合→制软材→制粒→整粒→压片 D、原辅料→混合→粉碎→制软材→制粒→整粒→干燥→压片 E、原辅料→粉碎→混合→制软材→制粒→干燥→压片
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT
载体构建 一、原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二、操作步骤 1、摇菌（制作感受态细胞备用） 取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。 2、提质粒（也就是载体） 依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。 3、酶切（双酶切产生粘性末端） 反应所需试剂体积（单位：ul） 质粒 10 所需内切酶反应缓冲液 2 所需限制性内切核酸酶 1 H2O 7 将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度） 4、电泳检测 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。 回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能； 检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。 5、载体与目的基因连接 如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。置于温箱，12-16℃，保温8-16h 6、转化（连接产物转化到感受态细胞中） 依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃， 12-16h。 7、单克隆检测 （1）挑单克隆 先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的 AMP，用枪头混匀；取 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。 （2）单克隆检测 以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μ
制粒工艺流程
制粒工艺流程 集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
总的工序流程：领料→拆料→处理→投料→制软材（叫粘合剂）→制湿颗粒→干燥→整粒→称重混合（加草莓粉末香精）→储存 一原辅料粉碎过筛 1.相关流程：预算领取物料>上报统计员拿取领料单>仓库领料至物净间 点数(检查外包装袋有无破损,如有破损应及时与仓库人员说明情况)> 拆外包装消毒放置原辅料存放间>过筛置备料间。（做好标识，并填写生产记录与管理记录） 2.头孢克肟颗粒使用原辅料过筛目数：头孢克肟过100目，甘露醇过60 目，交联聚维酮过60目。 3.如何提前预算领取的物料数量。 确保足够的备料量，需根据周生产计划量和岗位原辅料使用记录来确定，提前领取的物料数量。 4.在仓库领料需做的工作 核对物料的批号、品名、数量、进库批号，并且拿相应的物料检验报告单。 5.拆除处包装，需检查物料处包装是否破损，物料颜色是否异常有变化 的情况并及时反馈给质检员或工艺员。 6.拆除外包装的物料需用3%的过氧化氢消毒物料外表面，并贴上物料 卡，拉置原辅料存放间。 7.原辅料粉碎过筛，应核对对处理物料所需筛网目数，物料品名，批 号，数量更换品种必须换筛网清洗摇摆机。 8.物料过筛后收率应不低于99.5%。
9.处理后的物料应将原始批号，进库批号，物料总重量报至工艺员处。 10.对于不合格的物料应放回到原包装或原物料桶内并做好密封与标识。二．投料称量 11.（一）生产前的准备。 12.1.检查工作区已没有存在任何与本次生产无关的残留物或生产记录 等，并已清洁消毒且在有效期内。 13.2.检查生产区内的压差，温度，温度是否在规定范围内。 14.3.在工艺员领取本次需生产的指令单和所需记录。（记得复核指令 单） 15.4.根据指令单，在生产门口挂上生产状态牌，并填写相应的产品名 称，批号，规格，生产日期。 16.5.生产前，用标准砝码校准秘需的衡器。 17.6．在需用生产的设备，衡器上换挂上生产状态牌（正在运行） 18.7.领取所需的生产用具，工具，容器等，并确认清洁消毒在有效期 内。 19.8.根据指令单，领取已处理的原辅料，并核对品名，批号。 20.（二）操作 21.1．启动称量罩5分钟，开启地秤，待显示为0.00时，将600L IBC 推上地秤，并除皮（即显示0.00），翻起过板桥并固定好。 22.2．根据指令单核对物料品名，批号，然后用提升机投料至600L IBC 中，根据指令单的净重，准确称取，即百分百投料，所有的物料以去皮方式依次投入。