16SrRNA

关于细菌的16srRNA和16srDNA

分子生物学技术的应用使肠道微生态学的研究取得了突破性的发展。目前研究最多的是16S rRNA。近几年来国外学者采用不同的分子生物学方法对细

菌的16SrRNA进行研究，得到了广泛的细菌

16SrRNA序列库。使用该方法可以检测肠道中常规方法不能培养或生长缓慢的细菌。rRNA分子在生物体中普遍存在，生物细胞rRNA分子的一级结构中既具有保守的片段，又具有变化的碱基序列。在生物进化的漫长过程中,rRNA分子保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序,同时也存在着与进化过程

相一致的突变率,在结构上可分为保守区(conserveddomain)和可变区(variabledomain), 保守的片段反应了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则能表明物种间的差异，那些保守的或高变的特征性核苷酸序列则是不同分类级别生物（如科、属、种）鉴定的分子基础。研究rRNA基因序列可以发现各物种间的系统发生(phylogenesis)关系。细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16SrRNA长约1540bp,结构和碱基排列复杂度适中,较易于进行序

列测定和分析比较。16SrDNA是细菌染色体上编码

16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成[62]。因此可用PCR扩增其相应的rDNA片断，来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，或进行细菌多样性分析，尤其是那些人工无法培养的微生物。Woese(1980)在比较200多种原核生物和真核生物的16S(或18S)rRNA/rDNA的核苷酸序列谱后,定义建立了古细菌界(包括产甲烷菌、极端嗜盐菌和极端嗜热菌),将生物界重新划分为3主干6界系统,即古细菌、真细菌和真核生物3个主干,真核生物又包括原生动物、真菌、植物和动物4界。因为古细菌虽然细胞结构和真细菌相似,但在脂类和细胞壁分子结构上

有较大差异,16SrRNA碱基序列分析结果也表明古细

菌与真细菌之间的同源性差异不小于原核和真核生

物之间的差异。现在人们已经认同16SrRNA/rDNA

基因序列可用于评价生物的遗传多态性

(geneticdi-versity)和系统发生关系

（p hylogeneticrelation-ship),在细菌分类学中可作

为一个科学可靠的指标。在分类鉴定一些特殊环境下的微生物时,由于分离培养技术的限制,难以获得它们

的纯培养进行生理生化学等指标的分析,这样

16SrRNA/rDNA序列分析的优越性就体现出来了。近

来许多研究人员从环境微生态系统中直接分离提取出16SrRNA/rDNA并进行序列分析,研究了包括哺乳动物肠道、沼泽淤泥和反刍动物瘤胃等许多复杂系统的微生物组成情况,并发现了一些传统培养法研究未发现的新种类。

DGGE （Denaturing Gradient Get Electrophoresis, DGGE）技术是由Fischer 和Lerman 于1979 年最先提出的用于检测DNA 突变的一种电泳技术。它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,可以检测到一个核苷酸水平的差异。1985 年Muzyers 等首次在DGGE 中使用“GC夹板”和异源双链技术,使该技术日臻完善。为了避免建立基因文库的繁杂劳动,Muyzer等(1993)将遗传指纹技术(geneticfingerprinttech-niques)引进了微生物生态学研究中,在经过样品DNA分离和PCR 扩增获得16SrDNA片段后,通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)直接获得

16SrDNA片段组成图谱(即遗传指纹),进而得到待研究体系的微生物组成信息。

细菌的16S rRNA的序列有10个保守区和9个高变区（V1-V9）之分，其中保守区为所有细菌共有，细菌间无差别，能反映生物物种的亲缘

关系，可变区具有属或种的特异性，序列则随菌间的亲缘关系不同而有一定的差异，所以能揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标，利用这一特性设计引物来进行物种鉴定。

DNA测序原理和方法.

DNA测序原理和方法 DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。 【原理】ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。 它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA 测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。 由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。【试剂与器材】 1．BigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP 和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。 2．pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板0.2g/L，试剂盒配套试剂。 3．M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。 4．DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR 反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。 5．引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。 6．灭菌去离子水或三蒸水。 7．0.2ml或和0.5ml的PCR管盖体分离，PE公司产品。 8．3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。 9．70%乙醇和无水乙醇。 10．NaAc/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。11．POP 6测序胶ABI产品。

新一代测序技术的发展及应用前景

２０１０年第１０期杨晓玲等：新一代测序技术的发展及应用前景 等交叉学科的迅猛发展。 １．１第二代测序——高通量低成本齐头并进以高通量低成本为主要特征的第二代测序，不再需要大肠杆菌进行体内扩增，而是直接通过聚合酶或者连接酶进行体外合成测序¨】。根据其原理又可分为两类：聚合酶合成测序和连接酶合成测序。１．１．１聚合酶合成测序法Ｒｏｃｈｅ公司推出的４５４技术开辟了高通量测序的先河。该技术通量可达Ｓａｎｇｃｒ测序的几百倍，而成本却只有几十分之一，因此一经推出，便受到了国际上基因组学专家的广泛关注。４５４采用焦磷酸合成测序法ＨＪ，避免了传统测序进行荧光标记以及跑胶等繁琐步骤，同时利用乳胶系统对ＤＮＡ分子进行扩增，实现了大规模并行测序。截止到２０１０年４月，已有７００多篇文献是采用了４５４测序技术（ｈｔｔｐ：／／４５４．ｃｏｍ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｎｄ—ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｓｐ），对该技术是一个极大的肯定。 Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司推出的Ｓｏｌｅｘａ遗传分析仪是合成技术的进一步发展与延伸。该技术借助高密度的ＤＮＡ单分子阵列，使得测序成本和效率均有了较大改善。同时Ｓｏｌｅｘａ公司提出的可逆终止子”１也是该技术获得认可的原因之一。与４５４相比。Ｓｏｌｅｘａ拥有更高的通量，更低的成本。虽然片段长度较短仍是主要的技术瓶颈，但是对于已有基因组的物种来说，Ｓｏｌｅｘａ理所当然成为第二代测序技术的首选。２００８年以来，利用该技术开展的研究大幅度上升，报道文献达４００多篇（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｓｙｓｔｅｍｓ／ｇｅｎｏｍｅ—ａｎａｌｙｚｅｒ＿ｉｉｘ．ｉｌｍｎ）ｏ １．１．２连接酶合成测序法２００７年ＡＢＩ公司在Ｃｈｕｒｃｈ小组拍１研究成果的基础上推出了ＳＯＬＩＤ测序仪。该技术的创新之处在于双碱基编码…的应用，即每个碱基被阅读两次，因此大大减少了测序带来的错误率，同时可以方便的区分ＳＮＰ和测序错误。在测序过程中，仪器自动加入４种荧光标记的寡核苷酸探针，探针与引物发生连接反应，通过激发末端的荧光标记识别结合上的碱基类型。目前ＳＯＬＩＤ３．０测序通量可达２０Ｇ，而测序片段仅有３５—５０ｂｐ，这使得该技术与Ｓｏｌｅｘａ相比，应用范围还不够广泛。ＡＢＩ公司正加快研发进度，争取在片段长度方面做出重大突破。 ＤａｎａｈｅｒＭｏｔｉｏｎ公司推出Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ¨１测序仪同样也是基于Ｃｈｕｒｃｈ小组的研究成果，但是该设备的成本要低很多，同时用户在使用时可以根据自己的研究目的设置不同的测序条件。而ＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅ—ｎｏｍｉｃｓ公司推出的ＤＮＡ纳米阵列与组合探针锚定连接测序法＂１则具有更高的容错能力，试剂的消耗也进一步减少，目前已顺利完成３个个体基因组的测序工作。 １．２第三代测序——单分子长片段有望实现第二代测序技术虽然在各方面都有了较大的突破，但是仍然建立在ＰＣＲ扩增的基础上。为了避免ＰＣＲ扩增带来的偏差，科学家目前正在研制对ＤＮＡ单个分子直接测序的第三代测序仪。最具代表性的包括Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ单分子测序仪，单分子实时合成测序法，纳米孔测序技术等。 Ｈｅｌｉｃｏｓ技术仍然是基于合成测序原理¨…，它采用了一种新的荧光类似物和灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了其他方法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｅｅｓ公司研发的单分子实时合成测序法充分利用了ＤＮＡ聚合酶的特性，可以形象的描述为通过显微镜实时观测ＤＮＡ聚合酶，并记录ＤＮＡ合成的整个过程。纳米孔测序技术［１１’１２１则是利用不同碱基在通过纳米小孔时引起的静电感应稍有不同，或者不同碱基通过小孔的能力各有差异，来加以区分不同的碱基信号。 ２应用与实践 Ｋａｈｖｅｊｉａｎ在２００８年的一篇综述中提到¨“：“如果你可以随心所欲地测序，你会开展哪些研究？”。人类基因组计划的完成和近年来高通量测序的兴起，使越来越多的科研工作者认识到，我们对于生物界的认识才刚刚起步。基因图谱的绘制并不意味着所有遗传密码的破解，癌症基因组的开展也没有解决所有的医学难题。ＤＮＡ变异的模式和进化机制，基因调控网络的结构和相互作用方式，复杂性状及疾病的分子遗传基础等，仍是困扰生物学家和医学家的难题，而高通量测序的广泛应用，也许可以让我们知道的更多。 ２．１ＤＮＡ水平的应用 ２．１．１全基因组测序新一代测序技术极大地推

16SrRNA SOP文件

16SrRNA SOP文件 检测方法： （一）细菌基因组DNA的提取： 向200μl的无菌PCR管中加入50μl无菌水，挑取已纯化的单个菌落于其中充分混匀，调制菌液至1-2浊度，震荡15秒钟，盖好管盖置100℃沸水中煮沸 10min，取出后于冰上放置3—5分钟后，13000转离心5分钟，取上清液约 30ul即为DNA提取液 （二）16SrRNA基因的PCR扩增：50 μl 体系 2×PCR Mix 25 μl 上游引物：1μl 下游引物：1μl Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.5μl DNA 模板 1 μl ddH2O 21.5μl 16SrRNA基因的检测引物： 27F：5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’ 1492R: 5’-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGAC-3’ 16SrRNA基因的PCR反应参数： 94 ℃8 min； 94 ℃40 s 55 ℃(53℃) 40 s 30循环 72 ℃1 min 30 s 72 ℃8 min 4℃保存 注：每次配制PCR反应体系时，应多制备一个体积，以防由于（三）琼脂糖电泳检测： 1×TAE电泳缓冲液的配制：

50×TAE缓冲液：Tris碱121g，冰醋酸28.56mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）50mL，加去离子水定容至500ml室温保存备用，使用时先将50×TAE缓冲液稀释成1×TAE缓冲液。1%琼脂糖凝胶的配制： 称取0.3g琼脂糖，加入30 mL 1×TAE电泳缓冲液，于微波炉中加热溶解，取出后用水冷却至50℃，加入,3μl的goldview核酸染料；将上样梳固定于胶槽内，将制备好的胶液小心地倒入胶板内，使胶液缓慢展平，确保没有气泡后，将胶槽于室温放置使胶液完全凝固。 胶液完全凝固后，将凝胶置于电泳槽内，添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1—2mm，取4μl产物于胶孔内，100V电泳25分钟。 检测： 将电泳后的凝胶于紫外线下观察，16SrRNA基因的条带位于1500bp处

2017年二代基因测序市场分析

二代基因测序市场分析 目录 一、二代测序资本市场融资火爆 二、二代测序为何如此受市场追捧？ 三、测序市场当前现状及存在的问题 四、未来趋势判断及启示 一、二代测序资本市场融资火爆 在整个体外诊断市场，生化和免疫经过多年的发展，市场格局已基本形成；分子诊断目前市场规模还不大，但增速较快，潜力被广泛看好。在分子诊断的不同技术平台中，又以近两年随着“精准医疗”概念迅速崛起的二代测序（NGS）领域最受关注，国内就存在上百家同类企业，且资本市场融资火爆，估值也是居高不下。简单梳理了几个较有代表性的融资案例如下： 1、华大基因 华大基因是国内基因测序领域的领导者，在NGS产业链上、中、下游均有所布局。2012 年-2015 上半年营收分别为7.95亿、10.47亿、11.32亿、5.65亿，净利润对应 8500万、1.73亿、5900万，8200万。2015 年最近一轮融资引进 PE机构以 191 亿估值作为增资及转让的定价基础，引入和玉高林及中国人寿，融资20 亿元，投后估值 210亿。而华大基因按照其IPO的计划定价得出估值约为156亿元，相当于相较一级市场的估值，华大基因的估值实际已缩水超过50亿元，出现了一二级市场的倒挂。

2、贝瑞和康 贝瑞和康成立于 2010 年，利用二代测序平台，在 NIPT 领域占据了主要的市场，全国 100 家医疗机构获得 NIPT 试点资格，70％使用贝瑞和康的仪器及试剂。2015 年底最近一轮融资估值 100 亿，融资金额 3.3 亿左右，引入了海通兴泰、尚融宁波、中信锦绣等机构；2016 年 12 月，上市公司天兴仪表作价 43 亿元购买贝瑞和康 100％股权，若交易完成，贝瑞和康将成功借壳上市。值得关注的是，贝瑞和康 43 亿的借壳价与此前一级市场百亿估值相比，有着较大的出入，同样出现了一二级市场的倒挂，其原因在于市场对贝瑞和康的预期降低还是之前 PE入股时估值过高，也是值得思考推敲的。 3、碳云智能 2015 年 10 月成立，由原华大基因 CEO 王俊等联合创办，定位在“医疗+人工智能”方向，运用人工智能技术进行数据处理，目标是打造智能健康管理大数据平台。成立半年左右，即 2016 年 3 月完成 A 轮融资，融资金额 10 亿元，估值约 65 亿元，腾讯、中源协和、天府集团等机构领投。碳云智能所锚定的大数据积累及解读这个细分相对而言存在一定的门槛，是未来的一个发展方向，但存在的难度及障碍也很大，还有很漫长的路要走。天使期就以如此高的估值融到资更多的还是王俊的“名人”效应，但即使是 65 亿的高估值，王俊依然表示：这只是碳云智能最便宜的时候。 4、燃石医学 2014 年成立，定位于基于 NGS 平台的肿瘤精准医疗基因诊断领域，产品线包括基于组织层面的靶向药物用药指导、易感基因筛查及液体活检，目前以 LDT的形式进行检测。2015 年下半年曾以 15 亿估值获投资机构 1.5 亿元投资，今年正以 30 亿估值融资 2 亿元，进展未知。

我国基因测序行业研究-行业政策、发展状况

我国基因测序行业研究-行业政策、发展状况 （一）行业政策 当前，生物技术在引领未来经济社会发展中的战略地位日益凸显，现代生物技术的一系列重要进展和重大突破正在加速向应用领域渗透。我国政府为加快推进生物技术与生物技术产业发展，打造国家科技核心竞争力和产业优势，对于生物产业，尤其是基因测序领域，加大了产业扶持力度，先后推出了多项相关政策、规划等产业指导。 （1）中华人民共和国国民经济和社会发展第十三个五年规划纲要2016 年3 月，全国人民代表大会发布“十三五”规划指出，支持新一代信 息技术、生物技术、精准医疗等新兴前沿领域创新和产业化，形成一批新增长点。加强前瞻布局，在生命科学等领域，培育一批战略性产业。加快发展合成生物和再生医学技术，打造未来发展新优势。战略性新兴产业发展行动指出，加速推动基因组学等生物技术大规模应用，建设网络化应用示范体系，推进个性化医疗，新型药物，生物育种等新一代生物技术产品和服务的规模化发展，推进基因库细

胞库等基础平台建设。 （2）“十三五”国家科技创新规划 2016 年7 月，国务院印发《关于“十三五”国家科技创新规划的通知》，规划指出：加快推进基因组学新技术、合成生物技术、生物大数据等生命科学前沿关键技术突破，加强生物产业发展及生命科学研究核心关键装备研发，提升我国生物技术前沿领域原创水平，抢占国际生物技术竞争制高点；把握生物技术和信息技术融合发展机遇，建立百万健康人群和重点疾病病人的前瞻队列，建立多层次精准医疗知识库体系和国家生物医学大数据共享平台，重点攻克新一代基因测序技术、组学研究和大数据融合分析技术等精准医疗核心关键技术，开发一批重大疾病早期筛查、分子分型、个体化治疗、疗效预测及监控等精准化应用解决方案和决策支持系统，推动医学诊疗模式变革。 （3）促进和规范健康医疗大数据应用发展的指导意见 2016 年6 月，国务院办公厅发布《关于促进和规范健康医疗大数据应用发 展的指导意见》，意见指出：依托现有资源建设一批心脑血管、肿瘤、老年病和儿科等临床医学数据示范中心，集成基因组学、蛋白质组学等国家医学大数据资

三代测序原理技术比较

导读从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。 摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序 技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1：测序技术的发展历程 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA 合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为 sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。 值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。

焦磷酸测序技术的原理

Pyrosequencing技术的原理 Pyrosequencing是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本原理如下： 第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。 第2步：向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3‘末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。 第2步图示(图片来自互联网) 第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。 第3步图示(图片来自互联网) 第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。 第4步图示(图片来自互联网) 第5步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

第4步图示(图片来自互联网) Pyrosequecing技术操作简单，结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。 →如果您认为本词条还有待完善，请编辑词条 上一篇SNP（单核苷酸多态性）下一篇阅读质粒图谱 具体事例 【摘要】建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称“SRPP”)。先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签，PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码，使得测序结果中的序列代表基因的来源，峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证，结果表明，SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量，并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。 【关键词】序列标记反转录, 聚合物链反应，焦磷酸测序，基因表达 1 引言 差异表达基因与疾病密切相关，深入研究可在基因水平揭示疾病的发病机制。目前，用于检测基因表达水平的技术主要有SAGE法[1]、实时荧光定量PCR法[2,3]和基因芯片法[4]等。但这些方法存在仪器设备昂贵、定量性能差以及同时测定基因表达量的来源数目受限等缺点。 焦磷酸测序技术是新近发展起来的一种基于酶催化化学反应的测序技术[5～8]，不需要使用荧光标记，定量性能好。目前，焦磷酸测序技术多用于单核苷酸多态性(SNP)分析、微生物分型和基因甲基化分析等。本研究将焦磷酸测序技术用于基因表达量差异的比较分析，考察了其可行性和准确性，并将其应用于检测Egr1基因在糖尿病、肥胖症和正常小鼠中的差异表达。 2 实验部分 仪器、试剂与材料

16SrRNA基因在临床上的应用进展

19Engedal N ,Ertesvag A ,Blomhoff HK.Survival of activated human T lym phocytes isprom oted by retinoic acid via induction of I L 22[J ].Int Immunol ,2004,16(3):4432453. 20S tephensen C B ,Ras ooly R ,Jiang X ,et al.Vitam in A enhances in vitro Th2 development via retinoid X receptor pathway[J ].J Immunol ,2002,168(9):449524503. 21G eissmann F ,Revy P ,Brousse N ,et al.Retinoids regulate survival and antigen presentation by immature dendritic cells[J ].J Exp M ed ,2003,198(4):6232634.22H oag K A ,Nashold FE ,G overman J ,et al.Retinoic acid enhances the T helper 2cell development that is essential for robust antibody responses through its action on antigen 2presenting cells [J ].J Nutr ,2002,132(12):373623739. 23M alaba LC ,Iliff P J ,Nathoo K J ,et al.E ffect of postpartum maternal or neonatal vitam in A supplementation on in fant m ortality am ong in fants born to HIV 2negative m others in Z imbabwe[J ].Am J Clin Nutr ,2005,81(2):4542460. (收稿日期:2005206228)(本文编辑:赵英卓) 16S rRNA 基因在临床上的应用进展 Progress in Clinical Application of 16S rRNA G ene 杨祖卿(综述)　尚世强(审校) (浙江大学医学院附属儿童医院,杭州310003) 【摘要】　传统的细菌检测主要依靠血清学、生物化学、细菌形态学及细菌培养等方法进行分类鉴定,但前三者敏感性和特异性不高,后者费时且阳性率低。近10余年来分子生物学技术发展迅速,各种基因方法如DNA 杂交、质粒图谱和16S rRNA 序列分析等在临床上得到广泛应用。该文就近年来国外16S rRNA 在细菌学研究及其应用的一些新进展作一综述。 【关键词】　RNA ,核糖体,16S;　基因 【中图分类号】　Q522 【文献标识码】　A 【文章编号】100123512(2005)0420252204 16S rRNA 基因是细菌染色体上编码rRNA 的相对应的DNA 序列,存在于所有细菌及衣原体、立克次体、支原体、螺旋体、放线菌等原核生物的染色体基因中,不存在于病毒、真菌等非原核生物体内。16S rRNA 具有以下特点:(1)多拷贝。以多拷贝形式存在于细菌染色体基因组中;(2)多信息。编码基因由可变区和保守区组成,保守区为所有细菌共有,细菌间无差别;可变区具有属或种的特异性,可据此设计引物、探针。(3)长度适中。其编码基因长度约1500bp 。目前,几乎所有病原菌的16S rRNA 基因测序均已完成,因此被选为细菌病原体PCR 扩增部分或全部序列的目标[1]。1　研究方法 1.1　基因芯片技术　基因芯片技术也称DNA 微阵列(DNA arrays ),指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或 者直接将大量DNA 探针以点涂的方式有序地固化于支持物表面,然后与标记的样品杂交,通过对杂交信号的检测分析,即可得出样品的信号(基因序列或表达信息)。其突出特点在于高度的并行性、多样性、微型化和自动化。有时胶体电泳会得出模糊的结果,非特异的PCR 产物使电泳解释显得困难,而芯片杂交却不会 作者简介:杨祖卿(19762),男,浙江苍南人,在读硕士研究生,主要从事儿童感染性疾病的分子生物学研究。 为这一问题所困扰;短的产物和阵列杂交更有效,PCR 效果更好,因为芯片杂交不会受限于产物的长度以至不能鉴别[2]。 1.2　单链构象多态性分析　单链构象多态性分析的 基本原理是单链DNA 呈现复杂的构象,而这种立体构象主要是依靠单链内碱基配对等分子内相互作用维系的,当碱基发生改变时,必然会影响其构象改变。一旦变性,单链DNA 片段采用一种基于其序列上的特定构象,通过非变性凝胶电泳保持这种构象。这种情况导致了那些具有类似大小却有不同序列的PCR 产物在电泳移动度上有一个变化,这允许它们在检测点不需要完全测序就能区别开来[3]。聚丙稀酸胺凝胶电泳可敏锐地检测单链DNA 序列改变所导致的构象变化。小于400bp 的DNA 片段经变性、双链解链为单链条件下进行聚丙稀酸胺凝胶电泳,根据迁移率的改变可发现具有一个bp 变异的DNA 链。细菌16S rRNA 的保守区是理想的引物目标识别区,而可变区对种类鉴别是有用的。细菌的16S 核糖体基因证实种类特异的序列变异性导致一种DNA 片段构象很容易被单链构象多态性分析所证明。 1.3　荧光定量技术　T aq Man 技术的基本原理[4]是利 用T aq 酶的5′23′外切酶核酸活性,在普通引物5′端和3′端中添加一条荧光双标记探针,分别标记上荧光报

16SrRNA

关于细菌的16srRNA和16srDNA 分子生物学技术的应用使肠道微生态学的研究取得了突破性的发展。目前研究最多的是16S rRNA。 近几年来国外学者采用不同的分子生物学方法对细菌的16SrRNA进行研究，得到了广泛的细菌 16SrRNA序列库。使用该方法可以检测肠道中常规方法不能培养或生长缓慢的细菌。rRNA分子在生物体中普遍存在，生物细胞rRNA分子的一级结构中既具有保守的片段，又具有变化的碱基序列。在生物进化的漫长过程中,rRNA分子保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序,同时也存在着与进化过程相一致的突变率,在结构上可分为保守区 (conserveddomain)和可变区(variabledomain),保守的片段反应了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则能表明物种间的差异，那些保守的或高变的特征性核苷酸序列则是不同分类级别生物（如科、属、种）鉴定的分子基础。研究rRNA基因序列可以发现各物种间的系统发生(phylogenesis)关系。细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。 其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16SrRNA长约1540bp,结构和碱基排列复杂度适中,较易于进行序列测定和分析比较。16SrDNA是细菌染色体上编码 16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成[62]。因此可用PCR扩增其相应的rDNA片断，来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，或进行细菌多样性分析，尤其是那些人工无法培养的微生物。Woese(1980)在比较200多种原核生物和真核生物的16S(或18S)rRNA/rDNA的核苷酸序列谱后,定义建立了古细菌界(包括产甲烷菌、极端嗜盐菌和极端嗜热菌),将生物界重新划分为3主干6界系统,即古细菌、真细菌和真核生物3个主干,真核生物又包括原生动物、真菌、植物和动物4界。因为古细菌虽然细胞结构和真细菌相似,但在脂类和细胞壁分子结构上有较大差异,16SrRNA碱基序列分析结果也表明古细菌与真细菌之间的同源性差异不小于原核和真核生物之间的差异。现在人们已经认同16SrRNA/rDNA基因序列可用于评价生物的遗传多态性

2016-2022年中国基因测序市场竞争调研与发展前景分析报告

2016-2022年中国基因测序市场竞争调研与发展前景分析报告 中国报告网

2016-2022年中国基因测序市场竞争调研与发展前景分析报告 中国报告网发布的《2016-2022年中国基因测序市场竞争调研与发展前景分析报告》首先介绍了基因测序行业市场相关概念、分类、应用、经营模式，行业全球及中国市场现状，产业政策生产工艺技术等，接着统计了行业部分企业盈利、负债、成长能力等详细数据，对行业现有竞争格局与态势做了深度剖析；结合产业上下游市场、营销渠道及中国政策环境，经济环境，对行业未来投资前景作出审慎分析与预测。 第一章基因测序行业发展综述12 第一节基因测序的定义12 一、基因测序的定义12 二、基因检测的定义12 三、基因测序与基因检测的逻辑关系12 第二节国内基因测序相关政策15 第三节基因测序技术分析17 一、第一代基因测序技术17 二、第二代基因测序技术18 三、第三代基因测序技术19 四、三代基因测序技术对比21 ?【报告来源】中国报告网https://www.wendangku.net/doc/bc411574.html, ?【交付方式】Email电子版/特快专递 ?【价格】纸介版：7200元电子版：7200元纸介+电子：7500元 第二章基因测序产业链分析27 第一节基因测序产业链简介27 一、基因测序产业链简介27 二、产业链企业竞争力不断提升27 第二节基因测序仪器29 一、基因测序仪发展历程29 二、基因测序仪市场规模36 三、基因测序仪市场格局37 四、基因测序仪并购进程38 五、基因测序仪最新进展43 六、基因测序仪选购因素45 第三节基因测序试剂46 一、国内检测试剂的分类46 二、基因测序试剂市场格局47 三、基因测序试剂最新进展50 第四节基因测序服务51 一、国内基因测序服务处于世界领先水平51

三代测序原理技术比较

三代测序原理技术比较

三代测序技术和原理介绍 导读从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。 摘要：从1977年第一代DNA测序技术 （Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。

第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中

分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。 值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。

基因检测行业调研

基因检测行业调研 继上次基因检测产业调研之后，这两周我们再次调研了几家基因检测公司，并且拜访了一些行业专家，现将调研的重点内容整理如下，欢迎大家交流探讨。 一、基因检测公司梳理 目前全国涉及基因检测概念的公司有200余家，按照业务范围划分，这些公司可以分为：①最上游的基因检测仪器开发企业（测序仪、芯片扫描仪、PCR设备），②提供样本处理试剂和耗材的中上游企业（建库试剂盒、检测试剂盒、工具酶、基因芯片），③提供第三方基因检测服务的中游企业，④提供测序数据存储、分析和出具报告的下游企业，⑤还有将这三部分整合起来提供CRO服务的商业公司，当然如果公司研发实力和经济实力允许，大部分公司会选择向上下游产业链延伸，进一步提升自己的盈利能力。 按照基因检测公司的服务内容，主要可以分为四类：科研服务、第三方临床基因检测服务、直接面向个人的检测服务、非医疗基因检测服务（例如食品、环境、刑侦等方面的应用）。 1 科研中的基因检测服务又分为两种情况，第一种是纯科研服务，检测目的纯粹是满足科研需要，不作为医学诊断的依据；第二种是以科研的名义为患者提供医学诊断服务，医生在其中起主导作用，推荐有需要的患者去做基因检测，医生在其中所获得的好处是得到用药指导依据、科研数据、获得销售提成，这是当前肿瘤基因测序普遍采用的手段，因为目前国内还没有一种获批临床的肿瘤高通量检测试剂盒，只能以科研的形式变相的进行医学诊断从而获取收益。纯科研基因检测市场在百亿级别。 2 第三方临床检测机构是指批准为医院提供检测外包服务的独立医学检验实验室，大部分第三方临检机构都能开展分子诊断服务（需通过临检中心的PCR实验室认证），例如QPCR、ddPCR、基因芯片等，但是高通量测序在临床检测上的应用当前受到限制，只有在试点名单上的机构才能出具正式的临检报告，目前出台了第一批四个领域的试点名单，分别是遗传病诊断、产前筛查与诊断、植入前胚胎遗传学诊断、肿瘤基因测序，试点单位名单由卫计委医政医管局和妇幼司共同制定。临床基因检测的市场空间在千亿级别。 3 提供面向个人基因检测服务的商业公司，提供的是非诊断性基因检测，例如23andMe是美国本地唯一一家被FDA批准的能够直接向个人提供基于基因检测分析服务公司，业务范围也仅仅提供祖源分析、遗传病筛查、酒精耐受、基因寻亲这四类遗传分析服务，23andMe此前的疾病风险筛查和药物过敏分析被禁止，而我国有许多直接面向个人的基因检测商业机构，业务范围甚至包括疾病风险、天赋基因、个性特征分析等一系列基因分析服务，未来有加强监管和整合的压力。商业化B2C基因检测的市场空间在十亿级别。

新一代高通量测序技术SOLiD简介

新一代高通量测序技术SOLiD简介 目前市场上有四种高通量测序仪，分别是Solexa，454 (GS-FLX)，SOLiD和Polonator。根据测序原理，它们可以被分为两大类：使用合成法测序(Sequencing by Synthesis)的Solexa和454，及使用连接法测序(Sequencing by Ligation)的Polonator和SOLiD。这些高通量测序仪的共同点是不需要大肠杆菌系统进行DNA模板扩增，且测序所得序列较短：其中的454序列最长，为200～300个碱基，其余三种序列都只有几十个碱基。测序原理及序列长度的差异决定了各种高通量测序仪具有不同的应用领域。这就要求我们在熟悉各种高通量测序仪内在技术特点的基础上进行选择。 基因组所引进的SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)是ABI（Applied Biosystems）公司生产的高通量测序仪。目前这台SOLiD运行稳定，SOLiD实验及数据分析小组也可以为大家提供专业的技术服务。所以接下来的关键是如何把SOLiD测序仪应用到符合其技术特点的科研项目中。本短文将简单介绍SOLiD测序流程，双碱基编码原理及数据分析原理，以帮助大家了解SOLiD测序仪的技术特点和应用范围。 1.SOLiD关键技术及其原理 SOLiD使用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。 1.1. SOLiD文库构建 使用SOLiD测序时，可根据实际需要，制备片段文库(fragment library)或末端配对文库(mate-paired library)。简单地说，制备片段文库就是在短DNA片段（60～110 bp）两端加上SOLiD 接头（P1、P2 adapter）。而制备末端配对文库，先通过DNA环化、Ecop15I酶切等步骤截取长DNA片段（600bp到10kb）两末端各25 bp进行连接，然后在该连接产物两端加上SOLiD接头。两种文库的最终产物都是两端分别带有P1、P2 adapter的DNA双链，插入片段及测序接头总长为120～180 bp。 1.2:油包水PCR 我们知道，文库制备得到大量末端带P1、P2 adapter但内部插入序列不同的DNA双链模板。和普通PCR一样，油包水PCR也是在水溶液进行反应，该水相含PCR所需试剂，DNA模板及可分别与P1、P2 adapter结合的P1、P2 PCR引物。但与普通PCR不同的是，P1引物固定在P1磁珠球形表面(SOLiD将这种表面固定着大量P1引物的磁珠称为P1磁珠)。PCR反应过程中磁珠表面的P1引物可以和变性模板的P1 adapter负链结合，引导模板合成，这样一来，P1引物引导合成的DNA链也就被固定到P1磁珠表面了。 油包水PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”，基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR 反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介导的PCR反应，这个DNA模板的拷贝数量呈指数级增加，PCR反应结束后，P1磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同来源DNA模板扩增产物。A BI公司提供的SOLiD 实验手册已经把小水滴体积及水相中DNA模板和磁珠的个数比等重要参数进行了技术优化和流程固定，尽可能提高“优质小水滴”(水滴中只含一个DNA模板一个P1磁珠)的数量，为后续SOLiD 测序提供只含有一种DNA模板扩增产物的高质量P1磁珠。

16SrRNA基因技术在环境科学领域中的应用_乐毅全

·综　述· 收稿日期:2003-04-10作者简介:乐毅全(1962-),男,浙江宁波人,现就读于同济大学环境工 程专业博士研究生,讲师。 16S rRNA 基因技术在环境科学领域中的应用 乐毅全,顾国维 (同济大学污染控制与资源化国家重点实验室,上海　200092) 摘要:随着分子生物学的发展,16S r RNA 基因技术被逐渐应用到环境科学领域中。目前在环境保护和治理中,该技术主要被 用于鉴定污染物的生物降解菌和分析环境样品中的微生物群落多样性,由于它不必将微生物培养分离出来,也就避免了在培养过程中可能出现的微生物丢失的情况。本文对16S r RN A 基因技术及其在环境科学领域中的应用现状和发展作了一简要介绍,并对16S r RNA 基因技术存在的不足进行了讨论。关　键　词:16S r RNA 基因序列;DNA 扩增;多样性分析 中图分类号:Q 938 文献标识码:A 文章编号:1001-3644(2003)06-0001-04 The Application of 16S rRNA Gene Technology on Environmental Sciences LE Yi -quan ,GU Guo -w ei (National K ey L aboratory of Pollution Control and Resources Reuse , Tongji University ,S hanghai 200092,China ) A bstract :With the development of mo lecular biology ,the 16S rRNA gene technique has been gradually used in environmental sci -ences .N ow ,this technique has been mainly applied to identify the pollutant -biodegradation bacteria and to analyse the diversity of mi -croorganism community in enviro nmental samples .Because it is unnecessary to culture the microorg anisms by traditional metho ds ,it can avoid the situation of losing the microorg anisms during the culture .I n this paper ,it briefly introduces that the development and the use of 16S rRN A gene technique on enviro nmental sciences .T he disadvantage of 16S rRNA gene technique is also discussed .Key words : 16S rRNA g ene sequence ;DNA amplifica tio n ;diversity analysis 1　微生物体内的16S rRNA 基因及其应用 核糖体存在于每个合成蛋白质的细胞中,在原核微生物中,核糖体是分散在细胞质中的亚微颗粒,细菌的核糖体由三种相对分子量不同的rRNA 组成,分别为5S rRNA 、16S rRNA 和23S rRNA 。其中16S rRNA 的长度在1475-1544核苷酸之间,含有少量修饰碱基,16S rRNA 的结构十分保守。 Pace 等[1] 在20世纪80年代首先利用rRNA 基因(rDNA )来确定环境中的微生物,通过对5S rRNA 基因的序列分析来研究微生物的生态和进化,由于5S rRNA 基因相对较小(约120个核苷酸),携带的信息较少,而随后开展的16S rRNA 基因序列可以携带更多的信息,效率更高。 以16S rRNA 基因为基础,结合DNA 扩增(PCR )技术,近年来发展出一种新的分子生物学手 段,即通过对16S rRNA 基因的DNA 序列分析,可以分析细菌的种类信息,并且已经逐渐成为微生物分类和鉴定中非常重要而且有用的指标和手段。目前在生物学上,有关16S rRNA 基因的工作很多,集中在以下两个方面: 1.1　对未知生物的分类鉴定 相对于传统的微生物形态、生理生化指标,DNA 由于其稳定性和保守性,逐渐为人们所关注,随着生物学研究手段的发展,把生物的DNA 信息作为生物分类鉴定的指标已经成为可能,如G +C %、DNA 杂交、DNA -rRNA 杂交和16S rRNA 碱基顺序分析等。 rRNA 由于含量大,已成为细菌系统分类学研究中最常用的方法,其中16S rDNA 序列的相对稳定而又高度保守,可以为细菌鉴定提供相对稳定可靠的信息。目前,已有10000种以上的细菌的16S rDNA 序列被报道,并且每年以很快的速度补充到Genebank 中。利用特异的引物对未知的来自细菌的DNA 样品 — 1—四川环境2003年第22卷第6期 DOI :10.14034/j .cn ki .schj .2003.06.001