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PCR产物的纯化

PCR产物的纯化（回收）

一、器材

移液枪（100，10，2μL）及其枪头，PCR反应管及其加子，镊子，标记笔

二、试剂及其用量

1、反应体系50μL，按下列顺序加样

ddH2O 36. 4+0.3μL

10×PCR Buffer 5μL

dNTPs 2μL

P1 1μL

P2 1μL

Taq 0.3μL

cDNA template 4μL

2、PCR产物回收试剂盒（E.Z.N.A. Gel Extraction Kit）

三、步骤

1、目的基因的PCR扩增

1）、按照以上试剂及其用量加到PCR反应管，经过适当的混匀后可放到PCR仪进行PCR扩增。

3）、琼脂糖凝胶电泳

吸取一定量的6×Loading Buffer 1μL加到每一个PCR产物（50μL），吹打混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁加入8μL DL2000DNA Marker 作对照，以150V左右电压进行电泳，约15min后于紫外灯下观察结果。

2、切胶：若结果为阳性的话，把该凝胶置于紫外灯台对其目的条带的胶粒进行切割，放入空的1.5Ep管中；

3、加入300μLBinding Buffer，盖实管口，标记，再用力甩一甩；

4、放入76℃烘箱进行加热，其间需要把Ep管摇动2-3次，使胶粒完全溶解。

5、低速离心一会；

6、将上述溶胶液加入到HiBind spin-column中；

7、离心（1min，最大速）

8、把收集管中的液体再倒入column中再进行离心（同上）；

9、弃去收集管中的液体（此时把DNA Elution Buffer拿至76℃烘箱进行预热）；

10、加入700μLSPW Buffer，静置2min，离心（1min，最大速）弃收集管中的液体；

11、重复10；

12、空甩：空管离心（5min，最大速），以弃去DNA回收柱中的残余液体；

13、将DNA回收柱放入新的1.5mLEp管中，并加入30μL DNA Elution Buffer至膜的中央，室温放置1min；

14、离心（1min，最大速），以收集纯化的DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测后于-20℃保存。

四、注意事项

1、电泳时应换用新配制的TBE buffer，否则会由于电泳缓冲液的pH升高而降低DNA的产量；

2、在切下含目的DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜（如一次性手套），使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染；

3、切胶过程要尽可能短，防止DNA在紫外线下长时间暴露引起突变，且要把含有目的DNA的胶块尽可能小的切下，以利于后续步骤的进行；另外，切时人要带眼罩；

4、DNA的洗脱效率与Elution Buffer 的pH有关，因此用ddH2O洗脱DNA时，应调节ddH2O的pH值至8.0；

5、空甩后应用最小的枪头把DNA柱子管壁剩余的水珠干净。

天然产物分离与纯化

茶叶中茶多酚的提取分离纯化重庆大学课程论文学生姓名：何英学号：20161902017t 专业：生物学学科门类：理学重庆大学生物工程学院二O一六年十月

摘要茶叶中含有600多种化学成分，组分极为复杂。茶叶中的无机矿物质有27种，大多数都是人体健康所必须物质。茶叶中的有机物茶多酚与儿茶素类物质、咖啡碱、茶多糖等决定了茶叶色泽、香气、滋味、营养及保健功效。本文总结了茶多酚为主要内容物的提取纯化及性质为主要内容，对比不同方法的优异，按要求选择一条合适的工艺路线。溶剂浸提法工艺简单、技术成熟。离子沉淀法选择性强、纯度较高但是损失大、收率低、安全性低。树脂吸附法虽工艺简单、纯度高、能耗低但是溶剂用量大、成本高。超临界流体萃取法纯度高但是设备要求高、成本高，不适合大剂量的提取茶多酚。超声波浸提法高效、节时、提取率高但噪音污染，不适合长期使用。微波浸提法高效、节能、节时、提取率高但具有微波辐射。膜分离法工艺简单，环境污染小但纯度低。所以根据不同的要求、设备、成本需要选择不同的方法。关键词：茶叶，茶多酚，提取方法

1绪论茶叶起源于我国，后流传于世界。至今，地球上引种茶树的国家已经达到了60多个，近年来世界茶叶种植面积总数达290万公顷[1]。我国是产茶大国，进入21世纪以来，我国的茶产量稳居世界第一[2]。科学研究和临床医学实验表明，茶叶有降血糖、降血脂、抗癌、抗衰老、抗辐射等诸多保健作用，这与茶叶中的有效功能成分密不可分。茶叶中的有效成分包括茶多酚、茶多糖、咖啡碱、茶氨酸、茶蛋白等。所以，用中低档茶叶为原料，提取分离有效成分，大力发展茶叶深加工技术，不仅可以开辟中低档茶叶市场、充分利用茶叶资源，也将成为我国茶叶行业发展的新方向。茶多酚作为茶叶中最主要的功能性成分，使其成为目前天然产物研究的热点，由于具有多种生理活性和功能，在医疗保健、食品行业、日用品等领域都得到了广泛的应用。因此，优化提取工艺，分离提纯茶多酚具有十分重要的经济和社会效益。目前，国内茶多酚生产企业基本上采用的是溶剂法制备茶多酚，该方法生产周期长，温度高，所制备的茶多酚含量和活性低，且由于在生产过程中使用氯仿等有机溶剂，不仅操作不安全，产品还存在有毒溶剂残留问题，其品质难以满足国内外市场的需求，造成茶多酚产品销售困难，大量积压，同时溶剂法对环境的污染较大，不符合绿色化生产发展的方向。因此，需要选择一条合理，绿色，创新的生产工艺，提高茶多酚产品的质量，实现资源、环境、经济、社会一体化发展。

几类类天然产物的提取分离方法

几类类天然产物的提取分离方法本人总结了一些分离方法，以抛砖引玉！总述 1)提取前文献查阅综述和药材生药鉴定2)提取方法 ①粉碎成粗粉 ②有机溶剂法和水提法③水蒸气蒸馏法④升华法 3)分离纯化法 ①根据物质溶解度的不同进行分离 a.温度不同,溶解度不同 b.改变溶液的极性去杂 c.酸碱法 d.沉淀法 ②根据物质分配比不同极性分离 a.液-液萃取法 b.反流分布法 c.液滴逆流层析法 d.高速逆流层析法 e.GC法 f.LC法:LC分配层析载体主要有---硅胶,硅藻土,纤维素等;有正反相之分;压力有低、中、高之分;载量有分析、制备之分。 ③根据物质吸附性不同极性分离 a.※极性吸附剂（如SiO2,Al2O3...)极性强，吸附力大 ※非极性吸附剂(如活性炭－对非极性化合物的吸附力强(洗脱时洗脱力随洗脱剂的极性降低而增大)。 b.化合物的极性大小依化合物的官能团的极性大小而定; 溶剂的极性大小可按其介电常数大小排列（极性渐大> ）: 己烷苯无水乙醚CHCl3 AcOEt 乙醇甲醇水e 1.88 2.29 4.47 5.20 6.11 26.0 31.2 81.0 c.氢键力吸附聚酰胺吸附层析--洗脱剂的洗脱力由小到大为: 水> 甲醇> 丙酮> NaOH液> 甲酰胺> 尿素水液 ④根据物质分子的大小进行分离如葡萄糖凝胶(Sephadex G and LH-20...)过泸法等 ⑤根据物质解离程度不同的分离法离子交换法：强酸：-SO3H 强碱：-N+(CH3)3Cl- 弱酸：-CO2H 弱碱：-NH2(NH,N) 一、糖及苷类的提取和分离 1 溶剂处理法 2 铅盐沉淀法 3 大孔树脂处理法 4 柱色谱分离法二醌类化合物的提取和分离一提取方法: 一般选用甲醇或乙醇为溶剂，可同时将游离态和成苷的蒽醌类化合物从药材中提取出来，浓缩后再依次用有机溶剂提取（多用索氏提取法），可根据极性大小不同进行初步分离（如将苷和苷元分开）。

天然药物化学成分的常用分离纯化方法

第三章天然药物化学成分的常用分离纯化方法§1．概述一、研究分离纯化技术的重要性（一）制备工艺研究的重点原料经提取加工所得的提取物通常是一个成分复杂的混合物，只有经过进一步地分离纯化，才能得到纯度较高的化学成分。提取检识除去部分或全部杂质提取物目标成分（杂质＋化学成分）（纯度提高）（二）检测分析研究的重点天然产物工作中，无论原料或终产品，经常会是混合物；这些含有杂质成分的样品，检测分析之前，一般都需要做前处理，以便除掉干扰分析的杂质，否则，检测分析工作常常难以进行。要除掉待测样品中的杂质，同样需要分离纯化技术：待测样品供试样品检测分析分离纯化除掉干扰检测分析的杂质组分由上述可见，分离纯化同样也是检测分析的研究重点二、研究分离纯化方法的基本思路动、植物原料的提取物的化学组成经常是很复杂的，往往含有几十、几百甚至近千种成分（包括微量成分）。要从众多成分中分离纯化某种化学成分，其难度可想而知，究竟应当如何着手呢？其实我们只要抓住一个重要的基本思路，就可以使许多看似困难的分离工作，变得比较容易，这个思路就是：寻找差异、利用差异决定分离难易的关键：不在于成分多少, 而在于差异大小。只要存在显著差异，从上千种成分中分离出某种成分也未必困难；反之，如果差异微小，即便是两种成分的分离，也会相当棘手。学习和研究分离纯化技术，重在把握思路，切忌生搬硬套，死记硬背，应当重视培养“善于寻找差异和利用差异”的良好习惯。尽管天然产物中成分众多，然而只要细心研究，总能发现被分离成分之间的某些差异。在分离纯化工作中可以利用的差异是很多的，其中最常利用的有四类差异：溶解度（或分配系数）、酸碱性（或解离度）、吸附性、分子量以下，我们便对此进行研究探讨。前处理