循环肿瘤细胞CTC检测及临床应用

循环肿瘤细胞检测及临床应用

中文摘要：循环肿瘤细胞是从原发肿瘤扩散，进入到血液或淋巴系统的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞在血液中含量稀少，一般先将循环肿瘤细胞富集，然后再进行检测，现在已经开发了多种细胞富集和检测技术。本文主要对CTCs的富集和检测技术研究进展，以及CTCs在临床分析和研究上的应用进行了综述。

关键词：循环肿瘤细胞富集检测临床

Abstract: Circulating tumor cells come from the primary tumor proliferation,andproliferation, and then enter into the blood or lymphatic system. Circulating tumor cells are rare in the blood. Generally, circulating tumor cells should be enriched first, and then detected. A variety of cell enrichment and detection technologies have been developed. This paper reviews the research progress in CTCs enrichment and detection techniques, as well as analysis of CTCs in clinical and research.

Key words: Circulating tumor cells enrichmentcells detectionenrichment detection clinical

癌症转移的过程是循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)从原发肿瘤分离，通过循环系统扩散，进入血液或者淋巴系统，在远处形成新的肿瘤，最终导致大多数的癌症病人死亡[1]。1869年，Ashworth在一例癌症死亡患者的外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出了CTCs的概念[2]。从此，越来越多的研究表明，CTCs的出现与癌症密切相关。通过上皮-间质转化(EMT)，实体瘤的上皮细胞进行细胞的变化，使他们通过增加流动性和侵袭性脱离组织，进入到血液中，附着，、发展成远端转移[3]。由于CTCs能够代表原发肿瘤的表型和遗传组成，并能够作为任何转移性肿瘤的”液体活检”，CTCs的富集分离和特征研究，十分具有吸引力。CTCs的富集和计数技术已经建立，其中CTCs的计数可以成为预测指标，当其大于已知的阈值时，就预示着病人就患有转移性乳腺癌[4]，、前列腺癌[5]，、结直肠癌等[6]。

基于临床试验，美国FDA批准了一种临床检测CTCs的Cell Search技术，用于上述癌症的CTCs的富集和计数。Cell Search技术成功的证明了CTCs确实表征了疾病的活跃，CTCs 数量的增加预示着病情的恶化，可以通过CTCs了解原发性和转移性肿瘤，以CTCs为基础的分析，可以帮助人们实时诊断和预测，对病情做出决定，并取样检测耐药性。大多数常规的癌症治疗方法在治疗转移性癌症方面难以成功，CTCs的可能促进肿瘤的临床研究。

CTCs在血液中极其稀少，数十亿的外周血细胞也阻碍了对CTCs的分离和分子鉴定。现在已经开发了大量的技术用于富集和检测CTCs，其中有些已经成功的用于测试或者临床评估。本文主要综述CTCs的富集和检测技术的研究进展，以及对CTCs的在临床分析和研究上应用。

1CTCs富集技术

为了从大量血液细胞中捕获数量稀少的CTCs，富集分离技术必须足够敏感性，可重复性，可靠，、快速，、便宜，并且所需获取血液量要尽量少，方便实现过程自动化，方便下游分析。此外，富集分离的CTCs要能够保持他们的活性，在富集分离的过程受到的干扰要尽量小，因为这可能改变CTCs的状态和表型[7]。

CTCs富集的技术有很多种，这些技术使用多个性能参数评估(即捕获效率，纯度，细胞活力，富集速度，血液样本容量等)，然后通过检测临床样本进行验证。最佳的富集分离方

法可能需要之间的性能参数的折衷，而且可能依赖于下游的应用。CTCs的富集技术主要根据免疫亲和性，物理性质和直接分析分为三类。

1.1免疫亲和性(Immunoaffinity)

以免疫亲和性为基础的CTCs富集主要是利用捕获抗体(如EpCAM抗体)和CTCs靶抗原(如EpCAM)之间的高度特异性。基于EpCAM抗体的富集技术有很多种，主要区别在于捕获的方法有所不同。抗体捕获的方法主要有以下几种。

1.1.1免疫磁珠法(Magnetic beads)

免疫磁珠法富集CTCs主要是利用捕获抗体(如EpCAM抗体)和CTCs抗原(如EpCAM)之间的高度特异性反应，免疫作用促使抗原与耦合到磁珠的抗体发生特异性的结合，然后抗原-抗体复合物被置于磁场作用之下，通过磁场对磁珠固定从而使CTCs与其他血液细胞分离，产生富集效果。

Cell Search系统是免疫磁珠方法应用的典型代表。在该方法中，经过密度梯度离心富集的外周血被收集到含有防凝剂的收集管中，然后被放置到一个自动化的制备系统。该系统利用免疫磁珠富集EpCAM阳性的细胞。捕获效率主要与EpCAM的表达水平有关。有研究表明在EpCAM高表达的细胞中，有大约75%的捕获效率，而在EpCAM低表达的细胞中，大概只有42%的表达捕获效率。在检测的过程中，富集的细胞与CD45，CK的抗体孵育，然后用DAPI染色。CK和CD45分别用PE和APC荧光标记，然后，EpCAM阳性的CTCs 被anti-ck-PE抗体标记，而白细胞被anti-CD45-APC抗体标记。标记的细胞被CellTrack Analyzer 计数和分析，最终，CTCs是CK+/DAPI+/CD45-，而白细胞是CK-/DAPI+/CD45+。系统的这种半自动特征使得样本的检测非常迅速，而且具有很好的重复性[8]。

磁铁清扫装置(magnetic sweeper device)是新开发出来的技术，磁铁清扫装置提高被磁珠包被的EpCAM抗体的捕获能力。这种技术的可以达到62%的捕获效率，51%的纯度，9ml/L 的通量[9]。用这种磁珠清扫设备用RT-PCR的方法从30个转移性乳腺癌病人中的21个病人的血液中检测出了CTCs[10]。

磁性筛装置(magnetic sifter device)，通过微阵列的形式在磁场孔边缘产生极高的磁性区域，在富集过程中使用垂直流动构造，可以增强捕获效率到91.4%，提高了处理速度，最优达到10ml/h[11]。

AdnaTest(Adnagen AG，Langenhagen，Germany)是一个商业化的设备，它采用了磁珠与各种癌症(如乳腺癌，直结肠癌，前列腺癌，卵巢癌)的特异性抗体进行鸡尾酒式结合，并用多重RT-PCR的方式检测CTCs，这套实验装置已经真是可用于转移性乳腺癌，卵巢癌。比较研究发现，Adna Test breast cancer装置从55个转移性乳腺癌病人中的29个病人血液中检测出了CTCs，而Cell Search装置只从26个检测出了CTCs[12]。

Fig 1 Cell Search富集检测CTCs流程

1.1.2CTC-chip

CTC-chip是一种基于免疫亲和以及芯片的CTCs检测技术，在970mm2的表面上，排列了78000个被EpCAM抗体包被的硅微柱，用于捕获CTCs。通过抽气产生压力使血液样品以1-2ml/h的速度不间断的从芯片表面通过。这种缓慢的流速可以保证CTCs吸附在EpCAM 包被的微处理器上。而这种硅微柱提供了大量的表面积用于接触，从而使EpCAM表达高或者低的CTCs的捕获效率差别不大，捕获效率超过60%，纯度大约50%。用癌症患者和健康人体的血液样品经过CTCs-chip检测，从116个患者中的115个患者身上检测到了CTCs，而20个健康人体没有检测到CTCs，敏感性达到了99.1%，特异性为100%。同时，检测到的CTCs数目与病人的病情相关[13]。

一种类似的微柱是在”geometrically enhanced differential immunocapture”微芯片上连接前列腺特异性膜抗原(PSMA)，这种微芯片的捕获效率为85%，纯度为68%，并且从20个前列腺病人中的18个检测到了CTCs[14]。

最近，Ozkumur等开发了”CTC-iChip”，该装置可以用于以阳性EpCAM抗体的CTCs 筛选，也可以用于以大小为基础的富集步骤后对白细胞的消除。据报道，他们的捕获效率达到了98.6%，纯度为0.02-42%。CONG 42个转移性癌症病人中的37个身上检测出了CTCs，而Cell Research仅从29个病人身上检测到CTCs[15]。

Fig 2 CTC-chip 富集检测CTCs流程

1.1.3纳米结构底物(Nanostructured substrate)

Wang等利用纳米结构底物，以非常高的接触比表面积进行免疫亲和，用EpCAM抗体结合纳米柱，获得捕获效率95%，通量为1ml/h。用这个方法从26个前列腺癌中的20个病人身上检测到了CTCs[16]。该芯片又被进一步修饰为以静电聚合物纳米纤维为底物，并与激光捕获显微切割联用，分离单个前列腺癌症CTCs，然后可用于扩增或全基因组测序[17]。

Fig 3 纳米结构底物富集CTCs流程

1.1.4微纤维(Microtubes)

Hughes等用仿生的方法模拟血管选择素接到的细胞粘附过程进行CTCs捕获。选择素包被的围观外观？诱导细胞附着和卷曲，促进CTCs与抗EpV AMEpCAM抗体和PSMA抗体，在4.8ml/h，这个装置的捕获效率为50%，纯度为66%，并且从14个测试病人的血样中全部能够检测到CTCs，而Cell Search中质中只检测到9个[18]。

1.1.5 体内采样(In vivo sampling)

Saucedo-Zeni等开发了一种体内采样的方法，将医学导线与EpCAM抗体连接，医疗导线通过插管注射到患者静脉30分钟，以润徐允许大体积的血液(1.5-3L)直接连续采样。这个方法成功的在24个乳腺癌或者肺癌病人中的22个病人身上腹肌富集到了CTCs[19]。

1.1.6白细胞消除(Leukocyte depletion)

使用白细胞抗原(如CD45，CD14等)的单克隆抗体，以减少造血起源的细胞。一些策略包括抗体标记白细胞标记，通过免疫磁珠分离去除白细胞，这些方法都能够有很好的恢复率和对CTCs的最小干扰，但可能降低样品的纯度[20]。

1.1.7 小结

抗原-抗体反应的特异性是使CTCs的分离具有非常高水平的特异性。然而，CTCs的富集结果将严重依赖于所实用使用的特定抗体的性能。目前还有没已知的理想CTCs抗原靶，点可已可以将所有的CTCs捕获而对所有的造血细胞排斥。最近的报告表明，抗EpCAM的方法可能错过不表现上皮表型的CTCs，这可能由于EMT和EpCAM在一些上皮细胞CTCs 的可变表达[21]。使用鸡尾酒式的抗体组合，可能会增加捕获效率，但也可能会降低特异性和样品的纯度。白细胞消除方法的好处是在分离过程中不会干扰CTCs的表型，但也可能会使附着在白细胞或者与白细胞相互作用的CTCs丢失。白细胞消除法会导致CTCs的纯度比阳性免疫亲和方法获得的CTCs纯度降低。一般来讲，免疫亲和方法需要长时间的孵育和反应时间，来富集更多地CTCs，这也可能成为加快速度的瓶颈。对于用阳性筛选的免疫亲和方法而言，将CTCs从免疫亲和标签上分开也可能是个挑战。

1.2物理特征

物理特征也可用于有效的地将CTCs从外周血中分离出来。以下的一些技术主要是利用CTCs与其他细胞在密度，、大小，、变形性和电离特征等方面的差异进行分离的。

1.2.1 密度梯度离心(Density gradient centrifugation)

密度梯度离心是一种分离CTCs的低成本有效的方式，依据密度的不同可以把单核细胞从血液中的红细胞和粒细胞中分离出来。Weitz等使用聚蔗糖溶液的密度梯度离心来分离CTCs，用RT-PCR方法检测CK20的表达，发现在1ml血液中有1个CTCs，并且在58个结直肠癌患者中的24个患者血液中检测出了CTCs[22]。

OncoQuick是一种将密度梯度离心和按大小分离结合的一种技术。Muller等使用OncoQuick从5/60的原发性乳腺癌患者血液中，25/63的乳腺癌患者中检测到了CTCs[23]。

1.2.2 微孔过滤(Microfiltration)

微孔过滤的原理是，让小的红细胞?白细胞通过微孔，而稍大的CTCs被阻挡不能通过。V ona等开发了ISET技术，该技术使用了中间有8μm直径的圆孔的随机径迹蚀刻聚碳酸酯过滤膜，用于CTCs的富集和细胞检测。这种有微孔的滤膜比Cell Search设备更加敏感，使用微孔过滤从57/60转移性乳腺癌病人身上检测到了CTCs，而使用Cell Search只从42/60的转移性乳腺癌病人身上检测到了CTCs[24]。

zheng等改进了这种微孔滤膜，他使用对二甲苯聚合物制成了圆形或椭圆的微孔滤膜使捕获效率提高到了89%[25]。这种对聚二甲苯滤膜从51/57的癌症患者身上检测到CTCs，而用CellSearch技术只从26/57的癌症换证身上检测到CTCs。

Zheng等接着研发了3D的微孔滤膜，包含了两层的聚对二甲苯，同时在顶部和底部层具有微制造限定的孔，这两个层之间的空隙，通过光刻精确限定。这个装置的而重要特征就是，底部膜的孔位置从顶膜孔的位置偏移，如果肿瘤细胞被截留在顶部膜的孔，底部的膜可以提供直接反作用力，减少张力对CTCs细胞膜的作用，张力的减少适用于细胞进入孔的动态过程。每个滤膜片具有上面36个9μm直径的孔，底部37个8μm直径的孔。它还通过在顶部和底部膜形成的间隙允许更小的细胞通过的同时阻断大细胞，这样可以有效的充当过滤过程中的第三临界尺寸，确保对CTCs富集的高效率高纯度[26]。

Fig 4 3D Microfiltration技术富集CTCs示意图

1.2.3 微流体(microfluidics)

微流体装置是以大小和变形性为基础的富集CTCs的方法。Tan等设计了有5微米缝隙宽度的月牙形陷阱阵列，从血液中富集CTCs，捕获效率和纯度都达到了80%以上。这种微型装置成功的从转移性肺癌患者的1-3ml的血液中检测到了CTCs[27]。更高通量的微流体运用惯性流分离的水动力去选择不同大小的细胞，原理是通过制定收缩和膨胀的微水池检测CTCs。这些装置极大地提高了通量，并且能够处理较大体积的样品，但也可能降低白细胞中的CTCs的富集和回收效率[28]。Sun等开发了双螺旋微流体通道流体动力学使用拖拽力分离CTCs，能从稀释的血液中富集到88.5%的CTCs[29]。

1.2.4电场流分离(Dielectrophoresis)

CTCs的带电特性可被利用来从血液中分离，通过电泳现象施加一个非均匀电场。Becker 等利用叉指金电极分离白血病和乳腺癌细胞。由电极产生的电场由阳极吸引肿瘤细胞，而其他细胞会流过。除去电厂电场的肿瘤细胞可以被富集，捕获效率可以达到95%[30]。Gupta 等开发了ApoStream仪器，从血液中捕获CTCs的效率大于70%[31]。

Fig 5 ApoStream 富集CTCs流程示意图

1.2.5 小结

利用物理特征分离CTCs的方法简单易行，并且不受CTCs表面抗原表达的影响。因此，

他们不容易被抗原表达的变化或者由于EMT导致的表面生物标志的缺失影响，并且捕获效率常常大于80%。密度梯度离心是一个强大的技术，作为富集的第一步非常有效。白细胞消除分离是一种很有前途又较为侵入性的方法，允许更多地血液采样，提高患者的检测灵敏度。密度梯度离心法的CTCs纯度不足，需要进一步的富集纯化，否则会影响下游的继续分析。微孔过滤法能够实现高通量的富集，能够在几分钟内处理满管的血液。但是CTCs与大的白细胞之间存在大小分布重叠，是富集分离样品的纯度低于10%，此外，较小的CTCs 或CTCs片段可能会漏掉。改进的微流体方法是获得CTCs的纯度超过80%，但同时也会是通量降低到1ml/h。用水力驱动的微流体管可能能够实现高通量，但同时也会降低捕获效率或纯度。应用电泳的DEP技术是一种比较新颖的技术，获取的CTCs活力很强，也不会影响对CTCs的捕获。但DEP技术还没有在临床上进行彻底的评估，因此其临床利用价值还需要进一步的评估。

1.3直接分析

另一种分离稀少的CTCs的方法是对血液中的全部细胞实现高通量的分析。

1.3.1 光纤阵列扫描(Fiber-optic array scanning)

Krivacic等开发了一种高通量的“光纤阵列扫描技术”，能够每秒分析300000个细胞[32]。血液首先处理使红细胞裂解，然后将所有剩下的细胞铺在载玻片上。红细胞裂解主要是使用红细胞裂解缓冲液(ELB)，主要成为有NH4Cl，KHCO3和EDTA等。光纤阵列扫描技术已经被证实能够有效地计数乳腺癌，前列腺癌，胰腺癌，肺癌和卵巢癌的CTCs。

1.3.2 微霍尔效应传感器(Micro-Hall sensor)

Issadore等应用微霍尔效应传感器检测CTCs，通量可以达到大约每分钟107个细胞。CTCs可以纳米磁珠标记连接各种感兴趣的抗体(如EpCAM，HER2，EGFR，MUC1)，接着从有传感器阵列的表面流过，传感器阵列可以测量由每一个标记细胞的磁流诱导产生的霍尔电压。这种技术已经被证实比Cell Search系统的敏感性更好[33]。

1.3.3 小结

通过直接分析检测CTCs只需要对红细胞裂解，不需要对血液中的CTCs进行富集，减少了富集中的细胞损失。光纤扫描可以通过高质量图像和光学分析对CTCs进行有效检测。简单的芯片上的利用霍尔效应的电子检测并不需要光学仪器，因此具有便携性和个人护理的巨大潜力，不过该方法仅仅只能用于对CTCs进行计数。

2CTCs检测

经过富集分离的CTCs还需要进一步的检测，常用的检测方法主要分为免疫检测和分子检测两种。

2.1免疫检测

2.1.1免疫组织化学技术(Immunohistochemistry)

免疫组织化学技术是利用显色剂标记的单克隆抗体与肿瘤细胞上的抗原结合并使其显色，进而对肿瘤细胞进行定位?定量?定性分析。Sloane等1980年首次采用ICC方法检测乳腺癌患者骨髓中瘤细胞[34]。上述CellSearch系统和CTCs-chip富集CTCs后的检测即为免疫组织化学检测。其过程为富集的细胞与CD45，CK的抗体孵育，然后用DAPI染色。CK和CD45

分别用PE和APC荧光标记，然后，EpCAM阳性的CTCs被anti-ck-PE抗体标记，而白细胞被anti-CD45-APC抗体标记。最终，CTCs是CK+/DAPI+/CD45-，而白细胞是CK-/DAPI+/CD45+。尽管一些用于CTCs捕获的抗体也能用于不同的癌症类型的免疫检测，如EpCAM用于乳腺癌，肺癌，结直肠癌和其他的表皮肿瘤，癌症特异性的抗体也可能会适用，如PSMA或PSA用于前列腺癌检测。免疫组织化学方法的优点是简便，直观，肿瘤细胞未被破坏，可以进行后续形态学鉴别或核酸特征分析。

2.1.2 上皮细胞免疫斑点技术(Epithelial immunospot，EPISPOT)

EPISPOT是一种基于抗体的方法对活的CTCs进行量化检测。其基本流程是，富集的CTCs在培养基中能够分泌特异性蛋白，使用荧光标记的分泌蛋白抗体，与CTCs孵育，使抗体与蛋白特异性结合，然后将孵育的液体平铺在载玻片上，通过荧光显微镜观察，每个斑点就代表一个CTCs[35]。Alix-Panabières C等通过免疫磁珠去除CD45+细胞，再通过CXCR4+细胞富集CTCs后，用EPISPOT检测乳腺癌CTCs 释放的特异蛋白质，如cathepsin-D(半胱氨酸蛋白酶)和Mucin-1，检测到的CTCs具有转移潜能。EPISPOT以Mucin-1和CK19作标志物检测乳腺癌CTCs，表现出较高的敏感性和特异性[36]。

Fig4 EPISPOT 检测CTCs流程示意图

2.1.3流式细胞术(Flow cytometry)

流式细胞技术是在CTCs经过富集后，运用标记荧光物质的单克隆抗体与CTCs特异性的标志物结合，使CTCs染色，然后用流式细胞仪进行测量分析。流失细胞技术的优点主要是可以再免疫放大检测CTC的s同时对CTCS的形态进行定量测定，而且测量速度迅速，检测数据较精确。流式细胞技术还可以进行多参数测量，并对细胞进行分析与分选。

最近几年已经有多种改进的流式细胞仪用于CTCs测定，例如光声流式细胞仪[37]，光热流式细胞仪[38]，多色流式细胞仪[39]，光纤多光子流式细胞仪[40]，多参数流式细胞仪[41]。Watanabe等研制了一种以流式细胞仪为基础的细胞捕获平台，利用On-chip技术，组成了一种新颖的配备了一次性微流控芯片的流式细胞仪，能够对血液中的循环肿瘤细胞进行检测，捕获和分子特性分析[42]。

2.2分子检测

RT-PCR是CTCs分子检测中应用最广泛的技术。RT-PCR检测CTCs是基于组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后DNA水平的异常，这些mRNA不表达于正常外周血细胞，所以在外周血中检测到特异mRNA可以间接提示CTCs的存在。为了提高准确度，一般会同时检测几个标志物。这种技术的敏感性能够达到1-10个CTCs/ml血液，相当于从每106-107个外周血细胞有1-10CTCs即可被检测出来[42]。在目标基因被RT-PCR扩增以后，可以通过凝胶电泳和southern杂交进行半定量分析，样品也可以与健康对照衡量目的基因的表达水平，建立临界值。另外ELISA法也可以与RT-PCR联用，与凝胶电泳相比，可以提高检测的灵敏度，并且PCR 产物可以半定量光学检测[43]。

近年来，人们又发展出巢式PCR，荧光定量RT-PCR等技术，提高了检测的敏感度和特异性，而且可以对样本进行定量分析。荧光定量RT-PCR可以对mRNA的拷贝数进行定量。荧光定量RT-PCR也比RT-PCR更加敏感，可以在107-108个单核细胞中检测到1个CTCs[44]。

3CTCs的临床应用分析

现在已经开发了很多分析方法，分析CTCs的细胞和分子特征，以开发CTCs的在临床疗效上的潜在影响。这些分析方法与CTCs的富集技术相结合，因为每个下游的应用都会对CTCs有自己的要求，比如敏感性，样品纯度，细胞活力，浓缩后恢复细胞的能力。不同的分离技术可能会更适合下游的特殊应用。在医疗样品中，通常建立一种新的方法是和CellResearch结果进行比较。

3.1免疫表型分析(Immunophenotyping)

免疫组织化学染色是CTCs检测和计数的标准技术，这种标准由FDA批准的CellSearch 系统树立。这种检定CTCs的标准包括:(1)CK的阳性表达;(2)白细胞抗原CD45的阴性表达;(3)细胞核的阳性染色。癌症特异性的标记也可以用来阳性CTCs鉴定，比如在前列腺癌中使用PSA或者PSMA。CTCs的免疫表型可以直接用于临床医疗，直接影响治疗选择。通过检测CTCs的数目，可以判断患者的病情[45]。

3.2 检测基因拷贝数变化

在很多的癌症患者的癌症相关基因拷贝数发生了变化，可以通过FISH的方法来检测。Meng等利用FISH技术分析了乳腺癌患者的CTCs的致癌基因HER2的拷贝数，发现在原发肿瘤和CTCs中，HER2存在一定的非一致性[46]。用IF技术和RT-PCR技术的研究也证实了这一情况。这表明，一个HER2阴性疾病的癌症患者经过一定的过程后，CTCs可能发展成HER2阳性。CTCs分析提供了一个通过微创途径反复筛选染色体异常的途径。有趣的是，CTCs的HER2扩增的筛选已经成功的应用于原发性乳腺癌患者。

3.3 检测致癌基因转移

致癌基因的转移也是一种重要的癌症的致病机制。TMRPSS2-ERG的转移发生在30-70%的前列腺癌患者身上。运用FISH技术分析CTCs，在CTCs中检测出了TMRRSS2-ERG融合[47]。在最近的研究中，应用FISH技术，在非小细胞肺癌患者CTCs中检测到了ALK基因重排[48]。

3.4 致癌基因突变分析

富集分离CTCs的一个主要应用就是检测致癌基因的突变。致癌基因的突变，常常用来预测肿瘤的恶化，疾病的发病原因，预测药物的敏感性。使用微芯片分离的CTCs，运用位点特异性的PCR技术可以有效地检测到EGFR的突变[49]。这种EGRF T90M突变赋予的药物抗性，也在接受EGFR激酶抑制剂的患者身上检测到了。等位特异性的PCR是一种快速和低成本的方法检测特定的基因突变。对于致病基因的突变，可以从CTCs的基因组DNA 或者cDNA中扩增致病基因，并进行测序。Gasch等运用全基因组扩增和突变特异性PCR方法从结直肠癌患者的CTCs中检测到了KRAS和PIK3CA基因的突变[50]。

3.5 基因组分析

现在已经开发了单细胞基因组测序技术，可以通过对CTCs基因组的测序，与正常细胞对比，分析CTCs基因组的基因突变，基因缺失，基因拷贝数变化，基因的转移等。单一的CTCs的测序可能彻底改变我们队转移性癌症的认识，提高临床护理的潜力。

3.6 CTCs基因表达谱分析

通过对CTCs表达谱分析，可以找到CTCs中特异表达基因，可以进一步应用于CTCs 临床检测和癌症发病机理等研究。Smirnov等从一个转移性结直肠癌，一个转移性前列腺癌，

一个转移性乳腺癌患血液里，富集超过100个CTCs，通过对CTCs富集的样品RNA和CTCs 消除的样品RNA进行表达谱分析，找到了一系列癌症特异性基因，CTCs特异性基因，并通过进一步的验证，确定AGR2，FABP1等对于CTCs检测具有重要作用[51]。Powell等用生物标记数字PCR(BioMark digital PCR)对免疫富集后的单个CTCs的基因表达，表达谱表明，CTCs间存在高度的异质性，同时也发现了转移性乳腺癌和乳腺癌细胞系之间存在较小的一致性。

3.7 RNA测序

Yu等用微流体芯片分离了胰腺癌患者的CTCs，然后用RNAseq技术对单个CTCs进行了RNA测序，测序结果表明，在CTCs中，WNT通路信号激活，而这种信号可能是导致肿瘤转移的原因[52]。

4总结

癌症是世界上三大死亡率最多的疾病之一。CTCs检测的价值已经在乳腺癌?前列腺癌?结直肠癌错误！未找到引用源。中被证实，除此之外，在肺癌?胃癌?膀胱癌等肿瘤中CTCs检测的工作也在开展。Cell Search是目前唯一被FDA批准商业应用的体外CTCs检测设备。经过多年的研究发展，人们逐渐开发了多种CTCs的富集和检测技术，这为研制新的CTCs检测设备，更好的研究应用CTCs提供了巨大的技术支持。有了这些技术积累，在不远的将来，必然会有更多的CTCs检测设备会研制成功，投入商业应用，从而可以帮助人们更好的进行早期临床诊断，判断患者预后?评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗。

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人外周血循环肿瘤细胞检测试剂盒使用说明书

人外周血循环肿瘤细胞检测试剂盒使用说明书 （免疫磁捕获、免疫细胞化学鉴定） 简介： 本试剂盒利用免疫磁球捕获肿瘤病人全血中极少量的循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC），并通过免疫细胞化学鉴定所捕获的细胞，从而实现对CTC的灵敏检测。其中免疫磁球表面修饰有抗上皮细胞粘附分子（EpCAM）抗体。免疫细胞化学鉴定是通过异硫氰酸荧光素标记的细胞角蛋白抗体（FITC-anti-CK19）、Alexa Fluor594标记的抗白细胞共同抗原抗体（AF594-anti-CD45）和DAPI对细胞进行免疫荧光染色，DAPI染色阳性，CK19表达阳性，CD45表达阴性（DAPI+/CK19+/CD45-）的细胞被鉴定为CTC。本试剂盒对目标细胞的捕获效率高达90%，简便快速、特异性强、非常可靠，可以在3小时内完成对全血中CTC的检测。 试剂盒所含试剂：（10人份/盒） 试剂标号组分用途状态规格配制 试剂A牛血清白蛋白封闭固体粉末 试剂B免疫磁球磁捕获悬液200μL即用型试剂C4%多聚甲醛固定细胞液体5mL即用型试剂D1%Triton X-100通透细胞液体5mL即用型试剂E DAPI细胞染色液体50μL即用型试剂F FITC-anti-CK19细胞染色液体20μL即用型试剂G AF594-anti-CD45细胞染色液体50μL即用型试剂H1×PBS洗涤液体25mL即用型*保存条件：4-8℃ 用户自备试剂和材料： 1.试剂L：通透封闭液 于0.05g试剂A中加入0.5mL试剂D溶解待用，或按照此用量比配置所需用量的通透封闭液，标为“试剂L”。

2.试剂M：染色液 于0.01g试剂A中加入190μL试剂H溶解后，向其中加5μL的试剂E，2μL 的试剂F，5μL试剂G，或按照此用量比配置所需用量的染色液，标为“试剂M”，4℃避光保存待用。 4.磁力架（推荐Dynal公司123-20D） 5.移液器（吉尔森）、涡旋仪、超声波清洗器、进口耗材（离心管、枪头等）、恒温水浴摇床、荧光倒置显微镜等。 6.96孔板或PDMS小槽 检测步骤： 1.捕获 抽取约1.5mL病人血液于EDTA抗凝真空采血管中，将全血样品转移到2 mL的离心管内，加入20μL试剂B（试剂B预先用超声仪超声分散均匀），手摇或涡旋分散均匀后，置于恒温摇床上，150rpm，37℃下孵育30min。 2.细胞固定 将步骤1中的样品置于磁力架上，吸引约5min，用移液器延外侧轻轻吸出清液，再用400μL的试剂C重悬样品，室温放置10min。 3.细胞通透封闭 将步骤2中的样品于磁力架上，吸引约3min，用移液器去掉清液，再取400μL的试剂L重悬样品，室温放置20min。 4.细胞染色 将步骤3中的样品置于磁力架上，吸引约3min，用移液器去掉清液，再取200μL的试剂M重悬样品，37℃避光孵育30min。待孵育结束后，将样品置于磁力架上，吸引约3min，用移液器去掉清液；再用200μL的试剂H重悬，再磁吸引，去掉清液，用试剂H重复洗涤3次，最后用100μL的试剂H分散样品。 5．检测 将步骤4得到的样品转移到96孔板底部或者PDMS小槽内，磁富集到底部后用倒置荧光显微镜观察。 三通道同时观察并用CCD采集图片，其中DAPI+/CK19+/CD45-的细胞即为CTC。

关于循环肿瘤细胞(CTC)的一些认识

关于循环肿瘤细胞（CTC）的一些认识 摘要：通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cell）。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断，化疗药物的快速评估，个体化治疗包括临川筛药、耐药性的检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。检测CTC 有着良好的应用前景，随着这一研究领域的不断发展，必将产生新的诊疗手段，从而使肿瘤的治疗提高到一个崭新的阶段。 关键词：循环肿瘤细胞；CTC；检测方法；临床意义 早在1896年，Ashworth曾报道1例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）的概念[1]。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。 1、概述 CTC指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。随着肿瘤细胞的不断增殖,部分细胞可以通过分泌一种抑制黏附因子表达的物质,增加其运动能力并使之与肿瘤母体脱离。这些脱落的肿瘤细胞再分泌一种蛋白溶解酶，以破坏周边宿主结缔组织并进入脉管系统。诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环。 2、检测方法 2.1免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC） 这一检测方法基于抗原抗体结合反应的原理，利用单克隆抗体（McAb）与特异的肿瘤标记物结合，并通过酶与底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在。检测的肿瘤标志物主要分三类：①上皮细胞角蛋白（CK），如CK19；②上皮细胞膜特异性抗原，如黏蛋白类，包括EMA、HMFG、HEA125等；③肿瘤相关糖蛋白（TAG），如TAG12。1980年，Sloane等首次 采用ICC的方法检测乳腺癌患者骨髓中的肿瘤细胞。该方法可以进行形态学分析，但是检 测的细胞量少，敏感性只有10－4～10－5（即在1万~10万个单核细胞中发现一个肿瘤细胞），而且许多分化差的肿瘤不能表达目标抗原，而非上皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原亦可能阳性,故特异性不高。Braun等[2]认为由于CTC不表达白细胞共同抗原CD45，采用CD45－/CK＋双标技术可以提高ICC检测的特异性。 2.2多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 该方法的原理是特异性扩增出肿瘤细胞中因癌基因、抑癌基因突变或染色体重排而产生 的DNA异常。这类基因的改变应满足以下条件：①该基因的突变在待检肿瘤中发生率较高，至少应达50％左右；②基因内发生碱基突变的部位应相对集中，如果过分分散，目前临床 应用有困难。这一方法检测肿瘤细胞的敏感性约1×10－6左右，比Southern印迹杂交法约提高10 000倍。应用PCR技术检测CTC受到缺乏肿瘤特异性和高表达标记的限制，该方法敏感度高，易出现假阳性，同时由于癌细胞的异质性亦可出现假阴性。目前多应用突变等位基因扩增（mutant allelie specific amplification, MASA）的PCR技术，检测大肠癌和胰 腺癌患者外周血中具有K-ras癌基因突变的肿瘤细胞。 2.3逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

循环肿瘤细胞CTC检测及临床应用

循环肿瘤细胞C T C检测及 临床应用 Prepared on 22 November 2020

循环肿瘤细胞检测及临床应用 中文摘要：循环肿瘤细胞是从原发肿瘤扩散，进入到血液或淋巴系统的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞在血液中含量稀少，一般先将循环肿瘤细胞富集，然后再进行检测，现在已经开发了多种细胞富集和检测技术。本文主要对CTCs的富集和检测技术研究进展，以及CTCs在临床分析和研究上的应用进行了综述。 关键词：循环肿瘤细胞富集检测临床 Abstract:Circulatingtumorcellscomefromtheprimarytumorproliferation,andprolife ration,癌症转移的过程是循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)从原发肿瘤分离，通过循环系统扩散，进入血液或者淋巴系统，在远处形成新的肿瘤，最终导致大多数的癌症病人死亡。1869年，Ashworth在一例癌症死亡患者的外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出了CTCs的概念。从此，越来越多的研究表明，CTCs的出现与癌症密切相关。通过上皮-间质转化(EMT)，实体瘤的上皮细胞进行细胞的变化，使他们通过增加流动性和侵袭性脱离组织，进入到血液中，附着，、发展成远端转移。由于CTCs能够代表原发肿瘤的表型和遗传组成，并能够作为任何转移性肿瘤的”液体活检”，CTCs的富集分离和特征研究，十分具有吸引力。CTCs的富集和计数技术已经建立，其中CTCs的计数可以成为预测指标，当其大于已知的阈值时，就预示着病人就患有转移性乳腺癌，、前列腺癌，、结直肠癌等。 基于临床试验，美国FDA批准了一种临床检测CTCs的CellSearch技术，用于上述癌症的CTCs的富集和计数。CellSearch技术成功的证明了CTCs确实表征了疾病的活跃，CTCs数量的增加预示着病情的恶化，可以通过CTCs了解原发性和转移性肿瘤，以CTCs为基础的分析，可以帮助人们实时诊断和预测，对病情做出决定，并取样检测耐药性。大多数常规的癌症治疗方法在治疗转移性癌症方面难以成功，CTCs的可能促进肿瘤的临床研究。 CTCs在血液中极其稀少，数十亿的外周血细胞也阻碍了对CTCs的分离和分子鉴定。现在已经开发了大量的技术用于富集和检测CTCs，其中有些已经成功的用于测试或者临床评估。本文主要综述CTCs的富集和检测技术的研究进展，以及对CTCs的在临床分析和研究上应用。 1CTCs富集技术 为了从大量血液细胞中捕获数量稀少的CTCs，富集分离技术必须足够敏感性，可重复性，可靠，、快速，、便宜，并且所需获取血液量要尽量少，方便实现过程自动化，方便下游分析。此外，富集分离的CTCs要能够保持他们的活性，在富集分离的过程受到的干扰要尽量小，因为这可能改变CTCs的状态和表型。 CTCs富集的技术有很多种，这些技术使用多个性能参数评估(即捕获效率，纯度，细胞活力，富集速度，血液样本容量等)，然后通过检测临床样本进行验证。最佳的富集分离方法可能需要之间的性能参数的折衷，而且可能依赖于下游的应用。CTCs的富集技术主要根据免疫亲和性，物理性质和直接分析分为三类。 1.1免疫亲和性(Immunoaffinity)

循环肿瘤细胞(CTC)检测

循环肿瘤细胞（CTC）检测 一、什么是循环肿瘤细胞（CTC）？ 循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，进入外周血循环的肿瘤细胞。 CTC非常稀少，每毫升血液中109血细胞只有几个CTC。大部分CTC在进入外周血后会发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者的死亡风险。 二、肿瘤的发生及检测诊断 全国肿瘤登记中心发布的2015年年报显示，2011年我国新增癌症病例约337万例，比2010年增加28万例——这相当于每分钟有6人被诊断为癌症。然而，令人担忧的是这样的情势似乎仍未到达峰顶，未来可能还会不断增加。 美国约翰-霍普金斯大学Kinmel 癌症中心的Bert-Vogelstein 等专家在2013年3月份的一篇综述文章中写道：在今年将死于癌症的一百万人里，绝大部分是因为他们的癌症没有在发生、发展的前90%的时间内被发现。因此，我们需要明确一点：癌症是一种慢性病，它只是被突然发现，并非是突然发生的。我们需要尽可能早的发现它，从而提高治愈率。 伴随肿瘤的发生过程，肿瘤细胞的大小也随之增大。传统方法诊断出癌症的时候，大部分已经是晚期。晚期癌症的治愈率极低，其五年生存率也很低。在肿瘤的发生过程中，早期到中期之间是最佳治疗期，因此，如果在早期就可以发现肿瘤的存在，必然可以提高治愈率。临床癌症研究（Clinical Cancer Research）杂志上发表的荟萃分析（Meta-analysis）证实CTC

在乳腺癌预测中的价值，结果表明早期和转移性乳腺癌患者的循环肿瘤细胞CTC检测是一个稳定的预测和预后工具。 如果将肿瘤易感性基因检测和循环肿瘤细胞检测完美结合，那么能够将肿瘤的早期发现率提高数倍。肿瘤易感性检测是对未来可能患有癌症的一种风险预测。如果风险等级高，除了改变生活方式外，还可以定期做循环肿瘤细胞检测，即CTC检测，而且检查频率可以适当增加，每2-3个月检查一次，从而达到实时监控的目的。 三、CTC 检测临床意义有哪些？ CTC 检查的临床意义主要表现在体外早期诊断，血液中肿瘤在1mm时，即可检出CTC，抓住最佳治疗期；另外还可以进行预后判断，根据治疗前后CTC个数判断预后与存活时间，制定最佳治疗方案；此外，还有肿瘤复发检测、耐药性检测、化疗药物的疗效评价以及新药的研发等。 四、哪些人需要做CTC检测？ 1. 普通健康人：通过检查血液中是否存在循环肿瘤细胞来早期检测肿瘤的发生，建议每年检测一次，以期在肿瘤萌芽阶段就能检测到，从而保证早期治愈率。 2. 肿瘤易感人群：有癌症家族史人群，患有HPV阳性、慢性肝炎、慢性胃炎、慢性肠炎等人群，长期吸烟者，经常接触有毒有害物质者，生活压力大、精神高度紧张的亚健康人群，以及基因检测肿瘤易感性风险等级高者，建议每3个月或者半年检测一次。 3. 癌症患者：已经确诊的癌症患者，通过CTC计数，用于预后判断、疗效评价、复发检测等；通过CTC单细胞基因组分析，选择精准治疗方案，实现真正的液体活检。

循环肿瘤细胞销售流程

C an c e r r e s e ar ch Cir c u la t in g T um o r C e l ls D e cisi o n T r ee 内部使用 肿瘤研究 循环肿瘤细胞 起始样品– 外周血/骨髓 您富集 CTC s ? 您直接分选 CTCs? M i cro be a d s Human : CD326 (E p C A M ) M i c r o B e a d s Anti-ErbB-2 M i c r obe ads Anti-Melanoma (MCSP) M i c r obead s I nd irec t M i cro B e a d s 您去除非 CTC s ? C D 45M i cro B e a d s 您做CTC 的分析吗? 您想做先富集再分析吗? H um an CD326 (E p C A M ) tumor c e ll E n r i c h m en t a nd Detection kit ErbB-2 tumor cell E n r i c h m en t a nd Detection kit A n t i -M e l a no ma (MCSP) cell E n r i c h m en t a nd Detection kit MACSQuant 您用流式细胞仪吗? E p C A M a n t i bod i e s , a n t i - E r b B -2 a n t i bod i e s , anti-Melanoma (MCSP) an t i bo di e s , CD45 an t i bo di e s , Available c on j ug a t ed to up to 8 f l uo r o c h r o m e s MACSQuant 您做免疫组化吗 (I H C )? Carcinoma Cell Detection K i t , I n s i de Stain K i t , A n ti -C y t o k e r a ti n Alkaline P h os ph a t a s e ; Anti-Cytokeratin (C K 3-3E 4), A n ti -C y t o k e r a ti n (CK3-6H5), C D 45, 您做分子分析吗? 您做基因表达谱分析吗? mRNA isolation k i t , cDNA isolation k i t , MultiMACS M96 T he rmo M i c r o a rr ay : labeling k i t s , s e rv i c e s , b i o i n f o r ma t i cs , superAMP

循环肿瘤细胞检测系统(CTC)仪器购买可行性报告

循环肿瘤细胞检测系统（CTC）设备购置 可行性报告 一、制造商基本情况 美国强生(Johnson & Johnson)成立于1886年，是世界上规模最大，产品多元化的医疗卫生保健品及消费者护理产品公司。1999年全球营业额高达275亿美元。强生在全球60个国家建立了250多家分公司，拥有约11万5千余名员工, 产品销售于175个国家和地区。 强生公司是世界上最具综合性、分布范围最广的卫生保健产品制造商、健康服务提供商，产品畅销于175个国家地区，生产及销售产品涉及护理产品、医药产品和医疗器材及诊断产品市场等多个领域。 美国强生公司研发的循环肿瘤细胞检测系统（CTC）2012年进入中国市场，立即被运用于肿瘤科研和临床检测，并受到业界好评。二、项目意义 随着循环肿瘤细胞检测技术的不断发展，循环肿瘤细胞（CTC）在肿瘤临床实践以及肿瘤基础科学研究领域得到了越来越多的重视。CTC数目已经被证实与晚期转移性乳腺癌，结直肠癌，前列腺癌等各种患者的无进展生存期和总生存期密切相关，CTC已经成为转移性乳腺癌等癌种的一种全新的，独立的预后因子，并被作为一种新的肿瘤生物标志物而广泛应用于新药开发，癌症机制研究等不同的领域。三、国内外研究 CTC是指存在于外周血循环中的肿瘤细胞，其含量非常稀少（1ml血液中可能只能检出1个CTC）。CellSearch系统是目前为止唯一获得FDA批准的可以应用于病人管理的自动化循环肿瘤细胞检测系统。检测技术的不断进步CTC越来越成为国内外癌症领域研究的热点。2004年，Cristofanilli等完成的前瞻性多中心临床研究表明治疗前

(基线期)和首次随访时的CTC水平对于转移性乳腺癌患者的无进展生存期和总生存期都是独立的预测指标。在177例转移性乳腺癌患者中，CTC水平较高者(≥5个/7.5ml全血)的平均无进展生存期只有2.7个月，总生存期只有10.1个月；CTC水平较低者则分别为7.0个月(P<0.001)和超过18个月(P<0.001)。随后又有多个研究证明治疗期间任何时间点CTC水平的升高都提示着疾病的快速进展和较差的预后。同时也出现了越来越多的不同癌种的关于CTC的研究，其结果也提示了CTC在前列腺癌，结直肠癌中也发挥了相同的预后作用。由于FDA 的批准，在美国CTC已经可以与传统肿瘤诊断检测方法相结合用于临床实践。国外也有较多的研究集中在了CTC的生物特性上，例如研究CTC表面的Her2抗体表达情况，进行CTC与原发肿瘤的抗体表达对照研究等。 此前，国内也有一些实验室开展了关于CTC的研究，但局限于手工磁珠法，PCR法等方法学问题，并没有取得国际认可的结果。不过随着CellSearch方法逐渐进入中国，越来越多的学者已经开始了关于CTC的研究。国内正在进行CellSearch的注册临床研究，将会验证CellSearch系统在中国人群中的有效性及安全性。同时一些国内的实验室也已经开始在CellSearch这一平台上进行不同的基础科学研究，包括CTC表面多重生物标志物分析，CTC分子生物学分析，CTC细胞FISH检测等，希望通过CTC这个全新的肿瘤标志物得到更多关于癌症发病机制，癌症转移机制等问题的答案。 四、国内开展现状 基于CellSearch平台的CTC检测技术是一种安全可靠的被美国FDA批准的癌症临床辅助诊断技术，随着中国注册临床试验的进行，CTC检测将会在中国得到越来越多的重视并迎来更加广阔的临床及科研应用前景。目前国内已有解放军307医院，复旦大学附属肿瘤医院，

cellsearch循环肿瘤细胞ctc)试剂盒说明书自译中文版

7900001 16人份试剂盒 Cell Search 循环肿瘤细胞检测试剂盒 （上皮细胞） IVD 使用须知 本试剂盒仅用于体外诊断 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞（CTC）的计数，这些细胞来源于上皮细胞，即表现为CD45阴性（CD45-），EpCAM阳性（EpCAM+），细胞角蛋白8,18阳性（CK8,18+）和（或者）CK19阳性(CK19+)的细胞。 用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的CTC，存在于外周血中，这类细胞与乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌*转移患者的无进展生存期和总生存期相关。因此，CTC可以用来监控乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。CTC应该进行持续检测，并与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。在肿瘤发生过程中的任何时间段，对CTC数量进行评估，可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。 *在该研究中，转移性前列腺癌患者定义为血清标志物PSA在标准激素基准上，高于参考水平具有两次连续增加。这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性，激素抗性，或去势抗性的前列腺癌。 摘要说明 肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后，这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的远端定植生长的情况。血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞，而这

类细胞在血液循环系统中是极罕见的。基于此，本公司推出的细胞自动化捕获仪(CELLTRACKS○R AUTOPREP○R System)通过预设程序并配合使用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒(CELLSEARCH○R Kit)可以对样本进行标准化和自动化检测。用CELLTRACKS II分析仪或者CellSpotter分析仪，一种半自动荧光显微镜，可以对肿瘤细胞进行分析和计数。这种方法只计具有上皮细胞特性（EpCAM+, CK8,18+，和/或者CK19+）的细胞数量。 检测原理 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。磁流体试剂是一种具有磁芯的颗粒。其表面包被识别EpCAM抗原的抗体，EpCAM是CTC特异性抗原。因此，该磁微粒可以捕获CTC。经过免疫捕获和富集后，荧光试剂用来鉴定CTC和CTC计数。荧光试剂包括以下组成：抗CK-藻红蛋白（PE）的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋白抗体（上皮细胞特性）；DAPI，用于细胞核染色；和抗CD45-别藻蓝蛋白（APC）白细胞特异性抗体。 试剂/样品混合物被CELLTRACKS○R AUTOPREP○R系统分配到一个插入在MAGNEST?细胞呈现装置的暗盒中。所述MAGNEST?装置具有强磁场，能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗盒的表面上。CELLTRACKS ANALYZERII?分析仪，或者CellSpotter?分析仪自动扫描暗盒的整个表面，获取图像并向用户显示所有事件，其中CK-PE和DAPI荧光染料进行共定位。图像进行最终分类，并以画廊格式呈现给用户。所检测分析的事件当其形态学特征与肿瘤细胞一致并表现出EpCAM+，CK+，DAPI+和CD45-表型时，才被分类为肿瘤细胞。 试剂盒提供的材料 试剂说明 1. 3ml 包被抗EpCAM抗体的磁流体：含有浓度为0.022%的磁微粒，这些磁微

cellsearch循环肿瘤细胞CTC试剂盒说明书自译中文版

c e l l s e a r c h循环肿瘤细胞C T C试剂盒说明书自 译中文版 This manuscript was revised by the office on December 22, 2012

7900001 16人份试剂盒 Cell Search 循环肿瘤细胞检测试剂盒 （上皮细胞） IVD 使用须知 本试剂盒仅用于体外诊断 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞（CTC）的计数，这些细胞来源于上皮细胞，即表现为CD45阴性（CD45-），EpCAM阳性（EpCAM+），细胞角蛋白8,18阳性（CK8,18+）和（或者）CK19阳性(CK19+)的细胞。 用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的CTC，存在于外周血中，这类细胞与乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌*转移患者的无进展生存期和总生存期相关。因此，CTC可以用来监控乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。CTC应该进行持续检测，并与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。在肿瘤发生过程中的任何时间段，对CTC数量进行评估，可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。 *在该研究中，转移性前列腺癌患者定义为血清标志物PSA在标准激素基准上，高于参考水平具有两次连续增加。这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性，激素抗性，或去势抗性的前列腺癌。 摘要说明 肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后，这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的远端定植生长的情况。血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞，而这类细胞在血液循环系统中是极罕见的。基于此，本公司推出的细胞自动化捕获仪(CELLTRACKS○R AUTOPREP○R System)通过预设程序并配合使用CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒(CELLSEARCH○R Kit)可以对样本进行标准化和自动化检测。用CELLTRACKS II分析仪或者CellSpotter分析仪，一种半自动荧光显微镜，可以对肿瘤细胞进行分析和计数。这种方法只计具有上皮细胞特性（EpCAM+, CK8,18+，和/或者CK19+）的细胞数量。 检测原理 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。磁流体试剂是一种具有磁芯的颗粒。其表面包被识别EpCAM抗原的抗体，EpCAM 是CTC特异性抗原。因此，该磁微粒可以捕获CTC。经过免疫捕获和富集后，荧光试剂用来鉴定CTC和CTC计数。荧光试剂包括以下组成：抗CK-藻红蛋白（PE）的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋白抗体（上皮细胞特性）；DAPI，用于细胞核染色；和抗CD45-别藻蓝蛋白（APC）白细胞特异性抗体。 试剂/样品混合物被CELLTRACKS○R AUTOPREP○R系统分配到一个插入在MAGNEST细胞呈现装置的暗盒中。所述MAGNEST装置具有强磁场，能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗盒的表面上。CELLTRACKS ANALYZERII分析仪，或者CellSpotter 分析仪自动扫描暗盒的整个表面，获取图像并向用户显示所有事件，其中CK-

循环肿瘤细胞检测及临床应用的研究进展

?４５０?肿瘤２００８年５月第２８卷第５期ＴｕｍｏｒＶ０１．２８，Ｎｏ．５，Ｍａｙ，２００８ ＤＯＩ：１０．３７８１／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－７４３１．２００８．０５．０２１ 循环肿瘤细胞检测及临床应用的研究进展 Ｒｅｖｉｅｗ?综述 黄同海１，王正‘，李富荣２ （暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院１．胸外科；２．临床医学研究中心，深圳５１８０２０） ［摘要］研究发现，实体瘤患者外周血中存在循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞的检测有助于发现早期肿瘤患者的微转移，重新确定临床分期，监测患者术后肿瘤是否复发与转移，评估预后，选择个体化的治疗策略。由于存在循环肿瘤细胞检测方法、原发肿瘤细胞的不连续脱落、基因组的不稳定性及无效转移等诸多问题，循环肿瘤细胞检测的生物学意义和临床意义仍存在很大争议。本文综述了对实体瘤患者循环肿瘤细胞检测的方法和结果，并探讨当前肿瘤研究领域面临的问题和潜在的进展。【关键词］肿瘤循环细胞；肿瘤转移；诊断技术和方法 ［中图分类号］Ｒ７３－３７；Ｒ７３０．４３［文献标志码］Ａ［文章编号］１０００－７４３１（２００８）０５－０４５０－０３ 肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程。肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是实现肿瘤转移的最初阶段，并为最终形成肿瘤转移灶提供了可能。深入研究循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＣＴＣｓ）有助于对肿瘤转移机制的了解，为抗转移治疗提供依据。随着检测技术的小断改进，研究者们对ＣＴＣｓ的生物学特性的认识得到不断更新和完善。这可能为肿瘤患者的预后评估、抗肿瘤药物的开发和肿瘤的个体化治疗提供强有力的工具。 ＣＴＣｓ是指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。由于宿主的免疫识别和机械杀伤作用以及肿瘤细胞自身因素，进入循环的肿瘤细胞很大一部分发生凋亡，不能形成转移灶，这种现象称之为“无效转移”¨ｏ。只有极少数具有高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下来，相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶。因此，在外周血中检测到肿瘤细胞预示着有可能发生肿瘤转移。 １ＣＴＣｓ的检测方法 １．１细胞计数法细胞计数法是最早应用于检测外周血ＣＴＣｓ的方法并且是当前鉴定骨髓中微转移的标准方法。细胞计数法的优点是，可在形态学上鉴别恶性表型并在单个细胞水平上进一步检测特定分子，但标准的光学显微镜和免疫细胞化学法存在敏感性低、检测繁琐、费时、易误诊等缺点。随着细胞自动成像和细胞富集方法等的产生，重新激起了研究者对应用细胞汁数法检测ＣＴＣｓ的兴趣。…。数字显微镜能自动扫描以核特征和细胞表面特征为摹础的血标本，而操作者只需确定分选的细胞即可。新近应用的上皮肿瘤细胞容量分离法（ｉｓｏｌａｔｉｏｎｂｙｓｉｚｅｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＩＳＥＴ），不仅能计数肿瘤细胞，而且能进行免疫形态学和分子特征的分析¨Ｊ。ＦＣＭ广泛应用于血液领域，不仅能鉴定特定标本中细胞抗原性和形态学特征，还能使富集的目的细胞维持细胞形态并保持细胞活力，进一步扩大在体外的功能研究。 ［基金项目］国家科技攻关计划项目（编号：２００３ＢＡ３１０Ａ２３） ［作者简介】黄同海（１９８２一），男（汉族），硕士，住院医师 Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｔｏ：ＷＡＮＧＺｈｅｎｇ（王正） Ｅ—ｍａｉｌ：Ｗａｎｇｚｎ０５０３＠１６３．ｔｏｍ１．２ＰＣＲ方法ＰＣＲ方法是检测ＣＴＣｓ最普遍的一种方法。该方法通过设汁获得与目的基因特异性互补的寡核苷酸引物而具有较高的特异性。应用ＰＣＲ方法可在１０６一ｌＯ７个正常细胞中检测出１个肿瘤细胞，相当于１～１０ｍＬ血中可发现１个肿瘤细胞，与光学显微镜检测（１０２一１０３个正常细胞中发现１个肿瘤细胞）和免疫组织化学方法（１０４—１０５个正常细胞中发现１个肿瘤细胞）相比具有更高的敏感性“。然而，由于该方法的高度敏感性，极易产生假阳性的结果。这是冈为外周血白细胞的非法转录、静脉穿刺时血标本的污染及假基因的干扰等造成，但随着实时定量ＰＣＲ技术的出现，使精确定量靶序列成为可能。 以ＤＮＡ作为ＰＣＲ的模板，其优势是它的稳定性和肿瘤细胞异常转录的独立性。但是它的缺点是敏感性低，并且不能鉴别目的基因ＤＮＡ来源于活细胞还是死细胞。 以ｍＲＮＡ作为模板进行ＲＴ—ＰＣＲ也是ＣＴＣｓ检测最常用的一种方法。首先将ｍＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，随后用特异性的引物扩增获得日的基因。引物设计时可以跨越２个不同的外显子，为避免整个基因组的扩增，有利于消除假阳性结果。ＲＴ—ＰＣＲ的优点是可以检测原代活细胞，缺点是在某个特定肿瘤细胞内一个基因ｍＲＮＡ的拷贝数量在细胞周期中是不断变化的，并且存在去分化的现象，这可能影响标准ＰＣＲ的阳性率和实时定量ＰＣＲ检测的标志物水平，从而较难区别肿瘤细胞数量与ｍＲＮＡ表达水平之Ｉ’日Ｊ的变化。然而用多位点ＰＣＲ分别检测来自不同基因家族的ｍＲＮＡ标志物即可解决这个问题一－。 １．３细胞富集方法密度梯度离心法足目前实验室常用的一种收集肿瘤细胞的方法，但该方法缺乏特异性，因而易导致缺乏相应密度的肿瘤细胞丢失。新近发展起来的免疫磁性细胞富集法则具有较高的特异性和富集效率。其基本原理即采用均匀、球形具有超顺磁性及保护壳的纳米微粒制备成免疫磁珠，使之成为既能被磁铁所吸引，又能结合抗体的载体。磁珠上的抗体与含有特异性抗原物质的细胞结合后，则形成细胞抗原．抗体一磁珠免疫复合物，在磁力作用下发生力学移动，使复合物与其他物质分离，达到分离特异性细胞的目的。目前商业化的磁珠包括阳性分选磁珠和阴性分选 万方数据

循环肿瘤细胞的检测

Detection of Androgen Receptor Mutations in Circulating Tumor Cells: Highlights of the Long Road to Clinical Qualification Hans Lilja 1,2,3*and Howard I.Scher 3 There is evidence that androgen receptor (AR )4gene function not only is necessary for the growth and dif-ferentiation of the healthy prostate gland but also may contribute critically to treatment failure in progressive stages of castration-resistant prostate cancer (CRPC)5(1–3).The mechanisms include AR overexpression,AR gene amplification,an increase in the levels of the androgen synthetic machinery leading to increased in-tratumoral androgens,ligand-independent activation,and gain-of-function mutations in the gene itself (2).The clinical importance of these findings has been val-idated in trials of the novel androgen receptor antago-nist MDV3100,which was developed in a cell-based screen for activity in cells with overexpressed AR,and of abiraterone acetate,a 17,20lyase inhibitor that blocks androgen synthesis in the testis,the adrenals,and the tumor (3,4). The development and validation of reliable,repro-ducible protocols to accurately assess functional status,frequency,and functional relevance of mutations in AR could then be critical for the successful development and clinical implementation of novel targeted strate-gies for patients with advanced stages of prostate can-cer,particularly those with progressive CRPC.Al-though a recent study on the integrative genomic profiling of human prostate cancer was limited by the interrogation of only a modest number of genes and patient samples,the reported data strongly suggested that the overall rate of mutations may be low in pros-tate cancer (5).In particular,mutations were infre-quent among common,broadly mutated oncogenes,such as PIK3CA (phosphoinositide-3-kinase,catalytic, alpha polypeptide),KRAS (v-Ki-ras2Kirsten rat sar-coma viral oncogene homolog),and BRAF (v-raf mu-rine sarcoma viral oncogene homolog B1).Impor-tantly,however,the study reported a higher frequency of AR mutations.Alterations in AR ,including muta-tions,gene amplification,and overexpression,were common in the metastatic tumor samples analyzed but were notably absent in tumor samples representing un-treated localized disease (5).Assessing the frequency of specific molecular changes in CRPC,however,is lim-ited by the general unavailability of metastatic tumor samples for profiling,as well as by a lack of analytically valid assays for measurement. Circulating tumor cells (CTCs)isolated from blood have been hypothesized to be capable of fulfilling the unmet need for tumor tissue for molecular profil-ing for biomarkers that predict sensitivity to treat-ment.Biomarker qualification requires analytically valid assays that can then be studied in prospective clinical trials designed for a specific context of use.A variety of CTC assays are available and under study,but at present only 1,CellSearch ?(Veridex/Johnson &Johnson),has undergone full analytical validation for enumeration (6)and been shown in prospective trials to provide prognostic information at baseline and after treatment in patients with breast,colorectal,or pros-tate cancer (7–9).The US Food and Drug Administra-tion (FDA)clearance is as an “aid to monitoring”dis-ease in conjunction with other measures.The assay is not cleared for the assessment of predictive markers. A limitation of CellSearch is that CTCs are not detected in patients with clinically localized disease or in patients who are in the clinical state of increasing prostate-specific antigen (10,11).To address this is-sue,we measured the mRNA copy number in 2AR -regulated prostate-specific genes [KLK3(kallikrein-related peptidase 3)and KLK2(kallikrein-related peptidase 2)](11)in blood prepared with the PAXgene Blood RNA System (PreAnalytiX).A direct compari-son of the 2assays revealed highly concordant results that were significantly associated with the presence of skeletal metastases and with overall https://www.wendangku.net/doc/e83562008.html,bin-ing these measures,however,did not seem to contrib-ute importantly to enhancing the predictive accuracy 1 Departments of Clinical Laboratories,2Surgery (Urology),and 3Medicine (Genito-Urinary Oncology),Memorial Sloan-Kettering Cancer Center,New York,NY. *Address correspondence to this author at:Memorial Sloan-Kettering Cancer Center,1275York Ave.,Box 213,New York,NY 10021.Fax 646-422-2379;e-mail liljah@https://www.wendangku.net/doc/e83562008.html,. Received July 1,2010;accepted July 6,2010. Previously published online at DOI:10.1373/clinchem.2010.1508964 Human genes:AR ,androgen receptor;PIK3CA ,phosphoinositide-3-kinase,cat-alytic,alpha polypeptide;KRAS ,v-Ki-ras2Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog;BRAF ,v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1;KLK3,kallikrein-related peptidase 3;KLK2,kallikrein-related peptidase 2.5 Nonstandard abbreviations:CRPC,castration-resistant prostate cancer;CTC,circulating tumor cell;FDA,US Food and Drug Administration. Clinical Chemistry 56:91375–1377(2010) Editorials 1375