细胞色素氧化酶染色液(联苯胺法)

细胞色素氧化酶染色液(联苯胺法)使用说明

细胞色素氧化酶染色液(联苯胺法)使用说明 货号：G2410 有效期：6个月。 产品组成： 产品名称规格保存 试剂(A):CO清除液2×50ml4℃避光 试剂(B):DAB 孵育液B1:DAB染色液45ml-20℃避光B2:DAB增强剂5ml RT B3:DAB反应液100μl RT 按B1:B2:B3=9000:1000:3混合，即为DAB孵育液，即配即用。 试剂(C):苏木素染色液50ml4℃避光 试剂(D):CO对照液1ml RT 产品说明： 细胞色素氧化酶(Cytochrome Oxidase，CO)被认为是线粒体膜固有的酶，在含有大量线粒体的细胞(如心肌、肾小管上皮以及胃壁细胞、肝细胞)内都具有高度活性。此酶活性往往作为细胞内氧化代谢的指标，亦作为线粒体的标志酶之一。 细胞色素氧化酶染色液(联苯胺法)染色原理是细胞色素氧化酶催化3,3-二氨基联苯胺(DAB)使其侧链的氨基氧化，进行反复的氧化性聚合和氧化性环化形成不溶性的棕色Phenazine 聚合物。此酶对固定剂敏感，故须用新鲜切片。 自备材料： 1、恒温培养箱

2、光学显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、冰冻切片，厚6μm，不固定。 2、滴加CO清除液于切片上，铺满整个样品表面。 3、切片入DAB孵育液中，37℃避光孵育45～60min。 4、移去切片上的染色液，滴加CO清除液于切片上，铺满整个样品表面。 5、蒸馏水稍洗3～5s。 6、(可选)滴加苏木素染色液浅染细胞核3～5min。 7、流水冲洗10min。常规脱蜡透明，中性树胶封固。 染色结果： CO酶活性部位棕色 心肌、肾小管上皮内颗粒(线粒体)蓝色 阴性对照(可选)：取新鲜配制好的DAB孵育液，按DAB孵育液:CO对照液=50:1的比例混合，即为CO对照工作液。相同切片入CO对照工作液，室温孵育30～60min，其余同上，呈阴性反应。 注意事项： 1、本染色液适用于冰冻切片，同时应减少切片在室温暴露的时间。 2、CO孵育液孵育时间因组织而异，心肌、肾孵育约20～30min，肝脏约50～60min，甲状腺滤泡上皮约2h。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

48T 组织 小鼠细胞色素C氧化酶(COX)酶联免疫检测试剂盒使用说明书

小鼠细胞色素C氧化酶 (COX) 酶联免疫检测试剂盒 使用说明书 种属小鼠 适用样本组织 保存条件 2-8℃ 仅用于科研，不得用于医学诊断

使用前仔细阅读本说明书。本酶联免疫试剂盒是基于生物素双抗体夹心技术原理，来检测小鼠细胞色素C氧化酶(COX)，只能用于研究用途，不得用于医学诊断。 一、用途：用于小鼠组织及相关液体样本中细胞色素C氧化酶(COX)的测定。 二、工作原理 本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定样品中细胞色素C氧化酶(COX)的水平。向预先包被了小鼠细胞色素C氧化酶(COX)单克隆抗体的酶标孔中加入细胞色素C氧化酶(COX)，温育；温育后加入生物素标记的抗COX抗体，再与链霉亲和素-HRP 结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色深浅与样品中细胞色素C氧化酶(COX)的浓度呈正相关。 三、试剂盒组成 编号产品名称48T 96T 1 标准品（80ng/ml）0.5ml 0.5ml 2 标准品稀释液3ml3ml 3 酶标包被板12孔×4条12孔×8条 4 链霉亲和素-HRP3ml6ml 5 浓缩洗涤液20×20ml30×20ml 6 生物素标记的抗-COX抗体1ml1ml 7 显色剂A液3ml6ml 8 显色剂B液3ml6ml 9 终止液3ml6ml 10 说明书1份1份 11 封板膜2张(48T)2张(96T) 12 密封袋1个1个

四、需要而未提供的试剂和器材 1、37℃恒温箱 2、标准规格酶标仪 3、精密移液器及一次性吸头 4、蒸馏水 5、一次性试管 6、吸水纸 五、注意事项 1、从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保存。 2、各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。 3、严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。 4、为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。 5、不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质期之前使用。 6、底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。 六、洗板方法 手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次； 将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过 程数次。 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 七、标本要求 1、不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 2、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行 试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 八、操作程序 1、标准品的稀释：（本试剂盒提供原倍标准品一支，用户请按照说明自行在小试管中倍比稀 释）： 40ng/ml （5号标准品） 120μl的原倍标准品加入120μl的标准品稀释液 20ng/ml （4号标准品） 120μl的5号标准品加入120μl的标准品稀释液 10ng/ml （3号标准品） 120μl的4号标准品加入120μl的标准品稀释液 5ng/ml （2号标准品） 120μl的3号标准品加入120μl的标准品稀释液

细胞色素氧化酶染色液(DAB法)使用说明书

细胞色素氧化酶染色液(DAB法)使用说明书 货号：G2410 规格：4×50ml 有效期：-20℃，6个月。 产品组成： 产品名称规格保存 试剂(A):CO清除液2×50ml4℃避光 试剂(B):DAB 孵育液B1:DAB染色液45ml-20℃避光B2:DAB增强剂5ml-20℃避光B3:DAB反应液100μl-20℃避光 按B1:B2:B3=9000:1000:3混合，即为DAB孵育液，即配即用。 试剂(C):苏木素染色液50ml4℃避光 试剂(D):CO对照液1ml RT 产品说明： 细胞色素氧化酶(Cytochrome Oxidase，CO)被认为是线粒体膜固有的酶，在含有大量线粒体的细胞(如心肌、肾小管上皮以及胃壁细胞、肝细胞)内都具有高度活性。此酶活性往往作为细胞内氧化代谢的指标，亦作为线粒体的标志酶之一。 细胞色素氧化酶染色液(DAB法)染色原理是细胞色素氧化酶催化DAB使其侧链的氨基氧化，进行反复的氧化性聚合和氧化性环化形成不溶性的棕色Phenazine聚合物。此酶对固定剂敏感，故须用新鲜切片。自备材料： 1、恒温培养箱 2、光学显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、冰冻切片，厚6μm，不固定。 2、滴加CO清除液于切片上，铺满整个样品表面。 3、切片入DAB孵育液中，37℃避光孵育45～60min。 第1页，共2页

4、移去切片上的染色液，滴加CO清除液于切片上，铺满整个样品表面。 5、蒸馏水稍洗3～5s。 6、(可选)滴加苏木素染色液浅染细胞核3～5min。 7、流水冲洗10min。常规脱蜡透明，中性树胶封固。 染色结果： CO酶活性部位棕色 心肌、肾小管上皮内颗粒(线粒体)蓝色 阴性对照(可选)：取新鲜配制好的DAB孵育液，按DAB孵育液:CO对照液=50:1的比例混合，即为CO对照工作液。相同切片入CO对照工作液，室温孵育30～60min，其余同上，呈阴性反应。 注意事项： 1、本染色液适用于冰冻切片，同时应减少切片在室温暴露的时间。 2、CO孵育液孵育时间因组织而异，心肌、肾孵育约20～30min，肝脏约50～60min，甲状腺滤泡上皮约2h。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 第2页，共2页

植物细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒产品说明书中文版

植物细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 植物细胞色素C氧化酶活性测定试剂是一种旨在通过细胞色素C氧化酶反应系统中还原性细胞色素C氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）等裂解悬液中细胞色素C氧化酶的活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。 技术背景 细胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase）存在于真核生物的细胞线粒体上（包括植物细胞），主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。基于底物还原型细胞色素C（reduced cytochrome c），受到细胞色素C氧化酶的催化，转化为氧化型细胞色素C（oxidized cytochrome c），在分光光度仪下，出现吸光值的变化（550nm 波长），由此定量测定细胞色素C氧化酶的活性。细胞色素C氧化酶反应系统为： 产品内容 清理液（Reagent A）毫升 裂解液（Reagent B）毫升 缓冲液（Reagent C）毫升 反应液（Reagent D）毫升 稳定液（Reagent E）微升 稀释液（Reagent F）微升 产品说明书1份 保存方式 保存清理液（Reagent A）和缓冲液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；反应液（Reagent D）避免光照；有效保证6月 用户自备 15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器 1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器 DOUNCE匀浆器：用于组织匀化 微型台式离心机：用于样品制备 培养箱：用于反应孵育 比色皿：用于比色分析的容器 分光光度仪：用于比色分析

细胞色素C氧化酶与慢性阻塞性肺疾病

·１４３６· 细胞色素Ｃ氧化酶与慢性阻塞性肺疾病 刘彩虹陈平 【摘要】慢性阻塞性肺疾病（ｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ，ＣＯＰＤ）是以气流的不完全可逆为特征。且星进行性加重，多与吸烟有关，但其发病与加重的确切机制并未完全阐明。细胞色素Ｃ氧化酶（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ ｏｘｉｄａｓｅ，ＣＯＸ）是线粒体内膜呼吸链的末端复合物，广泛的存在于真核细胞，在细胞能量代谢、氧化应激、衰老、神经元功能障碍和肿瘤发生等多种生理、病理过程中发挥了重要作用。近年来发现ＣＯＸ在ＣＯＰＤ的发生中也起着十分重要的作用。本文主要阐述ＣＯＸ在ＣＯＰＤ中的研究进展。 【关键词】细胞色素Ｃ氧化酶；慢性阻塞性肺疾病；氧化应激；细胞凋亡 ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｏｘｉｄａｓｅａｎｄｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅＬ儿，Ｃ口ｉ—ｈｏｎｇ。ＣＨＥＮＰｉｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｅｎｔｒａｌ—ＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＸｉａｎｇｙａＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１００１１，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＣＨＥＮＰｉｎｇ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｏｘｉｄａｓｅ（ＣＯＸ）ｉｇａｋｅｙｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｂｅｃａｕｓｅ，ａｓｔｈｅｔｅｒｍｉｎａｌｃｏｍｐｌｅｘｏｆｔｈｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｅｌｅｃｔｒｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｃｈａｉｎ，ｉｔｃａｔａｌｙｚｅｓｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｒｅｄｕｃｅｄｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｂｙｏｘｙｇｅｎ．Ｔｈｕｓ，ａｂｅｔｔｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｔｈｅｒｏｌｅｏｆＣＯＸｉｎｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ（ＣＯＰＤ）ｐａｔｉｅｎｔｓａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＣＯＰＤｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｍｏｒｅｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｋｎｏｗｌｅｄｇｅｏｆＣＯＰＤ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｏｘｉｄａｓｅ；Ｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ；Ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ 慢性阻塞性肺疾病（ｃｈｒｏｍｅｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ，ＣＯＰＤ）是一种具有气流受限特 征的可预防和治疗的疾病，主要累及肺，但也可引起 全身（或称肺外）的不良效应，气流受限不完全可逆、 呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有 害颗粒的异常炎症反应有关Ⅲ。由于其患病人数 多，死亡率高，社会经济负担重，已成为一个重要的 公共卫生问题口］。目前关于其发病机制主要涉及以 下几个方面：气道的慢性炎症、蛋白酶／抗蛋自酶失 衡、氧化应激，并且细胞凋亡学说也越来越受到人们 的关注。细胞色素Ｃ氧化酶（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ ｏｘｉｄａｓｅ，ＣｏＸ）又称为线粒体呼吸链复合体Ⅳ，是线 粒体呼吸酶系的关键酶，是唯一能将电子传递给氧 分子的递电子复合物，与活性氧的生成，ＡＴＰ的合 成有关，其活性的改变在细胞的凋亡和氧化应激过 程中起着重要的作用。目前对ＣＯＸ的结构，生物 学功能有了较全面的了毹，对ＣＯＸ活性在ＣＯＰＤ 中也有～定的探讨。 作者单位：４１００１１长沙，中南大学湘雅二医院呼吸内科 通讯作者：陈乎．综述． １ＣＯＸ的结构和生物学特性 １．１ＣＯＸ的分子结构ＣＯＸ是细胞核ＤＮＡ （ｎＤＮＡ）基因组和线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）基因组分 别编码的亚基共同组成的复杂的复合物，位于线粒 体内膜，相对分子质量约为２０００００，所有哺乳动物 真核细胞的ＣＯＸ由１３个亚基组成，其中构成级联 反应核心的最大３个亚基（ＣＯＸＩ，Ⅱ，ＩｌＩ）由 ｍｔＤＮＡ编码，具有酶催化活性，其余１０个亚基 （ＣｏＸⅣ，Ｖａ，Ｖｂ，Ｖ１ａ，Ⅵｂ，ＶＩＣ，Ⅶａ，Ⅶｂ，ⅦＣ和 Ⅷ）均由ｎＤＮＡ编码，对催化亚基具有调节作用∞Ｊ。 同时每个ＣｏＸ分子含有一个双铜原子组成的ＧｕＡ 中心，一个血红素ａ，一个血红索ａ。和ＧｕＢ中心。 其中ＣＯＸｌ中含有血红素ａ，血红素ａ。和ＧｕＢ，三 者均位于线粒体内膜的同一深度。亚基Ⅱ中含有 ＧｕＡ中心Ｈ］。且两亚基中含有该酶所有的氧化还 原中心，用单克隆抗体封闭结合位点的方法证明 ＣＯＸⅡ是ＣＯＸ和细胞色素Ｃ的结合部位，两结合 位点位置接近，至少一个将电子从细胞色素ｃ递给 ＣＯＸ，另一个则起调控作用，或兼有传递电子的活 性。ＣＯＸⅢ与质子泵移位有关，但主要起辅助 作用。 万方数据

光谱法研究细胞色素c氧化酶Cu_A结构域蛋白的稳定性

第21卷,第1期光　谱　实　验　室Vol.21,No.1 2004年1月Chinese J ournal of Sp ectrosco p y L aboratory January,2004 光谱法研究细胞色素c氧化酶Cu A 结构域蛋白的稳定性 李连之 (聊城大学化学化工学院　山东省聊城市　252059) 宋爱新　黄仲贤 (复旦大学化学系化学生物学实验室　上海市　200433) 摘 要 利用荧光光谱和圆二色谱研究了细胞色素c氧化酶Cu A结构域蛋白的稳定性。结果表明,随着溶液pH值的升高,Cu A结构域蛋白的稳定性降低。随着温度的升高,Cu A结构域蛋白的二级结构遭到破坏。脱金属形式蛋白的热稳定性减小,表明双核金属铜中心的存在对Cu A结构域蛋白的稳定性起重要作用。 关键词　细胞色素c氧化酶,Cu A结构域蛋白,荧光光谱,圆二色谱。 中图分类号:O657.32 文献标识码:A 文章编号:1004-8138(2004)01-0135-03 1　前言 细胞色素c氧化酶是真核生物线粒体内膜和需氧菌细胞膜电子传递链上的终端酶,它是由多个亚基组成的复合酶分子,其核心亚基Ⅱ中含有可溶性Cu A结构域。Cu A结构域是一个高度离域化的混价双核金属中心结构[Cu+1.5—Cu+1.5],这是生物体系中的一种新颖的化学结构。因此,研究Cu A结构域蛋白的各种性质,对进一步阐明细胞色素c氧化酶的作用机理和丰富发展金属酶的蛋白质化学都具有重要意义。近年来,有关细胞色素c氧化酶的研究取得了重要进展[1,2]。我们曾报道了细菌P ar acoccus versutus的细胞色素c氧化酶可溶性Cu A结构域的表达、分离纯化和初步表征[3]。本文报道了在不同pH和温度下Cu A结构域的荧光光谱和圆二色散谱,以考察酸碱度和加热对Cu A结构域蛋白稳定性的影响。 2　实验部分 2.1　仪器与试剂 Cary Eclipse荧光分光光度计(VARIAN公司);Jasco J-715型圆二色谱仪(日本分光株式会社)。 Cu A结构域蛋白的制备参见文献[2]。所用试剂均为分析纯。 2.2　apo-Cu A结构域蛋白的制备 将20mm ol/L T ris·HCl(pH7.5)缓冲液配制的100 m ol/L Cu A结构域蛋白,对20mm ol/L Tr is·HCl(pH7.5),10mm ol/L EDT A的缓冲液在4℃下透析24h,透析过程中更换3—4次透析液,并监测Cu A结构域蛋白在530nm和806nm处的特征吸收,以确保完全去除铜离子。 国家自然科学基金重大资助项目(No.39990600) 联系人,电话:(0635)8238486;E-mail:lilianzhil963@https://www.wendangku.net/doc/fb12206929.html, 作者简介:李连之(1963—),男,山东省茌平县人,教授,博士,研究方向:生物大分子光谱学。 收稿日期:2003-07-01

肌肉活检细胞色素C氧化酶染色方法

NY: PFI 3499 CYTOCHROME OXIDASE PROTOCOL PRINCIPLE: Cytochrome oxidase (COX) is the collective name for Complex IV of the oxidative respiratory chain of enzymes located in mitochondria. This method is a modification of the "Nadi" reaction. The use of 3,3' diaminobenzidine (DAB) results in a brown insoluble compound at the site of cytochrome oxidase activity. SPECIMEN REQUIRED: Snap frozen human striated muscle Controls: Stain several different muscles simultaneously. There is normally always enzyme activity present in muscle. The degree and location is interpreted. METHOD None, use snap frozen tissue. Fixation: Technique: Cut 10 - 16 micron (12 μm) sections in cryostat from snap frozen biopsy. Attach one or more sections to a No.1?, 22 mm square coverslip. Equipment: Ceramic staining rack - Thomas Scientific #8542-E40 Columbia staining dish - Thomas Scientific #8542-C12 - Thomas Scientific #8542-E30 dish(jar) staining Columbia gloves Forceps Latex Reagents: C-10) Catalase (Sigma Cytochrome C (Sigma C-2506 water deionized 3, 3' Diaminobenzidine tetrahydrochloride (Sigma D-5637) CARCINOGENIC, store at -20o C Permount - Fisher SP15-100, FLAMMABLE HEALTH HAZARD Reagent alcohol, ACS histochemical Fisher A962-4,or HPLC A995 FLAMMABLE, TOXIC, store at room temp. in flammable cabinet Sodium dibasic phosphate (Na2HPO4) anhydrous ACS (FW 141.96)-Sigma S9763, Fisher S374, or Mallinckrodt 7917 Store at room temperature Sodium monobasic phosphate (Na2HPO4) monohydrate (FW 137.99) Store at room temperature Sucrose -Sigma S7903, Store at room temperature Xylenes - Fisher #HC700-1GAL, FLAMMABLE, Store at room temperature in flammable cabinet)

Gn1a - Cytokinin Oxidase Regulates Rice Grain Production(细胞色素氧化酶对水稻产量的调控)

细胞色素氧化酶对水稻产量的调控 调控绝大部分重要农艺性状的基因都是数量性状基因，这些基因一般起源于等位基因的自然变异。本文介绍的一个水稻增产QTL Gn1a是能产生细胞色素氧化/脱氢酶（OsCKX2）的基因，后则能使细胞分裂素降解。OsCKX2表达量的减少导致细胞分裂素在花序分生组织中积累，进而导致生殖器官的增加，最终使产量增加。聚合了控制粒数和株高位点的具有相同遗传背景的株系都表现出了有利性状。 食物短缺是本世纪最严重的全球问题之一。联合国粮农组织（FAO）估计2000-2002年有8.52亿人营养不良。64亿全球人口仍在快速增长，预计到2050年将达到89亿。无论直接食用还是饲养动物，谷物都是人类主要的能量来源。人类消耗的50%的热量来自于3种谷物：水稻（23%）、麦（17%）、玉米（10%）。为了满足人口快速增长对食物的需求，谷物产量在2025年必须增加50%。 包括产量在内的大多数主要的农艺性状都表现为连续的变异。这些复杂的性状大多受到起源于自然变异的QTLs的控制。QTL分析已经成为发掘有益农艺性状基因的有效途径。 水稻是一种主要的粮食作物。由于水稻基因组在主要的几种谷物中是最小的（390Mb），且其基因组与其他谷物的基因组有同源性，还容易转化，所以水稻成了单子叶植物的模式植物。因此，人们发掘了许多水稻突变体和分子标记，并对水稻进行了测序和作图。这些成果有利于进行水稻QTL分析。粒数和株高是直接影响产量的重要农艺性状。水稻和小麦矮化育种是导致60年代绿色革命的经典育种方法。这些矮化作物能获得高产是由于这些作物在暴风雨中能抗倒伏。近十年里有许多产量和株高QTLs方面的研究，然而这些QTL中的基因还没有被鉴定出来，它们在染色体上的位置也还不可知。我们的目标就是鉴定出这些控制粒数和株高的数量性状基因，阐明其分子机理，并将其应用于育种实践。 QTL analysis：选择表型差异大的双亲进行QTL分析是必要的，因为QTL的检测就是基于双亲自然等位基因的差异。我们选择了籼稻Habataki和粳稻Koshihikari作为研究材料，因为两者之间的农艺性状有巨大差异，还有许多可用的分子标记。Habataki的平均株高要比Koshihikari矮，但主穗谷粒数较多(Fig.1,A to D)。 我们构建了96个Habataki和Koshihikari的回交自交系(BILs)作为初级作图群体。作图群体的粒数和株高近似呈正态分布，表明这两个性状都受QTl控制(fig.S1)。QTL分析检测到了5个增加粒数(Gn)的QTLs和4个控制株高(Ph)的QTLs(Table1and Fig.1E)。效应最大的株高QTL Ph1定位于编码赤霉素20氧化酶的矮秆基因sd1的附近。比较Habataki和Koshihikari 的SD1基因发现Habataki在赤霉素20氧化酶的编码区有383bp的缺失，这个功能缺失基因导致Habataki株高降低。Habataki在赤霉素20氧化酶编码区的缺失跟曾经引导了绿色革命的IR8中发现的变异是一样的。 效应最大的增加穗粒数的QTL Gn1位于第一号染色体上，它被进一步研究。Habataki的Gn1等位基因比Koshihikari的等位基因每穗多产生约92颗谷粒，Gn1能解释两者在主穗谷粒数上44%的差异(Table1)。迄今为止，已经有许多水稻产量相关的QTL被报道。其中一些QTLs位于1号染色体短臂上的Gn1附近，这表明它们可能是同一个QTL。虽然这些QTLs还

实验四 细胞色素氧化酶的组织定位

实验四植物体内细胞色素氧化酶的组织定位 一、实验目的 掌握植物体内细胞色素氧化酶的组织定位的原理与技术 二、实验原理 以α-萘酚为底物催化的反应产物与对氨基二甲基苯胺的重氮基结合，在细胞色素氧化酶存在的条件下产生偶联偶氮反应，生成蓝色靛酚产物吲哚酚蓝。 三、实验材料、试剂与仪器 1、实验材料：施肥的白菜和未施肥的小白菜根系。 2、实验试剂： (1)1% α-萘酚溶液：称取1g α-蔡酚溶于100ml蒸馏水中，加热煮沸，然后逐滴加入25%KOH，直至蔡酚完全溶解为止，过滤后保存于冷暗处。 (2)1%对氨基二甲基苯胺溶液：称取1g对氨基二甲基苯胺盐酸，放入100ml 蒸馏水中加热煮沸，然后保存在冰箱中，但只能保存一星期。 (3)0.1mol/L磷酸缓冲液，pH5.8。 3、实验仪器：刀片、镊子、托盘等。 四、实验步骤 1. 取小白菜根系，蒸馏水冲洗干净后，用刀片将根系分开，一份作为实验组，一分作为空白对照。 2. 将切开的根材料放入pH5.8的磷酸缓冲液内，在室温下（约25℃）放置10分钟，然后将材料移入含有1% α－萘酚和1%对氨基二甲基苯胺的等量混合液中，约30分钟后，取出后，用蒸馏水反复冲洗后，将染色的材料放在有蒸馏水托盘中，观察染色结果。 五、实验结果 图1 施肥的小白菜根系细胞色素氧化酶的组织染色图

注：上为对照组，下为实验组。 六、实验讨论 由实验结果可以看出，小白菜根系染色后变蓝，且对照组与实验组均被染色。其原因可能是对照组高温处理的时间不够，没能使细胞色素氧化酶完全失活，因此对照也出现染色的情况。另外，侧根可明显观察到染色变蓝的情况，而在主根观察到染色的结果不明显，可能的原因是染色时间短，染液没能完全进入根内部，因此观察到主根染色较浅，不明显。

生物化学试题及答案(3)

生物化学试题及答案（6） 第六章生物氧化 【测试题】 一、名词解释 1.生物氧化 2.呼吸链 3.氧化磷酸化 4. P/O 比值 5.解偶联剂 6.高能化合物 7.细胞色素 8.混合功能氧化酶 二、填空题 9．琥珀酸呼吸链的组成成分有____、____、____、____、____。 10．在NADH 氧化呼吸链中，氧化磷酸化偶联部位分别是____、____、____，此三处释放的能量均超过____KJ。11．胞液中的NADH+H+通过____和____两种穿梭机制进入线粒体，并可进入____氧化呼吸链或____氧化呼吸链，可分别产生____分子ATP 或____分子ATP。 12．ATP 生成的主要方式有____和____。 13．体内可消除过氧化氢的酶有____、____和____。 14．胞液中α-磷酸甘油脱氢酶的辅酶是____，线粒体中α-磷酸甘油脱氢酶的辅基是____。 15．铁硫簇主要有____和____两种组成形式，通过其中的铁原子与铁硫蛋白中的____相连接。 16．呼吸链中未参与形成复合体的两种游离成分是____和____。 17．FMN 或FAD 作为递氢体，其发挥功能的结构是____。 18．参与呼吸链构成的细胞色素有____、____、____、____、____、____。 19．呼吸链中含有铜原子的细胞色素是____。 20．构成呼吸链的四种复合体中，具有质子泵作用的是____、____、____。 21．ATP 合酶由____和____两部分组成，具有质子通道功能的是____，____具有催化生成ATP 的作用。 22．呼吸链抑制剂中，____、____、____可与复合体Ⅰ结合，____、____可抑制复合体Ⅲ，可抑制细胞色素c 氧化酶的物质有____、____、____。 23．因辅基不同，存在于胞液中SOD 为____，存在于线粒体中的SOD 为____，两者均可消除体内产生的 ____。 24．微粒体中的氧化酶类主要有____和____。 三、选择题 Ａ型题

氧化酶试验

氧化酶试验(oxidasetest)氧化酶又名细胞色素氧化酶、细胞色素氧化酶C或呼吸酶。试验用于检测细菌/是否有该酶存在。原理是氧化酶在有分子氧或细胞色素C存在时，可氧化四甲基对苯撑二胺出现紫色反应。假单胞菌属、气单胞菌属等阳性，肠杆菌科阴性，可区别。 血浆凝固酶：由金黄色葡萄球菌致病性菌株产生。能使含有抗凝剂的人或兔血浆发生凝固。在感染部位由于凝固酶的产生，使体液中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白，沉积于细菌表面，可阻碍吞噬细胞对细菌的吞噬和杀灭作用。 凝固酶试验(coagulase test)原理： 致病性葡萄球菌→ 凝固酶→ 血浆中纤维蛋白原(液态) 纤维蛋白(固态) → 血浆凝固方法： ①玻片法：检测结合凝固酶 ②试管法：检测游离凝固酶 应用： 作为鉴别葡萄球菌致病性的重要指标。 一、名词解释 汹涌发酵”现象——在牛乳培养基中，产气荚膜梭菌能分解乳糖产酸使酪蛋白凝固，同时产生大量气体将凝固的酪蛋白冲散形成蜂窝状，并将液面上的凡士林向上推挤，甚至冲开棉塞，气势凶猛，称为“汹涌发酵”现象，为本菌特征之一 肥达反应——用已知伤寒菌的H(鞭毛)和O(菌体)以及甲型(A)与乙型(B)副伤寒沙门氏菌的标准液与病人血清做凝集试验，用于伤寒副伤寒的辅助诊断或用于流行病学调查的免疫凝集实验。 外斐试验——变形杆菌属的X19,X2.Xk菌株的菌体O抗原与斑疹伤寒立克次体和恙虫病立克次体有共同抗原，故可用OX19，OX2，OXk代替立克次体作为抗原与相应患者血清进行交叉凝集反应，此称外斐试验，辅助诊断立克次体病。 SPA——葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白成分，称为葡萄球菌A蛋白。英文缩写为SPA MRSA—是能产生β—内酰胺酶而破坏青霉素的β—内酰胺环而使青霉素失效而表现出耐药性的一类葡萄球菌。 胆汁溶菌试验——胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，可能是由于胆汁降低细胞膜表面的张力，使细胞膜破损或使菌体裂解；或者是由于胆汁加速了肺炎链球菌本身自溶过程，促使细菌发生自溶。 血浆凝固酶试验——血浆凝固酶能使含有肝素等抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质, 葡萄球菌中致病株大多数能产生, 是一种主要致病物质，是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。也是区别金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌的主要指标，该酶可分结合凝固酶与游离凝固酶，前者可用玻片法检测，后者可用试管法检测 Nagler（奈格尔）试验：产气荚膜梭菌在卵黄琼脂平板上，菌落周围出现乳白色浑浊圈，是由细菌产生的卵磷脂（α-毒素）分解卵黄中的卵磷脂所致，若在培养基中加入α毒素的抗血清，则菌落周围不出现浑浊，为本菌特征之一，可用于产气荚膜梭菌的鉴定。 L型菌?——是细菌、真菌等微生物的细胞壁缺陷型。大多数细菌可在某些因素的影响下失去细胞壁变为L 型 氧化酶实验——氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。常用有三种方法；细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。 渺茫(413417227) 21:47:37 X因子----是一种耐热的存在于血红蛋白中的一种血红素及其衍生物，含铁卟啉，是细菌合成过氧化氢酶，过氧化物酶与细胞色素氧化酶的辅基

细胞色素氧化酶CYP3A4基因突变与表型研究进展

万方数据

万方数据

万方数据

万方数据

细胞色素氧化酶CYP3A4基因突变与表型研究进展 作者：王安， 周宏灏， WANG An， ZHOU Hong-hao 作者单位：中南大学,临床药理研究所,湖南,长沙,410078 刊名： 中国临床药理学杂志 英文刊名：THE CHINESE JOURNAL OF CLINICAL PHARMACOLOGY 年，卷(期)：2005,21(6) 被引用次数：5次 参考文献(22条) 1.Hashimoto H;Toide K;Kitamura R Gene structure of CYP3A4,an adult - specific form of cytochrome P450 in human livers,and its transcriptional control 1993 2.Shimada T;Guengerich FP Evidence for cytochrome P -450NF,the nifedipine oxidase,being the principal enzyme involved in the bioactivation of aflatoxins in human liver 1989 3.Peyronneau MA;Renaud JP;Jaouen M Expression in yeast of three allelic cDNAs coding for human liver P4503A4 different stabilities,binding properties and catalytic activities of the yeast - produced enzymes 1993 4.Gonzalez FJ;Schmid BJ;Umeno M Human P450PCN1:sequence,chromosome localization,and direct evidence through cDNA expression that P450PCN1 is nifedipine oxidase 1988 5.Rebbeck TR;Jaffe JM;Walker AH Modification of clinical presentation of prostate tumors by a novel genetic variant in CYP3A4 1998 6.Walker AH;Jaffe JM;Gunasegaram S Characterization of an allelic variant in the nifedipine -specific element of CYP3A4:ethnic distribution and implications for prostate cancer risk.Mutations in brief no 191 Online 1998 7.Hsieh KP;Lin YY;Cheng CL Novel mutations of CYP3A4 in Chinese[外文期刊] 2001 8.Ball SE;Scatina J;Kao J Population distribution and effects on drug metabolism of a genetic variant in the 59 promotor region of CYP3 A4[外文期刊] 1999(3) 9.Kuehl P;Zhang J;Lin Y Sequence diversity in CYP3A promoters and characterization of the genetic basis of polymorphic CYP3A5expression[外文期刊] 2001(4) 10.Garcia-Martin E;Martinez C;Pizarro RM CYP3A4 variant alleles in white individuals with low C YP3A4 enzyme activity[外文期刊] 2002(3) 11.Paris PL;Kupelian PA;Hall JM Association between a CYP3A4 genetic variant and clinical presentation in African - Ameri-can prostate cancer patients 1999 12.Sata F;Sapone A;Elizondo G CYP3A4 allelic variants with amino acid substitutions in exons 7 and 12:evidence for an allelic variantwith altered catalytic activity 2000 https://www.wendangku.net/doc/fb12206929.html,mba JK;Lin YS;Thummel K Common allelic variants of cytochrome P4503A4 and their prevalence in different populations[外文期刊] 2002(2) 14.Matsumura K;Saito T;Takahashi Y Identification of a novel polymorphic enhancer of the human CYP3A4 gene[外文期刊] 2004(2) 15.Eiselt R;Domanski TL;Zibat A Identification and functional characterization of eight CYP3A4 protein variants[外文期刊] 2001

细胞色素C氧化酶亚基Cox4的克隆及高效表达

苏明慧，汪一荣，杨艳梅，等．细胞色素Ｃ氧化酶亚基Ｃｏｘ４的克隆及高效表达［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１５）：３１－３４．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１５．００８ 细胞色素Ｃ氧化酶亚基Ｃｏｘ４的克隆及高效表达 苏明慧，汪一荣，杨艳梅，商巾杰 （南京师范大学生命科学学院，江苏南京２１００４６） 摘要：Ｃｏｘ４是电子传递链上复合体Ⅳ的１个关键亚基，实现Ｃｏｘ４的高效表达以及制备其抗体，对于线粒体功能研究至关重要。根据裂殖酵母序列信息数据库（Ｓ．ｐｏｍｂｅ＿ＧｅｎｅＤＢ）中ｃｏｘ４的基因序列（登录号：ＳＰＡＣ１２９６．０２）设计引物，以粟酒裂殖酵母的ｃＤＮＡ序列为模板，通过ＰＣＲ扩增技术得到目标蛋白的基因，然后通过克隆构建到含有Ｔ７强启动子的表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）上，并将其转入大肠杆菌ＢＬ２１（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１）中实现重组工程菌株的构建。结果表明，通过一系列条件优化实现了对重组工程菌株中Ｃｏｘ４的高效表达，并纯化得到大量相应蛋白，最后以纯化的蛋白为抗原成功制备了Ｃｏｘ４抗体。Ｃｏｘ４抗体的成功制备为粟酒裂殖酵母中线粒体功能研究奠定了基础。 关键词：线粒体；粟酒裂殖酵母；细胞色素Ｃ氧化酶；Ｃｏｘ４ 中图分类号：Ｑ７８５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１５－００３１－０３ 收稿日期：２０１７－０３－１５ 基金项目：国家自然科学基金（编号：３１４０００３２）；江苏省高校自然科学研究项目（编号： １３ＫＪＢ１８００１０）。作者简介：苏明慧（１９９１—），女，河南周口人，硕士研究生，从事粟酒裂殖酵母线粒体蛋白结构与功能研究。Ｅ－ｍａｉｌ：１５７９２５７４８４＠ｑｑ．ｃｏｍ 。通信作者：商巾杰，博士，副教授，从事裂殖酵母中与人类疾病相关基因的结构和功能研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈａｎｇｊｉｎｊｉｅｙ＠１６３．ｃｏｍ。 线粒体有自己的基因组，是一种半自主性的细胞器［１－２］ ，几乎存在于所有真核生物中。线粒体能够进行氧化磷酸化和 三磷酸腺苷（ ＡＴＰ）的合成，是有氧呼吸的主要场所［３－４］ ，可为细胞的生命活动提供能量，被称为细胞内的发动机［５］ 。同 时，线粒体还参与调控细胞的信息传递、细胞的凋亡和细胞的分化等一系列生理过程，并且还对细胞生长和细胞周期进行 调控［ ６］，因此，线粒体对细胞的生长至关重要［５］ 。氧化磷酸化是一个电子传递过程，依赖于线粒体的电子传递链。线粒 体的电子传递链对于线粒体功能的正常发挥十分重要［７］ ，一旦电子传递链受损会引起很多疾病的发生［８－９］。在粟酒裂殖 酵母中，电子传递链由４种复合体组成，而组成这些复合体的蛋白是由核基因组和线粒体基因组共同编码的。细胞色素Ｃ氧化酶（复合物Ⅳ）是线粒体中电子传递链的末端酶，催化电 子从细胞色素Ｃ转移到氧［１０］，核编码的细胞色素Ｃ氧化酶亚 基４（Ｃｏｘ４）是其中１个关键亚基。由此可见，在对线粒体功能进行研究时，不可避免地需要对线粒体中构成这些复合体的蛋白水平进行检测，因此制备这些蛋白的相应抗体就显得尤为重要。本研究主要是将粟酒裂殖酵母中构成复合体Ⅳ的细胞色素Ｃ氧化酶亚基Ｃｏｘ４在大肠杆菌中进行高效表达，并制备相应的抗体。１　材料与方法１．１　试验材料 １．１．１　菌株与质粒　粟酒裂殖酵母单倍体菌株ｙＨＬ６３８１［ｈ＋，组氨酸生物合成缺陷型（ｈｉｓ３－Ｄ１），亮氨酸生物合成缺 陷型（ｌｅｕ１－３２），尿嘧啶生物合成缺陷型（ｕｒａ４－Ｄ１８），腺嘌呤生物合成缺陷型（ ａｄｅ６－Ｍ２１０）］，由南京师范大学微生物所实验室保存。质粒ｐ ＥＴ－２８ａ（＋）为笔者所在实验室保存。１．１．２　试剂　ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶、限制性内切酶、ＳｏｌｕｔｉｏｎⅠ（货号为６０２２）、蛋白ｍａｒｋｅｒ，购自ＴａＫａＲａ公司；ＤＮＡｍａｒｋｅｒ，购自北京全式金生物技术有限公司；ＤＮＡ割胶回收试剂盒、ＰＣＲ过柱纯化试剂盒，购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；十二烷基硫酸钠（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ，简称ＳＤＳ）、琼脂粉、４－羟乙基哌嗪乙磺酸（ＨＥＰＥＳ）、山梨醇（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）、３－（Ｎ－吗啉基）丙磺酸（ ＭＯＰＳ）、３０％丙烯酰胺和乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ），购自索莱宝公司；酵母粉，购自ＯＸＯＩＤ公司；腺嘌呤、尿嘧啶、精氨酸、组氨酸、卡那霉素（Ｋａｎ），购自Ｓｉｇｍａ公司；ＲＮＡ提取试剂盒，ＯＭＥＧＡ（货号为Ｒ６８７０－００），购自南京贝纳生物技术有限公司；ｉＳｃｒｉｐｔｃＤＮＡ合成试剂盒（货号为１７０８８９０），购自南京润亚生物科技发展有限公司； ＰＣＲ引物，由南京思普金生物工程技术服务有限公司合成；常用试剂为分析纯级，购自国药集团化学试剂有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司。 １．１．３　培养基　（１）ＬＢ培养基配方（１００ｍＬ）：１ｇ胰蛋白胨， ０．５ｇ酵母粉，１ｇ氯化钠，在固体培养基中添加２ｇ琼脂粉。（２）ＬＢ＋Ｋａｎ培养基：在ＬＢ培养基中添加卡那霉素至终浓度为５０ｍｇ／Ｌ。（３）ＹＥＳ培养基配方（１００ｍＬ）：３．０ｇ葡萄糖，０．５ｇ酵母粉，２２．５０ｍｇ腺嘌呤，２２．５０ｍｇ尿嘧啶，２２．５０ｍｇ亮氨酸，２２．５０ｍｇ组氨酸。１．２　试验方法 １．２．１　引物的设计　根据裂殖酵母序列信息数据库（Ｓ．ｐｏｍｂｅ＿ＧｅｎｅＤＢ）中登录号为ＳＰＡＣ１２９６．０２的基因序列，通过ｈｔｔｐｓ：／／ｉｈｇ．ｇｓｆ．ｄｅ／ｉｈｇ／ｍｉｔｏｐｒｏｔ．ｈｔｍｌ预测线粒体定位序列，将线粒体定位序列去掉后，设计上下游特异性引物，在正向引物的５′端加入ＮｄｅⅠ酶切位点，在互补链引物的５′端加入ＸｈｏⅠ酶切位点（下划线分别表示ＮｄｅⅠ、ＸｈｏⅠ酶切位点）：正向引物：５′－ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＧＣＣ－ — １３—江苏农业科学　２０１８年第４６卷第１５期