外周血单个核细胞
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（聚蔗糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤离心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%～95%，细胞获得率可达80%以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。
●人外周血单核细胞（PBMC）分离及培养
PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
●工具／原料
全血（以10ml为例）
无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水
蔗糖溶液（FicollPague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)
RPMI 1640培养基（Invitrogen）
胎牛血清（FBS）（GIBCO）
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒
●方法／步骤
配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
1．将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
2. 取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。
3.然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合
在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
4.2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。
离心完毕将得到如图所示分层；
5.PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管
中。
6.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作
的清洗；
7.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；
8.细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放
入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。
●注意事项
全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。
外周血单个核细胞的分离(优质参考)
实验二十四外周血单个核细胞的分离 (Separation of mononuclear cell in peripheral blood) 免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。 【实验原理】 血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。 【主要试剂和器材】 1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。 2.5g/L台盼蓝。 3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。 4.Hank,s液。 5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。 6.水平离心机、显微镜。 【操作方法】 1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Hank,s液混匀。 2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。 3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。 4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。 5. 用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。 6.加入4倍量以上的Hank,s液，充分混匀，1000r／min离心l0min。离心后倾弃上清液，再用Hank,s液洗2次。 7.用含10%～20%灭活小牛血清的Hank,s液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。【结果判断】 【注意事项】 1.将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。 2.温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(18～25℃)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细胞活性。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（聚蔗糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤离心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%～95%，细胞获得率可达80%以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。 ●人外周血单核细胞（PBMC）分离及培养 PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。 Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 ●工具／原料 全血（以10ml为例） 无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水 蔗糖溶液（FicollPague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02) RPMI 1640培养基（Invitrogen） 胎牛血清（FBS）（GIBCO） 双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO) 二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
人外周血单核细胞分离技术
人外周血单核细胞分离 1.抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min 离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10?12.5 mL 。 2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A中的细胞中加入Hank s液（不含Ca2+、Mg 2+, pH 7.2 ?7.6）体积比仍未1:1 , 混匀，制成细胞悬液。 B:无菌抗凝血与Hank s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。 另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处 将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液 分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。 管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台 单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞 沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的 2 / 3。混匀后离心1500r/mi n 离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。 注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。 再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min 离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank s液（或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640 液3?4 mL）重新混悬细胞37 C、5% C02孵育箱中培养2?3 h 后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640
人外周血单核细胞分离液使用说明
人外周血单核细胞分离液使用说明 产品内容： 试剂Ａ200mL 试剂D200mL 样本稀释液（赠品）200mL 清洗液（赠品）200mL 保存：18℃-25℃保存，有效期两年。人外周血单核细胞分离液易感染细菌，需无菌条件下操作。无菌条件下操作，启封后常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 操作步骤： 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。首先取抗凝血按体积比1:1的比例加全血及组织稀释液混匀，根据稀释后的样本量大小，分以下两种情况： 情况A:稀释后血液样本小于5mL时，实验方法如下： 1.取一支15ml离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（体积比为3:2，试剂总量与稀释后的血液样本量相等。如稀释后的血液样本为5ml，则先后加入试剂A3ml、试剂D2ml），制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。 2.用吸管小心吸取稀释后的血液样本加于分离液液面上，400-550g，离心20-30min（注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。 3.离心后，此时离心管中由上至下分为五层。第一层为稀释液层。第二层为透明试剂D液层。第三层为环状乳白色单核细胞层。第四层为透明试剂A液层。第五层为红细胞层。 4.用吸管小心吸取第二层试剂D层和第三层乳白色细胞层到另一15ml离心管中，往所得离
心管中加入10ml清洗液，混匀细胞。 5.250g，离心10min。 6.弃上清。 7.用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。 8.250g，离心10min。 9.重复6、7、8，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 10.差异贴壁法纯化细胞 （1）用单核细胞无血清培养基或单核细胞完全培养基以1.5-3×106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。（2）2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。 （3）10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。 （4）不贴壁的为淋巴细胞。 注： a)无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加10%自体血浆或2-8%的胎牛血清。 b)完全培养基中含2-20%胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。 c)由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成本相对较低。如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴性分选。 情况B:血液样本大于等于5mL时，实验方法如下： 1.取一支适当的离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（试剂A与试剂D体积比为5:3，试剂总量与稀释后的样本量相等），制成梯度界面。 2.将经稀释后的血液样本小心加于分离液之液面上，450-650g（最大离心力可至1000g），
单个核细胞分离.
Separation of Mononuclear Cells from Whole Peripheral Blood 外周血单个核细胞分离 Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation 聚蔗糖—泛影葡胺分层液密度梯度离心法【Materials】 (1)Lymphocyte Separation Medium: specific gravity 1.077±0.001g/L 淋巴细胞分层液（比重为1.077±0.001g/L） (2) 2％trypan blue solution 2％台盼蓝染液 (3) Hank’s balanced salt solution (HBSS) or RPMI-1640 medium Hank’s液或者RPMI-1640培养基 【Methods】 (1) Drawing 2ml blood from main vein and mixing with 0.1 ml Heparin solution in a tube. 采集静脉血2ml注入盛有0.1ml肝素的试管中，混匀。 (2) Dilute the whole blood with an equal volume of Hank’s balanced salt solution (HBSS) 加入等体积HBSS或PBS等倍稀释血液。
(3) Pipette 2ml lymphocyte separation medium into a centrifuge tube. Then, add the diluted blood sample carefully by flowing along the side of the tube on the LSM. The interface must be clear. 吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。 (4) Centrifugation at 2000rpm for 20 min at room temperature. Four distinct layers are found from top to bottom: 室温2000r／min离心20min。管内可分为以下四层：
人外周血单个核细胞分离液说明书
分离后分离前 水平离心血浆层单个核细胞层分离液层 红细胞层人外周血单个核细胞分离液说明书 货号：P9010/P9011 规格：200mL 产品简介： 本产品是一种用于分离人外周血单个核细胞的无菌、低内毒素水平的密度梯度分离液。外周血中单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，为1.090g/mL左右，淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090g/mL，血小板为1.030~1.035g/mL。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 产品指标： 密度 1.077±0.001g/mL 渗透压 290~350mOsm/kg H2O 无菌 0.1μm 滤膜过滤保存条件： 本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 操作步骤： 1.取新鲜抗凝全血（EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝 均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血 及组织稀释液或者PBS稀释全血。 2.在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体 积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL， 加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过 离心管的三分之二，否则会影响分离效果）， 将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意
保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。） 3.室温，水平转子500~1000g，离心20~30min（血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳 的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g）。 4.离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白 膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。 5.小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞。250g，离心 10min。 6.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。 7.重复步骤6 8.弃上清，细胞重悬备用。 注意事项： A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物 污染。 B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较 低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。 C.血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2h以内），为保持单个核细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。 D.稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降 低细胞得率及纯度。 E.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。 F.血液样本的粘稠度或者是温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳 的分离条件。 G.吸取过多的单个核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增 加；吸取过多的血浆层可能会导致单个核细胞中血浆蛋白及血小板污染。
单个核细胞的分离
单个核细胞的分离：（密度离心法） （一）外周血中的单个核细胞的分离： 1. 眼眶静脉丛采血：（无菌条件下操作） 采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。刺入浓度，小鼠约2～3mm。当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。左右两眼轮换更好。体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml。摘除眼球取血： 左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.6-1mL。 2. 分离PBMC操作步骤： 1）用抗凝管（内含抗凝液0.2ml）收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积（1:1）稀释血液。 或用肝素溶液：生理盐水将肝素配成125-250U/mL的无菌液，4度保存。每1mL全血加0.1mL 肝素溶液。 2）取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。 3）将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。 （稀释血液与分层液体积比例约为2:1）。 （或：将吸管嘴插入离心管底部，将分层液缓慢加入稀释血液的底部。） 4）18-20度，水平离心机以2000r/min离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。（离心温度在18-20度） 5）用毛细血管（或1ml注射器）轻轻插入白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一离心管中。 （或：先吸去最上层的血浆，然后用另一只毛细吸管收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC，避免吸到过多的分层液和血浆。） 6）加入５ml的（不含Ca2+，Mg2+）的Hank's液或RPMI1640洗涤2次，混匀，依次以1500r/min、1000r/min离心10min，吸弃上清。 （*低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板） 7）末次离心后，弃上清，用含有10％小牛血清的RPMI1640 2ml，重悬细胞。 8) 细胞计数：取20ul细胞悬液加20ul 0.4%台盼兰染液，3-5分钟后取样进行计数。 活细胞不着色，折光强；死细胞被然成蓝色，体积略膨大。计数200个细胞，计算活细胞百分率。 单个核细胞浓度(细胞数／1ml细胞悬液)＝(4个大方格内细胞总数/4)310４32(稀释倍数) 活细胞百分率＝(活细胞数/总细胞数)3100％
人外周血单核细胞分离技术
人外周血单核细胞分离 1. 抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10～12.5 mL。 2. 沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A 中的细胞中加入Hank′s液( 不含Ca2+、Mg2+, pH 7.2 ～7.6) 体积比仍未1:1，混匀，制成细胞悬液。 B: 无菌抗凝血与Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。 另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。 管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3. 单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2／3。混匀后离心1500r/min离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。 注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。 再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank′s液( 或含10%胎牛血清及25 mmol /L
不同培养基对人外周血单核细胞来源树突状细胞发育的影响
文章编号（Article ID）：1009－2137（2011）04－1010－05·论著· 不同培养基对人外周血单核细胞来源 树突状细胞发育的影响 陈晨，刘元林，梁晓雷，朱恒，李红，吴英，毛宁，张毅 军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学研究室，北京100850 摘要本研究旨在探讨RPMI1640和IMDM两种培养液对诱导人外周血单核细胞向树突状细胞（DC）发育分化的影响。利用GM-CSF+IL-4细胞因子组合，在培养条件一致的前提下，改变培养液种类，通过对成熟、未成熟DC形态观察，用流式细胞术检测细胞表型和吞噬能力、应用混合淋巴细胞反应（MLR）检测其刺激T细胞的增殖能力，用悬浮芯片技术检测DC与同种异体T细胞共培养后上清中所含细胞因子的变化，分析不同培养液对DC功能的影响。研究结果表明，两种培养液培养所得的DC在形态上无显著差异，DC的吞噬能力以及CD14和CD83的表达亦无显著差异，但应用IMDM培养的DC的CD1a表达明显降低，且对T细胞增殖的刺激能力也显著降低；IMDM培养的DC高表达IL-6、IL-8和IL-10，而IL-12的表达则显著降低。结论：不同的培养体系可获得功能不同的DC，IMDM培养的DC可能与免疫耐受有关，本研究结果为DC在临床上的应用提供了新思路。 关键词RPMI1640；IMDM；单核细胞；树突状细胞 中图分类号R329．28文献标识码A Effect of Different Culture Mediums on the Development of Monocyte-derived Dentritic Cells CHEN Chen，LIU Yuan-Lin，LIANG Xiao-Lei，ZHU Heng，LI Hong，WU Ying，MAO Ning，ZHANG Yi Department of Cell Biology，Institute of Basic Medical Sciences，Beijing100850，China Corresponding Author：ZHANG Yi，Professor，Senior Scientific Researcher．Tel：（010）66931320．E-mail：zhangyi@nic．bmi．ac．cn Abstract This study was aimed to investigate the effect of RPMI1640and IMDM on the development of human peripheral blood monocyte-derived dendritic cells．Under the same cytokines and culture conditions，the different medium types were tested，and the morphology of mature and immature dendritic cells was observed by microscopy，the cell phenotype and endocytosis ability were detected by flow cytometry．Furthermore，the immunoregulatory function of various DC was analyzed by mixed lymphocyte reaction（MLR），the expression of cytokine in culture supernatant of MLR system was also analyzed by Bio-plex technology．The results showed that there were no difference in morphology，CD14，CD83 expression and endocytosis ability between IMDM-cultured DC and RPMI-1640medium-cultured DC，but there was a lower expression of CD1a in IMDM-cultured DC．Moreover，DC cultured with IMDM displayed a significant reduction in stimulating T cell proliferation，and highly expressed IL-6，IL-8and IL-10，but low expressed IL-12．It is concluded that the different cultural mediums can induce DC with different functions and DC cultured with IMDM may correlated with induction of immune tolerance．The results of this study will provide a new idea for DC clinical application． Key words RPMI1640；IMDM；monocyte；dentritic cell J Exp Hematol2011；19（4）：1010－1014 树突状细胞（dendritic cells，DC）作为一种重要的免疫辅佐细胞，是体内最强的抗原呈递细胞。它最大的特点是能够显著刺激初始型T细胞，激发机体免疫反应，在诱导免疫应答中起关键作用［1］。因此DC在人类重大疾病（如肿瘤、移植免疫等）的发病和治疗中具有重要的研究价值。由于DC在体内含量很低，约占白细胞总数的1%－2%，且缺乏特异性的表面分子加以识别与纯化，因此近年来有关DC种类和功能的研究成为焦点。目前有关DC来2+造血干细胞来源的DC，另一种是外周血单核细胞来源的DC。体外培养DC的培养液为RPMI1640［2，3］，结合粒巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimu-lating factor，GM-CSF）和白介素4（interleukin-4，IL-4），可诱导获得CD1a+CD83+具有抗原呈递功 基金项目：国家重点基础研究资助项目（编号2010CB833604）；国家自然科学基金面上项目（编号31070996 通讯作者：张毅，教授、研究员．电话：（010）66931320．E-mail：zhangyi@nic．bmi．ac．cn 2011－02－14收稿；2011－03－29接受 · 0101 ·中国实验血液学杂志Journal of Experimental Hematology2011；19（4）：1010－1014
动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒使用说明
动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒使用说明 规格：3×200mL/kit 保存：动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 组成： 各种动物脾脏单个核细胞分离液200mL 全血及组织稀释液200mL 细胞洗涤液200mL 单个核细胞分离方法 1.制备脾脏的单细胞悬液。 2.取一支适当的离心管，加入与脾脏单细胞悬液等量的分离液（分离液最少不得少于3mL， 总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果）。 3.小心吸取单细胞悬液加于分离液液面上，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德 吸管吸取单细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。） 4.室温，500~900g，离心20~30min。（根据脾脏单细胞悬液的量确定离心条件，单细胞悬 液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件可以自行摸索，以达到最佳分离效果）。 5.离心后，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层为稀释液层；第二层为环状乳白色 单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。 6.用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层至另一洁净的15mL离心管中，向离心管
中加入10ml细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250g，离心10min。 7.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。 8.重复步骤7 9.弃上清，细胞重悬备用。 分层示意图 脾脏单细胞悬液的制备方法 脾脏研磨的方法： 1.无菌条件下摘取脾脏，撕去脾脏被膜，用眼科剪将脾脏剪成小块。 2.将尼龙筛网或者是细胞过滤筛放置于平皿上，加入少量全血及组织稀释液（保证脾脏及 获得的细胞处于液体环境中）。 3.将脾脏放置于筛网上，使用注射器活塞或者是无菌镊子来研磨脾脏（尽量控制研磨力度， 保持筛网悬空，避免在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡） 4.研磨完全后使用全血及组织稀释液冲洗筛网，收集细胞悬液，再经滤网过滤。
对外周血单个核细胞分离方法探讨
对外周血单个核细胞分离方法探讨韩亚萍刘源章莉莉刘婷李军黄祖瑚 2004-7-24 17:06:00 中华现代临床医学杂志 2003年11月 第1卷第9期 【摘要】目的探讨外周血单个核细胞（PBMC）的不同分离方法对分离效果、贴壁能力以及淋巴细胞的增殖活性的影响。方法取肝素抗凝血，分别用羟乙基淀粉（hydrixyethylstarch，HES）自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法三种方法分离单个核细胞，直接进行贴壁计数及多种细胞因子诱导的杀伤细胞 （Cytokine-induced killer，CIK）培养。结果 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll 密度梯度离心法分离的PBMC回收率分别为86.4%、86.0%、85.1%。结论羟乙基淀粉离心沉淀法可有效地分离PBMC。 关键词羟乙基淀粉淋巴细胞分离液单核细胞 Study on the methods of separating peripheral blood mononuclear cells HanYaping，Liu Yuan，Zhang Lili，et al. Deparment of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of Nanjing M edical University，Nanjing210029. 【Abstract】 Objective To investigate the difference among three protocols o f isolating peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）through observing the re covery rate，t he adherent ability and lymphocytes proliferation acˉtivity of t he isolated PBMCs.Methods Use three different isolation protocols，HES（hydrixy e thylstarch）sedimentation method，HES centrifugation method and Ficoll density gradient centrifugation，to isolate PBMCs from healthy donors.Then compare thes
外周血单核细胞的分离以及培养
一、牛外周血单核细胞的分离 1、采血袋采集200ml血液 2、首先在15ml离心管加3ml分离液（室温） 3、轻轻的将3ml全血加到3ml分离液中 4、400g室温离心30min 5、离心后，吸取白膜层（0.5cm）转移到新的离心管 6、加10ml的PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打） 7、250g室温离心10min 8、加5ml的PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打） 9、250g室温离心10min 10、重复8、9，加0.5ml培养液悬浮， 二、磁珠分选 11、将分离得到的PBMCs 进行细胞计数。 12、离心细胞悬液，300×g，10 分钟。吸去上清。 13、将细胞沉淀用buffer（含0.5％BSA 的PBS）悬浮，按每107个细胞加80μL buffer 和20μL 抗CD14 磁珠，充分混匀，2-8℃孵育15 分钟。 14、300×g，10 分钟。吸去上清。用500μL buffer 重悬细胞。 15、将柱子放在磁珠分离器上，吸取细胞悬液加到柱子中，用500μL buffer 清洗三遍柱子。 16、待清洗三遍后，将柱子从磁珠分选器上取下来，加入1mL buffer，用助推器快速推动柱子中的洗脱buffer，收集单核细胞，计数。 17、单核细胞300×g 离心，10 分钟，用含10％的胎牛血清、100U/mL 青链霉素、PH7.2-7.4 的1640（IMDM）全培养液调整细胞浓度为按1×106单核细胞铺入10cm培养皿，37℃5%CO2温箱中培养。 三、磁珠分选注意事项 1、柱容量：1×107磁性标记细胞可上达2×108细胞总量。 注意：当分选的细胞比淋巴细胞大时，柱容量需减少。 2、建议白细胞样本大小：在106—2×108细胞总量中有104—107标记细胞 3、典型富集率：50fold至1000fold,取决于磁性标记的活力和特性，达到10000fold 富集量就可以分装两柱。 4、柱流动停止，不要干涸 5、Void容积:60ul.贮液器容积3.5ml 6、PBS典型的流量包含0.5%BSA：0.35-0.5ml/min。 7、MS柱不可重复使用。 MS柱的准备： 1、准备用buffer漂洗的MS柱：取500ul degassde buffer 到柱的上部，并使buffer 流过全柱。MS 柱流动停止，不要干涸。 2、弃掉废液更换收集管。此时的MS 柱可用于磁珠分选。 注意：装满之后快速使用，避免温度升高产生气泡。用buffer装满柱的时间取决于贮存环境，温度和湿度。因此，时间可能从几秒到变到几分钟。这个时间并不影响分选质量。 用MS柱进行磁珠分选： 在进行下一步之前要等到柱子的贮液器是空的。
人外周血单核细胞来源的树突状细胞的体外“2+2”快速法培养及其鉴定
收稿日期：2008-04-03；接受日期：2008-06-17 基金项目：国家自然科学基金面上项目（30771951）；中国科学院“百人计划”项目；中国科学院知识创新工程重要方向项目（KSCX1-YW-R-16） * 通讯作者（Corresponding author ），E-mail: zhanght@post.kiz.ac 第一作者简介：硕士研究生，E-mail ：luxiaopengcas@https://www.wendangku.net/doc/1b2128612.html, 动 物 学 研 究 2008，Aug. 29(4)：415-420 CN 53-1040/Q ISSN 0254-5853 Zoological Research doi:10.3724/SP.J.1141.2008.04415 人外周血单核细胞来源的树突状细胞的体外 “2＋2”快速法培养及其鉴定 陆小鹏1, 3，李 剑2，孙正华1, 3，赵 娜1, 3，刘 洁1，张华堂1, * (1. 中国科学院昆明动物研究所 免疫生物学实验室，云南 昆明 650223；2. 中国科学院昆明动物研究所 中心实验室， 云南 昆明 650223；3. 中国科学院研究生院，北京 100049） 摘要：以人浓缩白细胞来源的CD14＋单核细胞为前体，建立体外快速培养树突状细胞（dendritic cell, DC ）的方法。采用密度梯度离心和MACS 磁珠分选系统，收集高纯度的CD14＋单核细胞；以rGM-CSF 、rIL-4联合分化2天诱导不成熟DC ，再将分化后的细胞以rTNF-α、IL-1β、IL-6、PGE 2共同活化2天得到成熟DC 。流式细胞仪检测结果表明，分化2天的不成熟DC 具有吞噬能力，且表型HLA-DR 、CD40、CD80表达在80％以上，CD83、CD86基本不表达，成熟后的DC 能够激活T 细胞增殖，HLA-DR 表达增高，CD83、CD86表达占85％。 关键词：单核细胞； 树突状细胞；“2＋2”快速法 中图分类号：Q25 文献标识码：A 文章编号：0254-5853-(2008)04-0415-06 A “2＋2 days” Fast Protocol for the Generation of Dendritic Cells from Human Blood Monocytes LU Xiao-peng 1, 3, LI Jian 2, SUN Zheng-hua 1, 3, ZHAO Na 1, 3, LIU Jie 1, ZHANG Hua-tang 1,* (1. Immunobiology Lab, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Science, Kunming 650223, China; 2. Core Faculty, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Science, Kunming 650223, China; 3. Graduate School of the Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China ) Abstract: A “2＋2 days” fast protocol for the generation of dendritic cells （DC ） from high purity human monocytes in vitro has been established. During the 2-step differentiation and activation process, we demonstrated that 2 days of culture with GM-CSF and IL-4 were sufficient to generate immature DCs capable of antigen uptake. Similarly the mature DCs were activated with a cocktail of rTNF-α, IL-1β, IL-6, and PGE 2 from immature DC in 2 days. This “2＋2” fast DC had the same phenotype and function as the “6＋2” standard DC. Key words: Monocyte; Dendritic cell; “2＋2 days” fast method 树突状细胞（dendritic cell ，DC ）是体内高效的抗原递呈细胞（antigen presenting cel1，APC ）。它们以未成熟状态分布于机体的皮下或黏膜组织内，通过识别捕获微环境内的“异己”成分，将其加工并携带至淋巴组织，完成抗原呈递和DC 成熟的过程，进而激活静息T 淋巴细胞（resting T cell ）应答，启动免疫反应（Sousa ，2006）。 目前，在基础研究和临床应用领域，DC 的获得主要有3种方式：①直接从外周血分离；②从脐带 血和骨髓来源的CD34＋ 细胞诱导；③由外周血来源 的CD14＋ 单核细胞 （monocyte ）诱导（Tuyaerts et al ，2007）。由于外周血DC 含量不到1％，脐带血和骨 髓中CD34＋ 细胞仅有1％左右（Jeras Bergant & Repnik ，2005），而外周血中CD14＋ 单核细胞达15％左右（Campbell-AnsonKentor & Radvanyi 2008）， 所以通常选择CD14＋ 单核细胞为前体，按“6＋2”传统法，经过分化和活化两个阶段诱导DC （standard DC ）。即将贴壁收集的CD14＋ 单核细胞，用分化因子诱导5－7天得到具有抗原摄取能力的不成熟DC （immature DC, iDC ），再用活化因子刺激2－3天得
小鼠外周血单个核细胞分离_纯化_徐太哲
小鼠外周血单个核细胞分离、纯化① 徐太哲1，李丽2，王长山2 （1．佳木斯市红十字医院，黑龙江佳木斯154003；2．佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007） 摘要：目的：探讨小鼠外周血单个核细胞（PBMC）最佳分离条件，提高细胞获得率与纯度，以便后续分子生物学实验。方法：小鼠摘除眼球取血，设置离心力、离心时间、实验环境温度等梯度优化，分别采用EDTA－K2、肝素、枸橼酸钠抗凝，Ficoll 密度梯度离心法分离单个核细胞，直接进行贴壁培养和分析获得率、纯度，计数存活率。结果：Ficoll密度梯度离心法经条件优化后分离的PBMC纯度可达85%，细胞获得率最高可达80%以上，活细胞百分率在92%以上。结论：Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC，对后续分子生物学实验无影响。 关键词：小鼠；Ficoll密度梯度离心；PBMC 中图分类号：Ｒ446．11+3文献标识码：A文章编号：1008－0104（2016）04－0010－02 外周血单个核细胞（Peripheral blood mononucle-ar cells，PBMCs）包括淋巴细胞和单核细胞。是免疫系统的重要组成，是研究免疫老化和衰老的主要依据。研究T、B淋巴细胞首要分离外周血单个核细胞，主要的分离方法是Ficoll－hypaque密度梯度离心法，因血液中各组成成分的沉降系数存在差异，而得以分离［1］。离心后，单个核细胞因与分离液密度相当，集中在血浆层和分层液的界面上，呈白雾层，吸取该层细胞经洗涤离心即获得PBMC。PBMC分离是分子生物学试验常用的技术，其效果直接影响PCＲ等后续试验结果。实验对象小鼠因体重小，体内血液量少，Ficoll密度梯度离心法正适用这样少量血液的分离，本文探讨小鼠外周血单个核细胞的分离最佳条件。 1材料和方法 1．1材料与分组 BALB/c小鼠18只，5 6月龄，体重23 25g，雌雄不限；小鼠外周血单核细胞分离液试剂（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）。 1．2方法 1．2．1取血与离心 摘除眼球取血：抓取小鼠，侧卧位，食指按压眼部皮肤致眼球突出。眼科弯镊迅速摘除眼球，倒立鼠，接取滴流血液。采血完毕纱布压迫止血［2］。每次采血量0．7 1mL。按乙二胺四乙酸盐（EDTA－K2）抗凝、肝素抗凝、枸橼酸钠抗凝，将抗凝血标本分为3个实验组，每组6例，相互对照［3］。 Ficoll密度梯度离心：首先取抗凝血与ＲP-MI1640培养液等体积混匀，再加相当于抗凝血2倍体积的淋巴细胞分离液，于400 600?g离心20 30min，谨慎吸取单核细胞层，ＲPMI1640培养液洗两遍备用［4 7］。 因细胞获得率与纯度关系到实验效果，一般根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，其离心时间越长，最终目的是达到最佳分离效果，对于小鼠本实验依据离心力、离心时间等设置优化梯度，因细胞获得率的高低与室温还有关，室温设置3个优化梯度［8］。 1．2．2PBMC的差异贴壁法纯化 将获取的PBMC计数后，用单核细胞完全培养基以4?106个/mL的密度重悬细胞，将细胞铺于24孔培养板，每孔2?106细胞，放于37?5%CO2培养箱中进行贴壁培养。2 4h内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞），吸去培养液上清，用ＲP-MI1640培养液轻轻洗涤培养孔3次，去除非贴壁细胞。收集贴壁细胞即获得贴壁法纯化的PBMC。1．2．3PBMCs纯度 收集贴壁细胞，用含有10%小牛血清的ＲP-MI1640重悬后，涂片进行瑞氏（美蓝－伊红Y）染料，计数100个细胞，计算单个核细胞纯度，单个核细胞纯度=（淋巴细胞数+单核细胞数）/总细胞数?100%。 1．2．4计数PBMCs 洗涤1．2．2获得的PBMCs2次，即加适量PBS 或ＲPMI1640培养液、混匀、600g离心5min弃上清，重复2次。加PBS悬浮细胞，台盼蓝染液染色，死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。倒置显微镜10?物镜下计数200个PBMCs活细胞百分率和细胞总数（存活率=活细胞数/总细胞数?100%）。1．2．5统计学方法 采用SPSS13．0软件统计分析。数据采用珋x?s 表示，组间数据采用t检验，组内数据采用单因素方 · 01 ·黑龙江医药科学2016年8月第39卷第4期 ①基金项目：1．黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划，编号：1253G057；2．佳木斯大学自然科学基础研究类重点项目，编号： Sjz2012－11。 作者简介：徐太哲（1967 ）男，吉林吉林人，本科，主治医师。 通讯作者：王长山（1977 ）男，黑龙江佳木斯人，博士，副教授，硕士研究生导师。E－mail：wcs0451@163．com。