小鼠外周血单个核细胞分离_纯化_徐太哲
小鼠外周血单个核细胞分离、纯化①
徐太哲1，李丽2，王长山2
（1．佳木斯市红十字医院，黑龙江佳木斯154003；2．佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007）
摘要：目的：探讨小鼠外周血单个核细胞（PBMC）最佳分离条件，提高细胞获得率与纯度，以便后续分子生物学实验。方法：小鼠摘除眼球取血，设置离心力、离心时间、实验环境温度等梯度优化，分别采用EDTA－K2、肝素、枸橼酸钠抗凝，Ficoll 密度梯度离心法分离单个核细胞，直接进行贴壁培养和分析获得率、纯度，计数存活率。结果：Ficoll密度梯度离心法经条件优化后分离的PBMC纯度可达85%，细胞获得率最高可达80%以上，活细胞百分率在92%以上。结论：Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC，对后续分子生物学实验无影响。
关键词：小鼠；Ficoll密度梯度离心；PBMC
中图分类号：Ｒ446．11+3文献标识码：A文章编号：1008－0104（2016）04－0010－02
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononucle-ar cells，PBMCs）包括淋巴细胞和单核细胞。是免疫系统的重要组成，是研究免疫老化和衰老的主要依据。研究T、B淋巴细胞首要分离外周血单个核细胞，主要的分离方法是Ficoll－hypaque密度梯度离心法，因血液中各组成成分的沉降系数存在差异，而得以分离［1］。离心后，单个核细胞因与分离液密度相当，集中在血浆层和分层液的界面上，呈白雾层，吸取该层细胞经洗涤离心即获得PBMC。PBMC分离是分子生物学试验常用的技术，其效果直接影响PCＲ等后续试验结果。实验对象小鼠因体重小，体内血液量少，Ficoll密度梯度离心法正适用这样少量血液的分离，本文探讨小鼠外周血单个核细胞的分离最佳条件。
1材料和方法
1．1材料与分组
BALB/c小鼠18只，5 6月龄，体重23 25g，雌雄不限；小鼠外周血单核细胞分离液试剂（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）。
1．2方法
1．2．1取血与离心
摘除眼球取血：抓取小鼠，侧卧位，食指按压眼部皮肤致眼球突出。眼科弯镊迅速摘除眼球，倒立鼠，接取滴流血液。采血完毕纱布压迫止血［2］。每次采血量0．7 1mL。按乙二胺四乙酸盐（EDTA－K2）抗凝、肝素抗凝、枸橼酸钠抗凝，将抗凝血标本分为3个实验组，每组6例，相互对照［3］。
Ficoll密度梯度离心：首先取抗凝血与ＲP-MI1640培养液等体积混匀，再加相当于抗凝血2倍体积的淋巴细胞分离液，于400 600?g离心20 30min，谨慎吸取单核细胞层，ＲPMI1640培养液洗两遍备用［4 7］。
因细胞获得率与纯度关系到实验效果，一般根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，其离心时间越长，最终目的是达到最佳分离效果，对于小鼠本实验依据离心力、离心时间等设置优化梯度，因细胞获得率的高低与室温还有关，室温设置3个优化梯度［8］。
1．2．2PBMC的差异贴壁法纯化
将获取的PBMC计数后，用单核细胞完全培养基以4?106个/mL的密度重悬细胞，将细胞铺于24孔培养板，每孔2?106细胞，放于37?5%CO2培养箱中进行贴壁培养。2 4h内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞），吸去培养液上清，用ＲP-MI1640培养液轻轻洗涤培养孔3次，去除非贴壁细胞。收集贴壁细胞即获得贴壁法纯化的PBMC。1．2．3PBMCs纯度
收集贴壁细胞，用含有10%小牛血清的ＲP-MI1640重悬后，涂片进行瑞氏（美蓝－伊红Y）染料，计数100个细胞，计算单个核细胞纯度，单个核细胞纯度=（淋巴细胞数+单核细胞数）/总细胞数?100%。
1．2．4计数PBMCs
洗涤1．2．2获得的PBMCs2次，即加适量PBS 或ＲPMI1640培养液、混匀、600g离心5min弃上清，重复2次。加PBS悬浮细胞，台盼蓝染液染色，死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。倒置显微镜10?物镜下计数200个PBMCs活细胞百分率和细胞总数（存活率=活细胞数/总细胞数?100%）。1．2．5统计学方法
采用SPSS13．0软件统计分析。数据采用珋x?s 表示，组间数据采用t检验，组内数据采用单因素方
·
01
·黑龙江医药科学2016年8月第39卷第4期
①基金项目：1．黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划，编号：1253G057；2．佳木斯大学自然科学基础研究类重点项目，编号：
Sjz2012－11。
作者简介：徐太哲（1967 ）男，吉林吉林人，本科，主治医师。
通讯作者：王长山（1977 ）男，黑龙江佳木斯人，博士，副教授，硕士研究生导师。E－mail：wcs0451@163．com。
差分析（one－way ANOVA），P＜0．05差异具有显著意义。
2结果
2．1抗凝剂分离的PBMC细胞获得率、纯度、存活率PBMC获得率：EDTA－K2组与肝素组比较差异显著（P＜0．05），EDTA－K2组获得率较高，而枸橼酸钠组与肝素组获得率比较，差异不显著，无统计学意义（P＞0．05）。PBMC纯度：EDTA－K2组与肝素组比较差异显著（P＜0．05），肝素组PBMC 纯度较高，而枸橼酸钠组与EDTA－K2组比较，纯度则差异不显著，无统计学意义（P＞0．05）。PBMC 存活率：EDTA－K2组、肝素组和枸橼酸钠组比较，细胞存活率差异不显著，无统计学意义（P＞0．05），见表1。
表1不同抗凝剂分离PBMC获得率、纯度、存活率（珋x?s，n=6）
组别分离前（?106个/mL）分离后（?106个/mL）PBMC获得率（%）PBMC纯度（%）PBMC存活率（%）肝素1．25?0．210．85?0．2068．47?12．7785．15?12．27*95．24?5．82 EDTA－K21．22?0．121．01?0．1882．42?6．65*69．48?15．4692．35?4．45枸橼酸钠1．20?0．160．88?0．1772．53?4．9564．92?18．1693，68?3．97注：*P＜0．05。
2．2不同离心力、离心时间的PBMC细胞获得率
在相同离心时间不同的离心力下，500g离心力
下效果好于400g和600g；在相同离心力下时间越
长收集的PBMCs细胞获得率越高，但不同时间下差
异不显著，无统计学意义（P＞0．05）。见表2。
表2不同离心力、离心时间的PBMC获得率
（珋x?s，n=6，%）
离心力
时间
20min25min30min
400?g70．67?1．4672．05?1．4872．13?1．61
500?g87．31?1．9589．90?1．3890．65?1．79
600?g77．46?2．2180．78?1．9376．78?1．28
2．3不同环境温度下PBMC获得率
比较20?、25?和30?三个环境温度下PBMC 获得率，如表3可知，环境温度20?时PBMC获得率最高，25?次之和30?最低，环境温度30?PBMC 获得率较20?差异显著（P＜0．05）。20?与25?下差异不显著，无统计学意义（P＞0．05）。见表3。
表3不同环境温度下PBMC获得率（珋x?s，n=6）温度20?25?30?
PBMC（%）85．05?7．3580．78?9．3558．90?11．27*
注：*P＜0．05。
3讨论
分离PBMC是一项实验和临床时常要做的工作，比如外周血单个核细胞培养的上清液中细胞因子等对基础医学和临床疾病有一定实用价值［9 14］。传统方法采用Ficoll－hypaque密度梯度离心，小鼠外周血单核细胞分离液比重为1．080，因血液中各组成成分的沉降系数存在差异Ficoll在一定离心力的作用下离心时，血液中各组成成分将按密度的梯度重新聚集［15］。密度较低的血小板和血浆悬于分层液上部；密度较大的红细胞与粒细胞沉于分层液下部；由于PBMC密度稍低于分层液，则位于分层液界面上，小心吸取该层即可获得PBMC。该法操作需将抗凝血作适当稀释，比较适用于小鼠等血液量少的分离。特别说明，单核细胞分离液，在分离人PBMC时，其比重为1．077；而分离小鼠单个核细胞时比重为1．080。用本法分离PBMC，经条件优化后纯度可达85%，细胞获得率最高可达80%以上，活细胞百分率在92%以上。
PBMC的差异贴壁法纯化时，收集2 4h内贴壁贴壁细胞为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞），而10 24h内贴壁的细胞为内皮细胞、内皮祖细胞、干细胞，不贴壁的则为淋巴细胞［16］。总之，EDTA－K2组PBMC获得率较肝素组高，而肝素组PBMCs纯度较高，PBMC存活率三组细胞存活率差异不显著。另外据报道，枸橼酸钠对细胞损伤小些。环境温度在30?PBMC获得率较20?差异显著，超过25?时会影响细胞获得率。综上所述，再考虑到细胞纯度、细胞回收率、细胞存活率以及操作的难易等因素，我们认为Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC，对后续分子生物学实验无影响。
参考文献：
［1］张素华，林丹丹，张美娟，等．Ficoll密度梯度离心法分离猪外周血单个核细胞条件的探讨［J］．中国血吸虫病防治杂志，2007，19（3）：192-195
［2］邓娜，蔺晓源，蔡光先．实验动物眼球取血的中医理论探讨［J］．光明中医，2014，29（1）：4-5
［3］王翠华，梁庆久．几种抗凝血剂抗凝效果的对比试验［J］．四川畜牧兽医，1997，（2）：21-22
［4］韩亚萍，刘源，章莉莉，等．不同方法分离外周血单个核细胞对树突状细胞增殖的影响［J］．放射免疫学杂志，2004，17（4）：315-316
［5］罗利琼，陈诚华，张军．长期培养外周血单个核细胞的简易分离纯化方法［J］．新乡医学院学报，2013，30（4）：249-250
［6］胡永波，展群岭，刘海朋，等．动物外周血单个核细胞分离方法探讨［J］．世界科技研究与发展，2010，32（6）：835-839
［7］樊卫平，宋玉靖，郝颜琴，等．简易外周血单个核细胞分离方法的探索［J］．山西医科大学学报，2010，41（3）：274-276
［8］蔡敏敏，顾晓琼，高飞，等．分离外周血单个核细胞的条件优化［J］．国际检验医学杂志，2016，37（1）：1-3
［9］刘亚波，孙玉鸿，王芳．HBV慢性感染者外周血单个核细胞IL －2、sIL－2Ｒ的表达及临床意义［J］．黑龙江医药科学，2007，30（6）：60
［10］田黎明，代建华，郝翠翠．ITP患者外周血单个核细胞中TIM－3和IL－17的表达及意义［J］．黑龙江医药科学，2011，34（1）：62-63
（下转第13页）
表1术后8个月肘关节活动度（珋x?s）
组别n屈曲度旋前角度旋后角度伸展角度实验组18136．12?0．48*70．10?0．54*81．29?0．38*－3．84?0．58*对照组15108．98?0．5262．36?0．3255．68?0．29－10．65?0．35*与T型钢板组比较*P＜0．05。
表2两组肘关节功能评分（珋x?s）
组别n功能评分稳定性评分疼痛评分力量评分实验组1832．24?2．26*4．21?0．98*26．54?0．23*15．78?0．36*对照组1523．68?3．453．24?0．8730．32?0．2413．67?0．20与T型钢板组比较*P＜0．05。
3讨论
桡骨小头骨折是临床上最为常见的关节内骨折，治疗桡骨小头的方案较多，但如何选择最为合适的治疗方法现今尚存在争议。桡骨小头凹的周围有一层软骨包裹，构成环状软骨面，与肱骨小头形成肱桡关节。桡骨环状韧带环绕桡骨小头的环状关节面并附着在尺骨，所以环状韧带对桡骨与尺骨的稳定性起到很大的作用，一旦环状韧带损伤或破损，肘关节的稳定性及功能遭到一定的破坏，故桡骨小头骨折的治疗目的就是要使骨折解剖复位的同时要保证良好的肘关节的功能，使肘关节有良好的活动度、良好的稳定性、周围软组织肌肉要有良好的力量基础［7，8］；患者一般活动自如，并无疼痛。当然桡骨小头骨折的治疗要根据骨折的类型来决定，同时也要考虑肘关节周围软组织损伤的情况来决定。对于MasonII、III型桡骨小头骨折，检查患者如果没有肘关节副韧带损伤的情况下，选择切开复位内固定手术治疗的方法，直型掌骨钢板塑形成环状钢板固定骨折，保留环状韧带，通过研究表明，此方法可以取得比常规切开环状韧带T型钢板内固定手术更良好的手术疗效。术后可获得更好的肘关节功能，稳定性更高，肘关节周围肌肉力量强度大。当然对于MasonIII型桡骨小头骨折并伴有严重副韧带损伤或者合并尺骨冠突、鹰嘴骨折及严重的粉碎骨折，无法复位满意的骨折，则应该选择桡骨小头置换或桡骨小头切除手术。
参考文献：
［1］李向东，冯万文，杨广志，等．MasonⅢ型桡骨头骨折的内固定治疗［J］．黑龙江医药科学，2015，38（6）：11-12
［2］李长德，袁学强，张亚华，等．双钢板Y型钢板治疗成人肱骨髁上骨折36例临床应用［J］．黑龙江医药科学，2011，34（1）：77
［3］李长德，解金鼎，等．三种不同内固定方法治疗老年肱骨近端骨折的临床效果分析［J］．黑龙江医药科学，2010，33（3）：17
［4］Nikolaos T，Ｒoidis MD，Stamatios A，et al．Current conceptsan dcon-troversies in the management of radial headfractures［J］．Orthope-dics，2009，29：904-916
［5］Masayoshi Ikeda，MD PhD，Kazuhim Sugiyama MD，et al．Comminu-ted fractures of theＲadial Head：Comparison ofＲesection and Inter-nal Fixation［J］．JBJS，2009，87：76-85
［6］张力丹，蒋协远，王满宜，等．桡骨头骨折的手术内固定治疗［J］．中华创伤骨科杂志，2002，4（3）：247-250
［7］Shepard MF，Markolf KL，Dunbar AM．Effects of radial head excision and distal radial shortening on load－sharing in eadaver forearms ［J］．J Bone Joint Surg（AM），2001，83：92-99
［8］Sanchez－Sotelo J，Ｒomanillos O，Garay EG．Ｒesults of acute excision of the radial head in elbow radial head fracture－dislocations［J］．J Orthop T rauma，2000，14（5）：354-357
［9］Morrey BF．Complex instability of the elbow［J］．Instr Course Lect，1998，47：157-160
（收稿日期：2016－03－28）
（上接第11页）
［11］王建杰，张涛，罗文哲，等．川芎嗪对类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞IL－12mＲNA表达的影响［J］．黑龙江医药科学，2005，28（2）：18-19
［12］张富运，杨建华，王蕾，等．骨髓单个核细胞对大鼠脊髓损伤后行为功能影响的研究［J］．黑龙江医药科学，2013，36（6）：44-46
［13］赵中男，杨建华，王莹，等．骨髓单个核细胞移植对脊髓半横断大鼠损伤组织中髓鞘碱性蛋白表达的影响［J］．黑龙江医药科学，2014，37（1）：43-45
［14］季庆辉，申福国，孔维丽，等．骨髓单个核细胞移植对大鼠脊髓
全横断损伤后髓鞘碱性蛋白表达影响［J］．黑龙江医药科学，2015，38（1）：66-68
［15］肖海波，段德溥．体外诱导小鼠骨髓单个核细胞向内皮分化的实验研究［J］．南通大学学报：医学版，2006，26（5）：327-330［16］周龙，陈曦，罗宗平，等．C57BL/6小鼠骨髓单核细胞分离、培养、纯化及向破骨细胞的分化［J］．中国组织工程研究，2015（6）：940-944
（收稿日期：2016－03－10）
外周血单个核细胞的分离(优质参考)
实验二十四外周血单个核细胞的分离 (Separation of mononuclear cell in peripheral blood) 免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。 【实验原理】 血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。 【主要试剂和器材】 1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。 2.5g/L台盼蓝。 3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。 4.Hank,s液。 5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。 6.水平离心机、显微镜。 【操作方法】 1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Hank,s液混匀。 2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。 3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。 4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。 5. 用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。 6.加入4倍量以上的Hank,s液，充分混匀，1000r／min离心l0min。离心后倾弃上清液，再用Hank,s液洗2次。 7.用含10%～20%灭活小牛血清的Hank,s液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。【结果判断】 【注意事项】 1.将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。 2.温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(18～25℃)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细胞活性。
人外周血单核细胞分离技术
人外周血单核细胞分离 1.抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min 离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10?12.5 mL 。 2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A中的细胞中加入Hank s液（不含Ca2+、Mg 2+, pH 7.2 ?7.6）体积比仍未1:1 , 混匀，制成细胞悬液。 B:无菌抗凝血与Hank s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。 另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处 将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液 分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。 管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台 单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞 沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的 2 / 3。混匀后离心1500r/mi n 离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。 注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。 再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min 离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank s液（或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640 液3?4 mL）重新混悬细胞37 C、5% C02孵育箱中培养2?3 h 后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（聚蔗糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤离心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%～95%，细胞获得率可达80%以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。 ●人外周血单核细胞（PBMC）分离及培养 PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。 Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 ●工具／原料 全血（以10ml为例） 无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水 蔗糖溶液（FicollPague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02) RPMI 1640培养基（Invitrogen） 胎牛血清（FBS）（GIBCO） 双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO) 二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定 医学细胞生物学设计型实验设计报告 班级10级k-7班 评分 实验项目： 细胞核的分离与鉴定 实验原理：1、细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内其沉降速度也不同。所以，用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。 2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在特定的条下进行离心分离，然后分析鉴定。 3、匀浆是指在低温条下，将组织放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。 实验步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使其学业尽量流出。 2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。 3、匀浆：加油8ml预冷的0.25mol/L蔗糖0.003mol/L绿化高永夜于烧杯中，尽量剪碎肝组织，将剪碎的刚组织倒入玻璃匀
浆器，是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿（如冰盘）。左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆，直至看不到明显的组织块。 4、过滤： 用8层纱布（先用少量生理盐水或蔗糖液润湿纱布）过滤匀浆液于离心管中。 5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心 15min，取上清液于另一离心管中。 6、涂片：取上清液制一张涂片（涂片1）。将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液，另制一张涂片（涂片2），自然干燥。 7、染色：分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液 ，染色5到7分钟（即滴染）。 8、洗涤：冲去染液，晾干。 9、镜检：结合实验结果的描述，镜下观察分析。 注意事项：1.操作规范，防止试剂污染。 2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 3.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。 预期结果：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。 实验用品：材料：小白鼠肝脏。
人外周血单核细胞分离液使用说明
人外周血单核细胞分离液使用说明 产品内容： 试剂Ａ200mL 试剂D200mL 样本稀释液（赠品）200mL 清洗液（赠品）200mL 保存：18℃-25℃保存，有效期两年。人外周血单核细胞分离液易感染细菌，需无菌条件下操作。无菌条件下操作，启封后常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 操作步骤： 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。首先取抗凝血按体积比1:1的比例加全血及组织稀释液混匀，根据稀释后的样本量大小，分以下两种情况： 情况A:稀释后血液样本小于5mL时，实验方法如下： 1.取一支15ml离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（体积比为3:2，试剂总量与稀释后的血液样本量相等。如稀释后的血液样本为5ml，则先后加入试剂A3ml、试剂D2ml），制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。 2.用吸管小心吸取稀释后的血液样本加于分离液液面上，400-550g，离心20-30min（注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。 3.离心后，此时离心管中由上至下分为五层。第一层为稀释液层。第二层为透明试剂D液层。第三层为环状乳白色单核细胞层。第四层为透明试剂A液层。第五层为红细胞层。 4.用吸管小心吸取第二层试剂D层和第三层乳白色细胞层到另一15ml离心管中，往所得离
心管中加入10ml清洗液，混匀细胞。 5.250g，离心10min。 6.弃上清。 7.用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。 8.250g，离心10min。 9.重复6、7、8，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 10.差异贴壁法纯化细胞 （1）用单核细胞无血清培养基或单核细胞完全培养基以1.5-3×106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。（2）2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。 （3）10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。 （4）不贴壁的为淋巴细胞。 注： a)无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加10%自体血浆或2-8%的胎牛血清。 b)完全培养基中含2-20%胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。 c)由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成本相对较低。如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴性分选。 情况B:血液样本大于等于5mL时，实验方法如下： 1.取一支适当的离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（试剂A与试剂D体积比为5:3，试剂总量与稀释后的样本量相等），制成梯度界面。 2.将经稀释后的血液样本小心加于分离液之液面上，450-650g（最大离心力可至1000g），
单个核细胞分离.
Separation of Mononuclear Cells from Whole Peripheral Blood 外周血单个核细胞分离 Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation 聚蔗糖—泛影葡胺分层液密度梯度离心法【Materials】 (1)Lymphocyte Separation Medium: specific gravity 1.077±0.001g/L 淋巴细胞分层液（比重为1.077±0.001g/L） (2) 2％trypan blue solution 2％台盼蓝染液 (3) Hank’s balanced salt solution (HBSS) or RPMI-1640 medium Hank’s液或者RPMI-1640培养基 【Methods】 (1) Drawing 2ml blood from main vein and mixing with 0.1 ml Heparin solution in a tube. 采集静脉血2ml注入盛有0.1ml肝素的试管中，混匀。 (2) Dilute the whole blood with an equal volume of Hank’s balanced salt solution (HBSS) 加入等体积HBSS或PBS等倍稀释血液。
(3) Pipette 2ml lymphocyte separation medium into a centrifuge tube. Then, add the diluted blood sample carefully by flowing along the side of the tube on the LSM. The interface must be clear. 吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。 (4) Centrifugation at 2000rpm for 20 min at room temperature. Four distinct layers are found from top to bottom: 室温2000r／min离心20min。管内可分为以下四层：
各种动物骨髓单核细胞分离液试剂盒
各种动物骨髓单核细胞分离液试剂盒 规格：200ml/kit 保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 试剂盒组成： 试剂A200mL 试剂D200mL 全血及组织稀释液200mL 细胞洗涤液200mL 操作步骤： 1.制备骨髓的单细胞悬液。 2.取一支无菌离心管，先加入试剂A，再加入试剂D，使两者形成梯度界面（试剂A：试剂D的体积比为3：2，如细胞悬液的体积小于5ml，则先后加入3ml试剂A和2ml试剂D；如细胞悬液的体积大于5ml，试剂总量与细胞悬液量相等），两种试剂的分层一定要清晰。 3.将细胞悬液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面） 4.室温，水平转子500~800g，离心20~30min（样本的体积越大所需的离 心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需自行摸索，离心转速最大不 超过1000g）。 5.离心后将出现明显的分层：第一层为稀释液层；第二层为白色单核细 胞层；第三层为透明试剂D液层；第四层为半透明试剂A液层；第五层为红细胞层（如图示）。 6.小心吸取第二层乳白色细胞层和第三层试剂D层到另一无菌的15ml离心管中，加入10mL细胞洗涤液或PBS，颠倒混匀，250g，离心10min。 7.弃上清，5mL的细胞清洗液或PBS重悬细胞，250g，离心10min。 稀释液 单核细胞层 试剂D 试剂A 红细胞层分层示意图
8.重复步骤7 9.弃上清，细胞重悬备用。 10.差异贴壁法纯化细胞：用单核细胞培养基以106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于细胞板或细胞瓶中，置于细胞培养箱中进行贴壁培养。 1)2~4h内贴壁的为单核细胞。 2)10~24h内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。 3)不贴壁的为淋巴细胞。 根据不同细胞的贴壁时间存在差异，以达到简单纯化单核细胞的目的。此法成本低，操作简便。如需获得高纯度的目的细胞则需选用免疫磁珠分选或者是应用流式技术分选细胞。 骨髓单细胞悬液的制备方法 小动物骨髓的采集： 1.处死动物，无菌提取股骨和胫骨，剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔（注意尽可能少的剪走骨髓腔）。 2.取1ml的无菌注射器，吸取少量的含有10%标准胎牛血清的稀释液或者是含有血清的培养基，冲洗骨髓腔以获得骨髓。 3.最终制备成2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。 大动物骨髓的采集： 大动物骨髓的采集可采取活体穿刺方法：先将动物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮肤，然后估计好皮肤到骨髓的距离，把骨髓穿刺针的长度固定好。操作人员用左手把穿刺点周围的皮肤绷紧，右手将穿刺针在穿刺点垂直刺入，轻轻左右旋转将穿刺针钻入，当穿刺针进入骨髓腔时常有落空感。连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时即停止抽吸。用含10%标准胎牛血清的稀释液调整细胞浓度为2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。 常用的骨髓穿刺点： 股骨：穿刺部位在股骨内侧面，靠下端的凹面处； 胸骨：穿刺部位是胸骨体与胸骨柄连接处；
细胞核的分离
实验四细胞核的分离 [实验目的] 1. 为了研究细胞核及其组分。 2. 定量分析细胞核的生化组分及其它一些特殊成分。 [实验原理] 1956年由chauveau等人提出，用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的密度较大，在高密度介质中，在高速离心条件下沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开来的目的。chauveau 的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/l蔗糖溶液中匀浆，然后高速离心40 000g 1小时，细胞核沉淀到底部，线粒体和完整细胞，包括红血球漂浮在液面，通过一步操作即可分离得到细胞核。其后又有不少研究者对此方法进行了改进，例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质的渗透压；选择介质的ph以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性，防止聚集，维持恒定的ph，就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单，能得到较高纯度的细胞核，也已被广泛采用，但实验需要高速离心机，这在一般实验室不能进行，此方法要用高浓度的蔗糖，如果要分离大量的细胞核，也很不经济。 目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核，在柠檬酸介质中分离细胞核可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液的ph值，这样可以减少细胞核的破碎率，并能分离得到较高分子质量的核酸，可能是由于核糖核酸（一种酸溶性蛋白）被柠檬酸除去，以及二价阳离子被柠檬酸螯合所致。 柠檬酸的浓度对分离细胞核的质量有较大影响。通常在较低的ph值时，可以得到较高的细胞核。但在过酸条件下，可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞内核酸，一般常在ph值为4，甚至在ph值为2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核的酶，则需要较温和的条件，此时可以在ph值为6～6.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。
人外周血单个核细胞分离液说明书
分离后分离前 水平离心血浆层单个核细胞层分离液层 红细胞层人外周血单个核细胞分离液说明书 货号：P9010/P9011 规格：200mL 产品简介： 本产品是一种用于分离人外周血单个核细胞的无菌、低内毒素水平的密度梯度分离液。外周血中单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，为1.090g/mL左右，淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090g/mL，血小板为1.030~1.035g/mL。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 产品指标： 密度 1.077±0.001g/mL 渗透压 290~350mOsm/kg H2O 无菌 0.1μm 滤膜过滤保存条件： 本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 操作步骤： 1.取新鲜抗凝全血（EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝 均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血 及组织稀释液或者PBS稀释全血。 2.在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体 积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL， 加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过 离心管的三分之二，否则会影响分离效果）， 将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意
保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。） 3.室温，水平转子500~1000g，离心20~30min（血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳 的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g）。 4.离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白 膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。 5.小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞。250g，离心 10min。 6.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。 7.重复步骤6 8.弃上清，细胞重悬备用。 注意事项： A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物 污染。 B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较 低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。 C.血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2h以内），为保持单个核细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。 D.稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降 低细胞得率及纯度。 E.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。 F.血液样本的粘稠度或者是温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳 的分离条件。 G.吸取过多的单个核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增 加；吸取过多的血浆层可能会导致单个核细胞中血浆蛋白及血小板污染。
单个核细胞的分离
单个核细胞的分离：（密度离心法） （一）外周血中的单个核细胞的分离： 1. 眼眶静脉丛采血：（无菌条件下操作） 采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。刺入浓度，小鼠约2～3mm。当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。左右两眼轮换更好。体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml。摘除眼球取血： 左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.6-1mL。 2. 分离PBMC操作步骤： 1）用抗凝管（内含抗凝液0.2ml）收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积（1:1）稀释血液。 或用肝素溶液：生理盐水将肝素配成125-250U/mL的无菌液，4度保存。每1mL全血加0.1mL 肝素溶液。 2）取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。 3）将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。 （稀释血液与分层液体积比例约为2:1）。 （或：将吸管嘴插入离心管底部，将分层液缓慢加入稀释血液的底部。） 4）18-20度，水平离心机以2000r/min离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。（离心温度在18-20度） 5）用毛细血管（或1ml注射器）轻轻插入白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一离心管中。 （或：先吸去最上层的血浆，然后用另一只毛细吸管收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC，避免吸到过多的分层液和血浆。） 6）加入５ml的（不含Ca2+，Mg2+）的Hank's液或RPMI1640洗涤2次，混匀，依次以1500r/min、1000r/min离心10min，吸弃上清。 （*低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板） 7）末次离心后，弃上清，用含有10％小牛血清的RPMI1640 2ml，重悬细胞。 8) 细胞计数：取20ul细胞悬液加20ul 0.4%台盼兰染液，3-5分钟后取样进行计数。 活细胞不着色，折光强；死细胞被然成蓝色，体积略膨大。计数200个细胞，计算活细胞百分率。 单个核细胞浓度(细胞数／1ml细胞悬液)＝(4个大方格内细胞总数/4)310４32(稀释倍数) 活细胞百分率＝(活细胞数/总细胞数)3100％
细胞核的分离与鉴定设计型实验设计报告_(2)
实验项目：细胞核的分离与鉴定 实验原理： 分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同，因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级分离出来。本实验就采用差速离心法。 细胞核的鉴定，因为细胞核中主要含DNA，而DNA是碱性蛋白，可用甲苯胺蓝染液可使细胞核内碱性蛋白呈现出来。 实验器材：显微镜，普通离心机，离心管，滴管，玻璃漏斗，纱布，烧杯，解剖剪，镊子，玻璃匀浆器，载玻片/盖玻片，染色盘架，小白鼠肝脏。 实验试剂：甲苯胺蓝染液，蒸馏水，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，生理盐水 实验步骤： （1）、用颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速解开其腹腔取出肝脏，去出结缔组织，剪成小块，尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中。反复洗涤尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 （2）、将湿重为1g的肝组织放入烧杯中，用量筒取8ml预冷的0.25mol/L 蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于烧杯中，尽量剪碎肝组织后全部加入。 （3）、将剪碎的肝组织导入匀浆管中，使匀浆器下端侵入盛有冰块的器血
中，左手持，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3-5次。用3层纱布过滤于匀浆管中，然后制备一张涂片①，自然干燥。 （4）、将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机以2500r/min离心15min,弃去上清液。 （5）、用6mol 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液悬浮沉淀物，以2500r/min离心15min 弃去上清液，将残留液体用气管吹成悬液，滴一滴于干净的载盖玻片上，制成涂片②，自然干燥。 （6）在①·②上滴加甲苯胺蓝染液，染色5-7min，洗涤干燥后镜检。 ⑺记录观察结果 注意事项： （1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。 （2）将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。 （3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太厚。 （4）染色后的洗涤要注意时间，不可过长，避免将染色洗去，观察不到细胞核。 （5）开腹取出肝后，用生理盐水反复冲洗，避免血细胞对食盐的影响。 预期结果： 在低、高倍镜下，可以观察到经.0.1%碱性固绿染色的小白鼠肝细胞的细胞核体被染成绿色。说明这是碱性蛋白，即细胞核已游离出来。 涂片在高倍镜下可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色、圆形、中央有
人外周血单核细胞分离技术
人外周血单核细胞分离 1. 抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10～12.5 mL。 2. 沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A 中的细胞中加入Hank′s液( 不含Ca2+、Mg2+, pH 7.2 ～7.6) 体积比仍未1:1，混匀，制成细胞悬液。 B: 无菌抗凝血与Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。 另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。 管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3. 单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2／3。混匀后离心1500r/min离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。 注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。 再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank′s液( 或含10%胎牛血清及25 mmol /L
实验设计-细胞核的提取与鉴定
医学细胞生物学设计型实验设计报告 姓名：李飘班级：K—10班学号：1020151004 评分 【实验项目】：动物细胞细胞核的分离与鉴定 【实验原理】：核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的 细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此,我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。 细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA，是碱性蛋白。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理,抽提掉核酸后，用碱性固绿溶液染色，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。 【实验步骤】： 1．细胞培养：将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上，使适宜的培养基中于37 ℃的条件下培养，使细胞固定在脱核塑料圆板上，脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径，使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。 2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后，加入0.1ug/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60h 滤纸，使细胞形成多个大小不同的核体。 3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml预热至37 ℃的细胞松弛素B溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后，再加入10ml37 ℃的CB溶液。 4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。 5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。 6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴加15%乙醇于涂片上，固定5min，室温晾干。 7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90 ℃的三氯醋酸溶液中处理20min，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。 8．染色：将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10～15min，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。 【注意事项】： 1．在离心管内加入的5ml细胞核松弛素B溶液要预热到37 ℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。 2．涂片在用三氯醋酸处理时，时间不宜过长或过短，过长会使核膜裂解，过短使抽提的核酸不够。 3．在染色时，时间一定要足够，否则染色不完全，得不到理想的实验结果。 4．因去掉胞质的核体贴附能力弱，因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。 【预期结果】：经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性 蛋白，即细胞核。
动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒使用说明
动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒使用说明 规格：3×200mL/kit 保存：动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 组成： 各种动物脾脏单个核细胞分离液200mL 全血及组织稀释液200mL 细胞洗涤液200mL 单个核细胞分离方法 1.制备脾脏的单细胞悬液。 2.取一支适当的离心管，加入与脾脏单细胞悬液等量的分离液（分离液最少不得少于3mL， 总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果）。 3.小心吸取单细胞悬液加于分离液液面上，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德 吸管吸取单细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。） 4.室温，500~900g，离心20~30min。（根据脾脏单细胞悬液的量确定离心条件，单细胞悬 液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件可以自行摸索，以达到最佳分离效果）。 5.离心后，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层为稀释液层；第二层为环状乳白色 单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。 6.用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层至另一洁净的15mL离心管中，向离心管
中加入10ml细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250g，离心10min。 7.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。 8.重复步骤7 9.弃上清，细胞重悬备用。 分层示意图 脾脏单细胞悬液的制备方法 脾脏研磨的方法： 1.无菌条件下摘取脾脏，撕去脾脏被膜，用眼科剪将脾脏剪成小块。 2.将尼龙筛网或者是细胞过滤筛放置于平皿上，加入少量全血及组织稀释液（保证脾脏及 获得的细胞处于液体环境中）。 3.将脾脏放置于筛网上，使用注射器活塞或者是无菌镊子来研磨脾脏（尽量控制研磨力度， 保持筛网悬空，避免在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡） 4.研磨完全后使用全血及组织稀释液冲洗筛网，收集细胞悬液，再经滤网过滤。
利用离心技术分离细胞核和叶绿体
密度梯度离心后的结果低倍镜下的叶绿体 高倍镜下的叶绿体 实验二利用离心技术分离细胞核和叶绿体 一、实验目的： 1. 了解常用的离心法； 2. 理解差速离?心法和速率区带离心法分离样品组分的原理； 3. 以分离细胞核和叶绿体为例,掌握离心的操作方法。 二、实验原理： ? 离心技术：是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的实验技术。?离心技术类型: 1.差速离心法 2.密度梯度离心法 ?等密度梯度离心： ①对象：常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。(此法一般应用于分离大小相 近，而密度差异较大的颗粒物质时) ②原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中， 颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相 等的位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长时间，它们再也不移 动了，形成一系列密度区。从而使不同浮力密度的物质得到分离。③等密度梯度离心一般常用CsCl、蔗糖、甘油等做介质。 ?速度梯度离心： ①对象: 纯化分离叶绿体和细胞核(主要用来分离密度相近，大小不同的物质) ②原理:根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,达到彼此分离的目的。 ②要求：1、样品溶液的密度必须小于悬浮介质层的最小密度； 2、样品颗粒的密度必须高于悬浮介质的最大密度； 3、离心时间十分重要 三、实验结果分析： 实验结果：
实验结果： 如图所示，叶绿体在混合液的梯度层中，形成一条带，聚集在密度梯度交界处；沉降系数较大的细胞组份则沉到离心管底部。 如图所示，叶绿体镜检为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒为基粒。 实验分析： 此实验最难的一点就是蔗糖溶液梯度的制备。要想制得清晰，平整的界面，需要将离心管放置于稳定的水平界面上；最重要的是，向下层溶液中加入上层溶液时，需要极小心、熟练地控制滴加的力度，并使枪头贴着离心管管壁，让液滴缓慢的流入，防止梯度层被破坏；除此之外，将配置好梯度层的的EP管放入离心机时要用试管架移动，而且离心时一定要两两平衡，之前要称量两个离心管使其相等。 四、思考问答： 本实验使用了哪两种离心方法，它们在分离样品时有何不同？ 答：使用了等密度梯度离心和速率区带离心。速率区带离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始离心速度较低，使较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍悬浮在上清液中。收集沉淀，再改用较高的离心速度离心悬浮液，使较小的颗粒沉降，多次重复此步骤，从而达到分离不同大小颗粒的目的；等密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。此种分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。
单核细胞、中性粒细胞分离方法及注意事项
单核细胞分离方法 将用等体积生理盐水稀释的抗凝血，加入塑料离心管中的Ficoll Hypaque分离液表面，以450 g离心25min收集单个核细胞，用10 小牛血清的RPMI一1640培养液悬浮细胞，置于6x 6 cm 玻璃培养皿中，在5 ％CO2 、37℃下孵育2 h，收集贴壁的单核细胞。用0.2乳白蛋白的RPMI-1 640培养液悬浮单核细胞，Wright 染色计数单核细胞>95％，调整细胞密度为4×10／ml。将细胞悬液加入24孔培养板中，在5 ％CO2，37℃下培养24 h，离心收集上清液，冻存于一70℃冰箱中备用。细胞培养前后台盼蓝染色法测定细胞存活率。 细胞分离中需要注意的几个问题 1.如果您要做细胞培养，记住实验中所用的试剂（分离液，洗涤液等）、器械等都要是无菌消毒的，并注意实验中的无菌操作。 2. 离心转速单位及时间：目前国外的文献报道基本上用g为单位，注意g和转速（r pm）的换算。 3.离心温度：有的要求室温，有的要求4摄氏度。实验的操作要求尽可能熟练，连贯。 4.在用Ficoll分离单个核细胞（PBMC）时，通常含有少量的红细胞，对于一般的实验影响不大，如果实验要求较高，可采取裂解液（有的需要无菌），并注意裂解时间控制，以免影响单个核细胞的活性。 5. 在用Percoll配不连续梯度时（一般用高渗NaCl），注意各成份体积的准确性，否则密度与预期的不一样，影响分离效果。 6.用全血离心效果比全血稀释后再离心效果差，稀释一般等体积稀释一倍。
7.分离液与样本的体积比：一般应小于1：2（即一般为1体积分离液，2体积样本，不宜超过2体积，小于2体积均可） 8.洗涤液的成分：不同文献报道不一，有的使用PBS，有的为Hank’s，KRP等，可自己选定。主要是离子浓度及成份的不同，有的含有Mg2+,Ca2+。 9. 细胞活性：0.2%台盼蓝染色3－5分钟，镜下观察计数死亡细胞（蓝染）。 中性粒细胞分离的方法 1、标准方法：Ficoll-泛影钠（Ficoll-Hypaque）密度梯度及红细胞裂解法 1）取一50ml聚乙烯管，无菌采集人外周静脉血，加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min，离心，室温。 2）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet-poor Pl asma, PPP）。 3）余下的沉降全血加入5ml6%Dextran (分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。4）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。 5）沉淀的细胞用8mlPPP-生理盐水（1：4）重悬，并移到15ml离心管中。 6）悬液细胞上面加入3mlFicoll-Hypaque（密度1.077），750gX5min，室温。7）吸取富含中性粒细胞和红细胞层，用0.155M NH4Cl重悬细胞，使红细胞裂解，然后中性粒细胞用含0.25%BSA Hanks平衡液（HBSA，无钙）洗2次，最终用H BSA（含钙）重悬。 8）用此法可得95%以上的中性粒细胞。 2、不连续的密度梯度血浆－Percoll离心法
细胞核与线粒体的分级分离
细胞核与线粒体的分级分离 一、原理 细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不 同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括 组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的 主要手段。 匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即 0.25mol／L 蔗糖一 0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。 分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将 浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大 小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯 的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。 分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。 二、细胞核的分离提取 (一)操作步骤 1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有 0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 2． 将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙 溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。 3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂 直插入管中， 上下转动研磨3～5次， 用3层纱布过滤匀浆液于离心管中， 然后制备一张涂片①， 做好标记， 自然干燥。 4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入 高速离心管中， 保存于有冰块的烧杯中， 待分离线粒体用； (2)同时涂一张上清液片②做好标记， 自然干燥； (3)余下的沉淀物进行下一步骤。 5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残 留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。 6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。 (二)结果 分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。 三、高速离心分离提取线粒体 (一)操作步骤 1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以 17000rpm 离心 20 分钟，弃上 清，留取沉淀物。 2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分 钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成 悬液(可用牙签)。 3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯 绿B染液盖上盖片染20分钟。 (二)结果 油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。