人外周血单核细胞(PBMC)分离及培养

PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。

Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

工具/原料：
全血 （以10ml为例）
无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)
RPMI 1640培养基 （Invitrogen）
胎牛血清（FBS）（GIBCO）
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒

方法/步骤：
①配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
②将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
③取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
④2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层；

⑤PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。
⑥加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；
⑦加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；
⑧细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。

注意事项
全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。