外周血单个核细胞的分离

实验二十四外周血单个核细胞的分离

(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)

免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细

胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque) 分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。

【实验原理】

血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll) 和泛

影葡胺(Hypaque)按一定比例混合制成，20C密度为 1.077 士0.001，单个核细胞包括淋巴细胞

和单核细胞，其密度为 1.050?1.077，而粒细胞和红细胞的密度为 1.080?1.110。将待分离的

细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与

粒细胞沉于管底。

【主要试剂和器材】

1. 聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077 士0.001。

2.5g/L 台盼蓝。

3.250U/ml肝素溶液用Hank's液配制。

4. Hank s 液。

5. 注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。

6. 水平离心机、显微镜。

【操作方法】

1. 抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Hank's液混匀。

2. 取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血

液与分层液的容积比例以2：1?3 ：1为宜。

3. 置水平离心机中，2000r/min 离心20min。

4. 离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、

血浆层(含血小板和破碎细胞)。

5. 用滴管直接吸岀单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。

6. 加入4倍量以上的Hank's液，充分混匀，1000r /min离心l0min。离心后倾弃上清液，再用Hank,s液洗2次。

7. 用含10%?20%灭活小牛血清的Hanks液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。

【结果判断】

【注意事项】

1. 将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。

2. 温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(18?25C)下进

行实验，分层液使用前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细

胞活性。

3. 分离时的转速与时间应根据不同样品作相应调整。离心速度在2000?2500r/min，离心时间为

15?20min，离心后若见白雾状细胞层中仍掺杂红细胞，应提高转速或延长离心时间，若淋巴细

胞丢失过多，则应适当降低转速或离心时间。

4. 分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。

5. 将细胞悬液叠加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果。

6. 充分冼涤分离后的单核细胞，可除去大部分混杂的血小板。

【应用与评价】

本方法操作简便、稳定。细胞回收率达80%?90%单个核细胞纯度可达95%淋巴细胞约占90%?95%细胞活力可达95%以上。但其中仍可混杂少量（约10%）其它细胞。

该方法是目前最理想、最常用分离淋巴细胞的手段，其制备的细胞（主要是淋巴细胞）悬液已能满

足许多细胞免疫试验要求，也可用于进一步制备T细胞、B细胞及单核细胞。故在细胞免疫试验

中有广泛应用，是细胞免疫检测中最基本的技术之一。

【思考题】

1. 为何常用密度为1.077 土0.001的分层液分离人单个核细胞？

2. 利用密度梯度离心法分离人单个细胞，为何要将血液样品进行适当稀释，并要叠加于分层液上?

外周血单个核细胞的分离一密度梯度离心法

一、原理

根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于

不同的分布位置。利用此原理可设计一定比重的液体界面，将外周血中各种不同比重的细胞通过

离心沉降而达到使其彼此分离的目的。已知人类淋巴细胞和单核细胞的比重大约在 1.075?1.090之间，而红细胞与粒细胞的比重均大于 1.090。因此，若用比重为 1.077 士0.001的分离液则可

通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集外周血单个核细胞。

二、器材与试剂

器材：

（1）水平式离心机（2）显微镜（3）血球计数板、血盖片（4）载玻片、盖玻片（5）定量

移液器、洗耳球（6）刻度离心管（7）试管、滴管、橡皮滴头（8）小滤纸、擦镜纸

试剂：

（1）抗凝全血（临时抽取）、40倍稀释的全血（计数用）（2）淋巴细胞分离液（市售，

比重：1.077 士0.001 ）（3）Hanks液（4）白细胞稀释液（5）0.5%锥兰生理盐水溶液

三、操作步骤

在已含1ml抗凝全血的试管内加入1ml Hanks液，混匀，然后用滴管将此稀释全血沿盛有

1ml淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。

将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm）20分钟。

用计数板在显微镜下计数40倍稀释的全血，计算岀其中的白细胞总数（/ml ）及单个核细胞总数（/ml ）。

离心后的外周血各成份在试管中的分布位置如下图：

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用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细胞），吸岀界面层细胞，移入刻度离心管内。

在该细胞收集管内（即刻度离心管）加入Hanks液，用滴管轻轻上下冲洗混匀，然后在离心（lOOOrpm）10分钟，弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，再用Hanks液洗涤2次。

用0.5ml Hanks液将沉淀细胞稀释，摇匀。

取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数，

计算岀白细胞总数（/ml ）及单个核细胞数（/ml ）。

检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一试管中充分混匀，用载玻片在显微镜下计数100?200个单个核细胞中着色的死细胞数。

四、操作注意事项

注意分离液与稀释血的比例，一般以1:2?1:3为宜。

分离时所取的离心速度与时间，因各台离心机的离心半径而异，需事先通过预试验决定

加入稀释血时应十分小心，注意保护试管内的界面，勿使混淆影响分离效果

做细胞活力检查时，锥兰染色后应尽快计数完毕，时间过长则细胞活力可能降低

五、实验结果记录与分析

通过前后两次细胞计数:

计算细胞回收率（%）

分离后单个核细胞总数X 100%

分离前单个核细胞总数

计算单个核细胞纯度（%）

分离后单个核细胞总数x 100%

分离后白细胞总数

外周血单个核细胞的分离(优质参考)

实验二十四外周血单个核细胞的分离 (Separation of mononuclear cell in peripheral blood) 免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。 【实验原理】 血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。 【主要试剂和器材】 1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。 2.5g/L台盼蓝。 3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。 4.Hank,s液。 5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。 6.水平离心机、显微镜。 【操作方法】 1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Hank,s液混匀。 2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。 3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。 4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。 5. 用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。 6.加入4倍量以上的Hank,s液，充分混匀，1000r／min离心l0min。离心后倾弃上清液，再用Hank,s液洗2次。 7.用含10%～20%灭活小牛血清的Hank,s液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。【结果判断】 【注意事项】 1.将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。 2.温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(18～25℃)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细胞活性。

人外周血单核细胞分离技术

人外周血单核细胞分离 1.抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min 离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10?12.5 mL 。 2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A中的细胞中加入Hank s液（不含Ca2+、Mg 2+, pH 7.2 ?7.6）体积比仍未1:1 , 混匀，制成细胞悬液。 B:无菌抗凝血与Hank s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。 另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处 将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液 分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。 管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台 单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞 沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的 2 / 3。混匀后离心1500r/mi n 离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。 注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。 再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min 离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank s液（或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640 液3?4 mL）重新混悬细胞37 C、5% C02孵育箱中培养2?3 h 后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640

外周血单个核细胞

外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（聚蔗糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤离心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%～95%，细胞获得率可达80%以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。 ●人外周血单核细胞（PBMC）分离及培养 PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。 Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 ●工具／原料 全血（以10ml为例） 无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水 蔗糖溶液（FicollPague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02) RPMI 1640培养基（Invitrogen） 胎牛血清（FBS）（GIBCO） 双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO) 二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）

细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定

细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定 医学细胞生物学设计型实验设计报告 班级10级k-7班 评分 实验项目： 细胞核的分离与鉴定 实验原理：1、细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内其沉降速度也不同。所以，用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。 2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在特定的条下进行离心分离，然后分析鉴定。 3、匀浆是指在低温条下，将组织放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。 实验步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使其学业尽量流出。 2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。 3、匀浆：加油8ml预冷的0.25mol/L蔗糖0.003mol/L绿化高永夜于烧杯中，尽量剪碎肝组织，将剪碎的刚组织倒入玻璃匀

浆器，是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿（如冰盘）。左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆，直至看不到明显的组织块。 4、过滤： 用8层纱布（先用少量生理盐水或蔗糖液润湿纱布）过滤匀浆液于离心管中。 5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心 15min，取上清液于另一离心管中。 6、涂片：取上清液制一张涂片（涂片1）。将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液，另制一张涂片（涂片2），自然干燥。 7、染色：分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液 ，染色5到7分钟（即滴染）。 8、洗涤：冲去染液，晾干。 9、镜检：结合实验结果的描述，镜下观察分析。 注意事项：1.操作规范，防止试剂污染。 2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 3.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。 预期结果：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。 实验用品：材料：小白鼠肝脏。

人外周血单核细胞分离液使用说明

人外周血单核细胞分离液使用说明 产品内容： 试剂Ａ200mL 试剂D200mL 样本稀释液（赠品）200mL 清洗液（赠品）200mL 保存：18℃-25℃保存，有效期两年。人外周血单核细胞分离液易感染细菌，需无菌条件下操作。无菌条件下操作，启封后常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 操作步骤： 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。首先取抗凝血按体积比1:1的比例加全血及组织稀释液混匀，根据稀释后的样本量大小，分以下两种情况： 情况A:稀释后血液样本小于5mL时，实验方法如下： 1.取一支15ml离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（体积比为3:2，试剂总量与稀释后的血液样本量相等。如稀释后的血液样本为5ml，则先后加入试剂A3ml、试剂D2ml），制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。 2.用吸管小心吸取稀释后的血液样本加于分离液液面上，400-550g，离心20-30min（注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。 3.离心后，此时离心管中由上至下分为五层。第一层为稀释液层。第二层为透明试剂D液层。第三层为环状乳白色单核细胞层。第四层为透明试剂A液层。第五层为红细胞层。 4.用吸管小心吸取第二层试剂D层和第三层乳白色细胞层到另一15ml离心管中，往所得离

心管中加入10ml清洗液，混匀细胞。 5.250g，离心10min。 6.弃上清。 7.用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。 8.250g，离心10min。 9.重复6、7、8，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 10.差异贴壁法纯化细胞 （1）用单核细胞无血清培养基或单核细胞完全培养基以1.5-3×106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。（2）2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。 （3）10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。 （4）不贴壁的为淋巴细胞。 注： a)无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加10%自体血浆或2-8%的胎牛血清。 b)完全培养基中含2-20%胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。 c)由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成本相对较低。如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴性分选。 情况B:血液样本大于等于5mL时，实验方法如下： 1.取一支适当的离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（试剂A与试剂D体积比为5:3，试剂总量与稀释后的样本量相等），制成梯度界面。 2.将经稀释后的血液样本小心加于分离液之液面上，450-650g（最大离心力可至1000g），

单个核细胞分离.

Separation of Mononuclear Cells from Whole Peripheral Blood 外周血单个核细胞分离 Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation 聚蔗糖—泛影葡胺分层液密度梯度离心法【Materials】 (1)Lymphocyte Separation Medium: specific gravity 1.077±0.001g/L 淋巴细胞分层液（比重为1.077±0.001g/L） (2) 2％trypan blue solution 2％台盼蓝染液 (3) Hank’s balanced salt solution (HBSS) or RPMI-1640 medium Hank’s液或者RPMI-1640培养基 【Methods】 (1) Drawing 2ml blood from main vein and mixing with 0.1 ml Heparin solution in a tube. 采集静脉血2ml注入盛有0.1ml肝素的试管中，混匀。 (2) Dilute the whole blood with an equal volume of Hank’s balanced salt solution (HBSS) 加入等体积HBSS或PBS等倍稀释血液。

(3) Pipette 2ml lymphocyte separation medium into a centrifuge tube. Then, add the diluted blood sample carefully by flowing along the side of the tube on the LSM. The interface must be clear. 吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。 (4) Centrifugation at 2000rpm for 20 min at room temperature. Four distinct layers are found from top to bottom: 室温2000r／min离心20min。管内可分为以下四层：

细胞核的分离

实验四细胞核的分离 [实验目的] 1. 为了研究细胞核及其组分。 2. 定量分析细胞核的生化组分及其它一些特殊成分。 [实验原理] 1956年由chauveau等人提出，用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的密度较大，在高密度介质中，在高速离心条件下沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开来的目的。chauveau 的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/l蔗糖溶液中匀浆，然后高速离心40 000g 1小时，细胞核沉淀到底部，线粒体和完整细胞，包括红血球漂浮在液面，通过一步操作即可分离得到细胞核。其后又有不少研究者对此方法进行了改进，例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质的渗透压；选择介质的ph以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性，防止聚集，维持恒定的ph，就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单，能得到较高纯度的细胞核，也已被广泛采用，但实验需要高速离心机，这在一般实验室不能进行，此方法要用高浓度的蔗糖，如果要分离大量的细胞核，也很不经济。 目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核，在柠檬酸介质中分离细胞核可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液的ph值，这样可以减少细胞核的破碎率，并能分离得到较高分子质量的核酸，可能是由于核糖核酸（一种酸溶性蛋白）被柠檬酸除去，以及二价阳离子被柠檬酸螯合所致。 柠檬酸的浓度对分离细胞核的质量有较大影响。通常在较低的ph值时，可以得到较高的细胞核。但在过酸条件下，可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞内核酸，一般常在ph值为4，甚至在ph值为2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核的酶，则需要较温和的条件，此时可以在ph值为6～6.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。

人外周血单个核细胞分离液说明书

分离后分离前 水平离心血浆层单个核细胞层分离液层 红细胞层人外周血单个核细胞分离液说明书 货号：P9010/P9011 规格：200mL 产品简介： 本产品是一种用于分离人外周血单个核细胞的无菌、低内毒素水平的密度梯度分离液。外周血中单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，为1.090g/mL左右，淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090g/mL，血小板为1.030~1.035g/mL。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 产品指标： 密度 1.077±0.001g/mL 渗透压 290~350mOsm/kg H2O 无菌 0.1μm 滤膜过滤保存条件： 本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 操作步骤： 1.取新鲜抗凝全血（EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝 均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血 及组织稀释液或者PBS稀释全血。 2.在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体 积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL， 加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过 离心管的三分之二，否则会影响分离效果）， 将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意

保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。） 3.室温，水平转子500~1000g，离心20~30min（血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳 的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g）。 4.离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白 膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。 5.小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞。250g，离心 10min。 6.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。 7.重复步骤6 8.弃上清，细胞重悬备用。 注意事项： A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物 污染。 B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较 低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。 C.血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2h以内），为保持单个核细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。 D.稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降 低细胞得率及纯度。 E.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。 F.血液样本的粘稠度或者是温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳 的分离条件。 G.吸取过多的单个核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增 加；吸取过多的血浆层可能会导致单个核细胞中血浆蛋白及血小板污染。

单个核细胞的分离

单个核细胞的分离：（密度离心法） （一）外周血中的单个核细胞的分离： 1. 眼眶静脉丛采血：（无菌条件下操作） 采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。刺入浓度，小鼠约2～3mm。当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。左右两眼轮换更好。体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml。摘除眼球取血： 左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.6-1mL。 2. 分离PBMC操作步骤： 1）用抗凝管（内含抗凝液0.2ml）收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积（1:1）稀释血液。 或用肝素溶液：生理盐水将肝素配成125-250U/mL的无菌液，4度保存。每1mL全血加0.1mL 肝素溶液。 2）取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。 3）将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。 （稀释血液与分层液体积比例约为2:1）。 （或：将吸管嘴插入离心管底部，将分层液缓慢加入稀释血液的底部。） 4）18-20度，水平离心机以2000r/min离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。（离心温度在18-20度） 5）用毛细血管（或1ml注射器）轻轻插入白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一离心管中。 （或：先吸去最上层的血浆，然后用另一只毛细吸管收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC，避免吸到过多的分层液和血浆。） 6）加入５ml的（不含Ca2+，Mg2+）的Hank's液或RPMI1640洗涤2次，混匀，依次以1500r/min、1000r/min离心10min，吸弃上清。 （*低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板） 7）末次离心后，弃上清，用含有10％小牛血清的RPMI1640 2ml，重悬细胞。 8) 细胞计数：取20ul细胞悬液加20ul 0.4%台盼兰染液，3-5分钟后取样进行计数。 活细胞不着色，折光强；死细胞被然成蓝色，体积略膨大。计数200个细胞，计算活细胞百分率。 单个核细胞浓度(细胞数／1ml细胞悬液)＝(4个大方格内细胞总数/4)310４32(稀释倍数) 活细胞百分率＝(活细胞数/总细胞数)3100％

细胞核的分离与鉴定设计型实验设计报告_(2)

实验项目：细胞核的分离与鉴定 实验原理： 分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同，因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级分离出来。本实验就采用差速离心法。 细胞核的鉴定，因为细胞核中主要含DNA，而DNA是碱性蛋白，可用甲苯胺蓝染液可使细胞核内碱性蛋白呈现出来。 实验器材：显微镜，普通离心机，离心管，滴管，玻璃漏斗，纱布，烧杯，解剖剪，镊子，玻璃匀浆器，载玻片/盖玻片，染色盘架，小白鼠肝脏。 实验试剂：甲苯胺蓝染液，蒸馏水，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，生理盐水 实验步骤： （1）、用颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速解开其腹腔取出肝脏，去出结缔组织，剪成小块，尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中。反复洗涤尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 （2）、将湿重为1g的肝组织放入烧杯中，用量筒取8ml预冷的0.25mol/L 蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于烧杯中，尽量剪碎肝组织后全部加入。 （3）、将剪碎的肝组织导入匀浆管中，使匀浆器下端侵入盛有冰块的器血

中，左手持，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3-5次。用3层纱布过滤于匀浆管中，然后制备一张涂片①，自然干燥。 （4）、将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机以2500r/min离心15min,弃去上清液。 （5）、用6mol 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液悬浮沉淀物，以2500r/min离心15min 弃去上清液，将残留液体用气管吹成悬液，滴一滴于干净的载盖玻片上，制成涂片②，自然干燥。 （6）在①·②上滴加甲苯胺蓝染液，染色5-7min，洗涤干燥后镜检。 ⑺记录观察结果 注意事项： （1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。 （2）将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。 （3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太厚。 （4）染色后的洗涤要注意时间，不可过长，避免将染色洗去，观察不到细胞核。 （5）开腹取出肝后，用生理盐水反复冲洗，避免血细胞对食盐的影响。 预期结果： 在低、高倍镜下，可以观察到经.0.1%碱性固绿染色的小白鼠肝细胞的细胞核体被染成绿色。说明这是碱性蛋白，即细胞核已游离出来。 涂片在高倍镜下可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色、圆形、中央有

人外周血单核细胞分离技术

人外周血单核细胞分离 1. 抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10～12.5 mL。 2. 沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A 中的细胞中加入Hank′s液( 不含Ca2+、Mg2+, pH 7.2 ～7.6) 体积比仍未1:1，混匀，制成细胞悬液。 B: 无菌抗凝血与Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。 另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。 管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3. 单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2／3。混匀后离心1500r/min离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。 注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。 再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank′s液( 或含10%胎牛血清及25 mmol /L

实验设计-细胞核的提取与鉴定

医学细胞生物学设计型实验设计报告 姓名：李飘班级：K—10班学号：1020151004 评分 【实验项目】：动物细胞细胞核的分离与鉴定 【实验原理】：核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的 细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此,我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。 细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA，是碱性蛋白。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理,抽提掉核酸后，用碱性固绿溶液染色，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。 【实验步骤】： 1．细胞培养：将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上，使适宜的培养基中于37 ℃的条件下培养，使细胞固定在脱核塑料圆板上，脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径，使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。 2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后，加入0.1ug/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60h 滤纸，使细胞形成多个大小不同的核体。 3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml预热至37 ℃的细胞松弛素B溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后，再加入10ml37 ℃的CB溶液。 4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。 5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。 6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴加15%乙醇于涂片上，固定5min，室温晾干。 7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90 ℃的三氯醋酸溶液中处理20min，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。 8．染色：将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10～15min，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。 【注意事项】： 1．在离心管内加入的5ml细胞核松弛素B溶液要预热到37 ℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。 2．涂片在用三氯醋酸处理时，时间不宜过长或过短，过长会使核膜裂解，过短使抽提的核酸不够。 3．在染色时，时间一定要足够，否则染色不完全，得不到理想的实验结果。 4．因去掉胞质的核体贴附能力弱，因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。 【预期结果】：经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性 蛋白，即细胞核。

动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒使用说明

动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒使用说明 规格：3×200mL/kit 保存：动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 组成： 各种动物脾脏单个核细胞分离液200mL 全血及组织稀释液200mL 细胞洗涤液200mL 单个核细胞分离方法 1.制备脾脏的单细胞悬液。 2.取一支适当的离心管，加入与脾脏单细胞悬液等量的分离液（分离液最少不得少于3mL， 总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果）。 3.小心吸取单细胞悬液加于分离液液面上，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德 吸管吸取单细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。） 4.室温，500~900g，离心20~30min。（根据脾脏单细胞悬液的量确定离心条件，单细胞悬 液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件可以自行摸索，以达到最佳分离效果）。 5.离心后，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层为稀释液层；第二层为环状乳白色 单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。 6.用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层至另一洁净的15mL离心管中，向离心管

中加入10ml细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250g，离心10min。 7.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。 8.重复步骤7 9.弃上清，细胞重悬备用。 分层示意图 脾脏单细胞悬液的制备方法 脾脏研磨的方法： 1.无菌条件下摘取脾脏，撕去脾脏被膜，用眼科剪将脾脏剪成小块。 2.将尼龙筛网或者是细胞过滤筛放置于平皿上，加入少量全血及组织稀释液（保证脾脏及 获得的细胞处于液体环境中）。 3.将脾脏放置于筛网上，使用注射器活塞或者是无菌镊子来研磨脾脏（尽量控制研磨力度， 保持筛网悬空，避免在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡） 4.研磨完全后使用全血及组织稀释液冲洗筛网，收集细胞悬液，再经滤网过滤。

利用离心技术分离细胞核和叶绿体

密度梯度离心后的结果低倍镜下的叶绿体 高倍镜下的叶绿体 实验二利用离心技术分离细胞核和叶绿体 一、实验目的： 1. 了解常用的离心法； 2. 理解差速离?心法和速率区带离心法分离样品组分的原理； 3. 以分离细胞核和叶绿体为例,掌握离心的操作方法。 二、实验原理： ? 离心技术：是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的实验技术。?离心技术类型: 1.差速离心法 2.密度梯度离心法 ?等密度梯度离心： ①对象：常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。(此法一般应用于分离大小相 近，而密度差异较大的颗粒物质时) ②原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中， 颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相 等的位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长时间，它们再也不移 动了，形成一系列密度区。从而使不同浮力密度的物质得到分离。③等密度梯度离心一般常用CsCl、蔗糖、甘油等做介质。 ?速度梯度离心： ①对象: 纯化分离叶绿体和细胞核(主要用来分离密度相近，大小不同的物质) ②原理:根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,达到彼此分离的目的。 ②要求：1、样品溶液的密度必须小于悬浮介质层的最小密度； 2、样品颗粒的密度必须高于悬浮介质的最大密度； 3、离心时间十分重要 三、实验结果分析： 实验结果：

实验结果： 如图所示，叶绿体在混合液的梯度层中，形成一条带，聚集在密度梯度交界处；沉降系数较大的细胞组份则沉到离心管底部。 如图所示，叶绿体镜检为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒为基粒。 实验分析： 此实验最难的一点就是蔗糖溶液梯度的制备。要想制得清晰，平整的界面，需要将离心管放置于稳定的水平界面上；最重要的是，向下层溶液中加入上层溶液时，需要极小心、熟练地控制滴加的力度，并使枪头贴着离心管管壁，让液滴缓慢的流入，防止梯度层被破坏；除此之外，将配置好梯度层的的EP管放入离心机时要用试管架移动，而且离心时一定要两两平衡，之前要称量两个离心管使其相等。 四、思考问答： 本实验使用了哪两种离心方法，它们在分离样品时有何不同？ 答：使用了等密度梯度离心和速率区带离心。速率区带离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始离心速度较低，使较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍悬浮在上清液中。收集沉淀，再改用较高的离心速度离心悬浮液，使较小的颗粒沉降，多次重复此步骤，从而达到分离不同大小颗粒的目的；等密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。此种分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。

细胞核与线粒体的分级分离

细胞核与线粒体的分级分离 一、原理 细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不 同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括 组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的 主要手段。 匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即 0.25mol／L 蔗糖一 0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。 分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将 浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大 小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯 的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。 分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。 二、细胞核的分离提取 (一)操作步骤 1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有 0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 2． 将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙 溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。 3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂 直插入管中， 上下转动研磨3～5次， 用3层纱布过滤匀浆液于离心管中， 然后制备一张涂片①， 做好标记， 自然干燥。 4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入 高速离心管中， 保存于有冰块的烧杯中， 待分离线粒体用； (2)同时涂一张上清液片②做好标记， 自然干燥； (3)余下的沉淀物进行下一步骤。 5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残 留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。 6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。 (二)结果 分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。 三、高速离心分离提取线粒体 (一)操作步骤 1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以 17000rpm 离心 20 分钟，弃上 清，留取沉淀物。 2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分 钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成 悬液(可用牙签)。 3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯 绿B染液盖上盖片染20分钟。 (二)结果 油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。

对外周血单个核细胞分离方法探讨

对外周血单个核细胞分离方法探讨韩亚萍刘源章莉莉刘婷李军黄祖瑚 2004-7-24 17:06:00 中华现代临床医学杂志 2003年11月 第1卷第9期 【摘要】目的探讨外周血单个核细胞（PBMC）的不同分离方法对分离效果、贴壁能力以及淋巴细胞的增殖活性的影响。方法取肝素抗凝血，分别用羟乙基淀粉（hydrixyethylstarch，HES）自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法三种方法分离单个核细胞，直接进行贴壁计数及多种细胞因子诱导的杀伤细胞 （Cytokine-induced killer，CIK）培养。结果 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll 密度梯度离心法分离的PBMC回收率分别为86.4%、86.0%、85.1%。结论羟乙基淀粉离心沉淀法可有效地分离PBMC。 关键词羟乙基淀粉淋巴细胞分离液单核细胞 Study on the methods of separating peripheral blood mononuclear cells HanYaping，Liu Yuan，Zhang Lili，et al. Deparment of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of Nanjing M edical University，Nanjing210029. 【Abstract】 Objective To investigate the difference among three protocols o f isolating peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）through observing the re covery rate，t he adherent ability and lymphocytes proliferation acˉtivity of t he isolated PBMCs.Methods Use three different isolation protocols，HES（hydrixy e thylstarch）sedimentation method，HES centrifugation method and Ficoll density gradient centrifugation，to isolate PBMCs from healthy donors.Then compare thes

细胞核质蛋白分离

介绍 核蛋白抽提试剂可以从哺乳动物培养的细胞或组织中逐步分离和制备细胞质和细胞核提取物。不变性的活性蛋白在不到两小时内纯化。在细胞颗粒中加入前两种试剂会导致细胞膜破裂和细胞质内容的释放。用离心法从细胞质提取液中提取完整细胞核后，用第三试剂从细胞核中提取蛋白质。用这种产品提取的核和细胞质组分提取物一般污染率不到10%，这对于大多数涉及核提取物的实验来说是足够的纯度 核抽提物比起全细胞裂解物通常更适合于进行基因调控研究。全细胞裂解液中的细胞成分对核蛋白的相互作用和稳定性有不利影响，核蛋白更集中于核提取物，而非全细胞裂解物。核提取物/试剂与多种下游应用兼容（包括Western blotting，BCA蛋白定量分析（产品编号23225），凝胶移位（产品编号20148），报告基因和酶活性的测定） 重要产品信息 ●此试剂盒适用于新鲜（未冷冻）的细胞或组织样品。使用蛋白酶抑制剂维持提取物的完 整性和功能。使用前，将蛋白酶抑制剂加入CRE I和NER浓缩物中以减少试剂稀释（浓缩蛋白酶抑制剂eg.100x）。不需要添加蛋白酶抑制剂到CER II。 ●如果在随后应用中需要大量的核提取物或出现问题，透析前用核提取物清除多余的盐。 试剂盒中的洗涤剂是不可透析的，但它主要是在细胞质中。使用Thermo Scientific?Slide-A-Lyzer?小型透析装置进行透析。另外，无回收蛋白或条块分割的不利影响下，NER 用于提取液的体积可以减小2倍可以得到更集中的核提取物。 ●在4°C条件下执行所有离心步骤，保持细胞样本和提取物在冰上。 额外所需材料 ●蛋白酶抑制剂 ●磷酸盐缓冲盐水(PBS) 细胞培养制备 ●贴壁细胞，用胰蛋白酶-EDTA消化，然后在500g离心5分钟。对于悬浮细胞，通过离 心在500G 5分钟收获。 ●用PBS重悬细胞颗粒冲洗细胞 ●1-10×106细胞转移至1.5ml离心管，并在500G 离心2-3分钟 ●使用吸管小心地去除和丢弃上清液，使细胞颗粒尽可能干燥。 ●在细胞中加入冷的CRE I（表1）。使用表1所示的试剂体积进行细胞质和核蛋白提取 不同细胞体积对应的试剂体积 红细胞压积(μL) CER I (μL) CER II (μL) NER (μL) 10 100 5.5 50 20 200 11 100 50 500 27.5 250 100 1000 55 500 *Hela细胞2×106细胞相当于20μL红细胞体积.