等电点聚焦

等电点聚焦

姓名：张晓锋班级：生物技术121 学号：2012014111

等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）目前已广泛用于蛋白质分析和制备中，是20世纪60年代后才迅速发展起来的重要技术。IEF的基本原理是，在电泳槽中放入两性电解质，如脂肪族多氨基多羧酸（或磺酸型、羧酸磺酸混合型），pH 范围有3～10、4～6、5～7、6～8、7～9和8～10等。电泳时，两性电解质形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，正极为酸性，负极为碱性。蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中进行电泳。样品可置于正极或负极任何一端。在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。当置于负极端时，因pH＞pI，蛋白质带负电向正极移动。随着pH的下降，蛋白质负电荷量渐少，移动速度变慢。当蛋白质移动到与其等电点相应pH 位置上时即停止，并聚集形成狭窄区带。因此，IEF中蛋白质的分离取决于电泳pH梯度的分布和蛋白质的pI，而与蛋白质分子大小和形状无关。

IEF的优缺点。优点：①分辨率很高，可把pI相差0. 01的蛋白质分开；②样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用。③电泳结束后，可直接测定蛋白质pI。④分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性。缺点：①电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀，克服方法是在样品中多加些两性电解质。②许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。

一、基本原理

（1）人工pH梯度：在分离蛋白质时常用一个直立的性，以蔗糖密度梯度防止对流。当两个不同pH的缓冲液互相扩散时，在其混合区间即形成pH梯度，称为“人工pH梯度”。因为缓冲液是电解质，在电场中的它的离子移动会引起pH梯度的改变，所以不稳定。

（2）天然pH梯度：这种梯度是由电流本身所引起并保持的，比较稳定，其形成过程是，当电解硫酸钠的稀溶液时，在阳极聚焦硫酸而在阴极聚焦氢氧化钠。若将一些两性电解质放入槽中，则它们在阳极的酸性介质中就会得到质子而带正电，在阴极的碱性介质中则失掉质子而带负电，这样就会受其附近的电极所排斥而向相反方向移动。设其中有一个酸性最强的两性电解质（甲），当它由阴极逐渐接近阳极的硫酸时，就会失去电荷而停止运动，（甲）所在的位置就是它的等电点，另有一个等电点稍高于（甲）的物质（乙)，当向阳极运动靠近（甲）时，它不能超过（甲），因为那里低于它的等电点。于是（乙)将带正电荷而向阴极移动，它只能排要（甲）的阴极侧。假如有很多两性电解质，它们就会按照等电点由低到高的顺序依次排列，形成一个由阳极向阴极逐步升高的平稳的pH梯度，此梯度的进程取决于两性电解质的pH值，浓度和缓冲性质。防止对流的情况下，只要电流稳定，这个pH梯度将保持不变。

（3）两性电解质互相分离的条件：上述经验甲乙两物质形成两个相邻的不同pH的等电点层，因为在它们中间不能形成纯水层，所以它们不是完全分离开的，中间部分互相扩散，互相粘连。要使两物质完全分开，中间必须有一个介于

其间pH值的物质，例如，当甲乙两物质的pH值正好一个在7以下，一个在7以上，即可以分开，因为中间形成了纯水层（pH=7)，这时水是作为一个两性电解质而存在。

（4）蛋白质的电聚焦分离：蛋白质及多肽是两性电解质，它们比氨基酸更适于电聚焦，因为它们在等电点附近仍有电荷而能进行电迁移，大部分中性氨基酸在接近等电点时就失去电荷而停止运动，不能过到真正的等电点。但在没有第三种居间的两性电解质存在时也不能将两种蛋白质完全分开，必须有很多不同pH值的是电解质（载体两性电解质）才能解决这个问题。

二、载体两性电解质

（1）载体两性电解质必需具备的条件：

（i）在等电点处必需有足够的缓冲能力，以便能控制pH梯度，而不致被样品蛋白质或其他两性物质的缓冲能力改变pH梯度的进程。

（ii）在等电点必需的足够高电导，以便使一定的电流通过，而且要求具备不同pH值的载体有相同的电导系数，使整个体系中的电导均匀，如果有局部电导过小，就会产生极大的电位降，从而其他部分电压就会太小，以致不能保持梯度，也不能使应聚焦的成分进行电迁移，达到聚焦。（iii）分子量要小，便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤法分开。（iv）化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定。

（v）应不与分离物质反应或使之变性。总起来说，当一个两性电解质的等电点介于两个很近的pk值之间时，它在等电点的解离度大，缓冲能力强，而且电导系数高，这就是好的载体两性电解质。

（2）理想的载体两性电解质的合成：

用具有几个pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺）为原料，与不饱和酸（如丙烯酸）发生加合反应：加合反应优先加在α、β饱和酸的β碳原子上，调节胺和酸的比例可以加上一个或多个羧基，这种合成方法与一般有机会合成不同，有机合成一般要求合成的产物愈纯愈好，而这里要求合成出的产物愈复杂愈好，要有多异构物和同系物，以保证的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI 值，从而得到平滑的pH梯度。载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围，分子量在300-1000之间，它们的缓冲能力等于或优于组氨酸，电导性能良好，可以使电场强度分布较均匀，它们的水溶性良好，在1%水溶液中的紫外吸收值（260mμ）很低。

三、密度梯度等电点聚焦

（一）密度梯度

密度梯度是用以防止对流保持pH梯度，避免已分离物质再混合的重要措施则由重溶液和轻溶液以梯度混合形成。用做密度梯度的溶质应具有以下条件：溶解度高，粘度低；密度大，得到的密度差不低于0.12克/厘米3，不与样品蛋白质起反应，不解离。最常用的是蔗糖（分析纯），它对蛋白质不仅无害还有保护作用。重溶液含蔗糖50%（W/V)，这时柱上和柱下最大密度差为0.2克/厘米3，浓度太高则粘度过大适用。蔗糖在高pH值时会分解，影响pH梯度及pI值测定，这种情况下可改用甘油，也可用甘露醇，山梨醇，右旋糖酐等。

（二）pH梯度的选择

在测定未知蛋白时，可先采用pH3-10的载体，经初步测定后改用较窄的以

提高分辨率，在使用pH7以上或以下范围时，因缺少中性载体，在聚焦过程中载体与电极之间在pH7部位就会形成纯水区带，纯水的电导极低，必须避免此现象。凡使用离开中性的pH范围的载体时应加入相当于0.1载体量的pH6-8或pH3-10的载体。在用pH低于3的范围时，可加有机酸如一氯醋酸，二氯醋酸，甲酸，乙酸，pH离于10时，可补加胺使pH增加到11。载体在pH6附近电导较低，可以与蔗糖密度梯度互相补偿，蔗糖浓度高时电导低，所以可把pH6电导低部位放在柱上部，也就是用pH6以下范围时，阴极在上，而用pH6以上范围时，阳极在上方。

（三）蛋白质样品及分离容量

电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提纯，分析上可用来测定混合物中某一成分的相对比例：如大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应预先除去。蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大，易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸碱，占据了分离的有效部位。加样体积不受限制，最高可达80-85毫升。等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯度所能支持的蛋白质，提高密度可以提高分离容量；容量与区带高度的平方成正比，降低电压可使区带变宽，提高容量，但分辨率降低，聚焦时间长，用窄的pH梯长范围可以使区带变宽，提高分辨率。用110毫升柱时，每一区带蛋白质含量最高可达２0-25毫克，由于粗蛋白样品可分为很多区带，所以总量可以加至几百毫克；分离的容量与柱的横载面成正比，用440毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带可达一克。

参考文献

叶炳辉《等电点聚焦电泳法的原理及其装置》.南京医学院学报.1985.3

范世福《分析仪器发展应顺应现代科技趋势》.中国机电日报.2001.45

胡永康《扫描探针显微镜的研究及应用》.大连理工大学.2000

等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点

等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点 【实验原理】 等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF． 【试剂与器材】 1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。 2．1％(V/V)TEMED溶液。 3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。 4．40％两性电解质载体。 5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。 6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。 7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。 8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。 9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。 10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。 11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。 12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。 食品安全检测农药兽药残留土壤成分分析焦炭成分分析 【操作步骤】 1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。取一锥形瓶，分别加入凝胶贮存液2mL，两性电解质载体0．4mL，1％TEMED溶液2mL，人血清2μl，蒸馏水2．58mL，轻轻搅匀，注意勿带入气泡。立即用滴管将此凝胶溶液加入上述玻璃管中，直至距上端25px处为止，然后小心加入蒸馏水(3～5mm高)，注意保持凝胶表面平坦，以保证凝胶正常聚合。室温中静置1小时，让凝胶完全聚合。此时，凝胶浓度为3．8％，两性电解质载体含量为2％。 2．聚焦将聚合完毕的各凝胶管上端水层吸去，除去下端胶布。垂直插入圆盘电泳槽装置中。下槽加入0．5mmol/LNaOH溶液，接负极；上槽加入0．5mmol/L磷酸溶液，接正极。凝胶管上下端均不得产生气泡，如有气泡，可用针头或细玻棒驱除。打开电泳仪开关，调至100V处，待电压稳定后调至150~160V，电泳4小时可完成聚焦。 3．剥胶取下凝胶管，先用蒸馏水充分洗涤凝胶管两端，再用带长针头的注射器吸满 蒸馏水，将针头小心插入胶柱与管壁之间，边注水边缓慢旋转玻管，并将针头向前慢慢推进，靠水流压力和润滑力将玻管内壁与凝胶分开，然后用洗耳球在胶管一端轻轻加压，凝胶柱便缓缓从玻管中滑出，将其放在洁净的玻板上，在一端做上标记。 4．固定、染色将凝胶柱平放于玻板上，量取并记录其长度后立即浸入预热到60℃的lg/L考马斯亮蓝固定染色液中约30分钟，取出后用蒸馏水洗涤，再用酸性乙醇脱色液漂洗，洗去背景颜色。 凝胶柱经固定染色后其长度会发生变化，未经固定染色的凝胶柱长度与固定染色后凝胶柱长度之比为变形系数。量取并记录固定染色后凝胶柱的长度和蛋白质区带中心至正极端的距离，此距离乘以

等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点

实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点 一、实验目的 了解等电聚焦的原理。通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。 二、实验原理 等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。 蛋白质分子是典型的两性电解质分子。它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。 两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。若不同的pH值的两性电解质的含量与pI值的分布越均匀，则pH梯度的线性就越好。对Ampholine两性电解质的要求是缓冲能力强，有良好的导电性，分子量要小，不干扰被分析的样品等。 在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后，如保持pH梯度的稳定是极为重要的。为了防止扩散，稳定pH梯度，就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质，最常用的这种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时，凝胶柱内即产生pH梯度，当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位，而此部位的pH值正好等于该蛋白质的等电点时，该蛋白质即聚焦形成一条区带，只要测出此区带所处部位的pH值，即为其等电点。电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中，越狭窄，因而提高了分辨率。这是等电聚焦的一大优点，不像一般的其他电泳，电泳时间过长则区带扩散。所以等电聚焦电泳法不仅可以测定等电点，而且能将不同等电点的混合的生物大分子进行分185

等电聚焦平板电泳法

附录V F 电泳法 第六法等电聚焦水平板电泳法 两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点（此处的pH值使相应的蛋白质不再带电荷）时，电流达到最小，不再移动。本法用于检测蛋白类和肽类供试品的等电点。 除另有规定外按以下方法测定。 1. 仪器装置恒压或恒流电源、带有冷却装置的水平电泳槽和制胶模具。 2. 试剂 （1）水（电阻率应不低于18MΩ·cm） （2）A液称取丙烯酰胺5.0g，亚甲基双丙烯酰胺0.15g，加适量水溶解，并稀释至50ml，双层滤纸滤过，避光保存。 （3）B液10％过硫酸铵溶液，新鲜配制。 （4）甲基红试液称取5mg甲基红，溶于10mL 0.05mol/L 氢氧化钠中。 （5）50%甘油 （6）正极液0.5mol/L磷酸溶液 （7）负极液1mol/L 氢氧化钠溶液 3. 操作法

（1）制胶取A液2.5ml，pH3~10的两性电解质（或其它pH范围的两性电解质）0.35ml，水1.25ml，50%甘油0.5ml，抽气5~10分钟，加B液25μl，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺6μl，混匀后缓慢的注入水平模具内，室温下聚合。 （2）预电泳将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放到冷却板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免气泡的产生。用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条，然后分别放于阳极与阴极上，将电极对准电极条中心，加盖，在恒压法下进行测定，在起始电压200V 下预电泳30分钟。 （3）对照品溶液和供试品溶液的制备将供试品对水透析（或用其它方法）脱盐，并将蛋白或多肽含量调节至0.5~5mg/ml （如供试品蛋白或多肽浓度太低，则需采用适当方法浓缩）。对照品溶液同供试品溶液制备。 （4）电泳将加样滤纸条以一定间隔置于凝胶上，加入供试品、对照品及等电点标准溶液5~20μl。选择恒压方式进行电泳，起始电压为200V。电泳0.5~1小时待甲基红迁出加样条后，去除加样条。调高电压至400V，电泳至电流不再变化，再调高电压至600V，待电流不再变化时停止电泳。 4. 固定和染色 （1）试剂 a. 固定液20％三氯醋酸 b. 染色液i) 染色储备液称取1.0gG-250，溶于20ml水中，

等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定

等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步 测定1 常灏，黄耀江，沈光涛 中央民族大学生命与环境科学学院，北京（100081） E-mail：haobio@https://www.wendangku.net/doc/6a11306013.html, 摘要：作为一种新型的速效局部止血药和工具酶，凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛，牛血浆是其重要的来源之一。等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤，测定其等电点后，再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。本实验的目的是通过测定胰蛋白酶的等电点建立载体两性电解质等电聚焦电泳的方法，并以该方法结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等电点。经双向电泳后，SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点，分别测定它们的分子量和等电点，其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa，其等电点为5.19。 关键词：牛凝血酶，等电点，等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 引言 凝血酶（Thrombin，EC3.4.21.5）是一种丝氨酸蛋白水解酶，在血液凝固系统中起重要作用。它能催化溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。[1][2]凝血酶在参与凝血作用的同时，对底物还具有高度的特异性，可以专一性地切割X-Arg-Gly或Gly-Arg-X序列中由精氨酸羧基参与形成的肽键。 [3] 由于凝血酶具有以上的特性，近年来使其成为一种新型的速效局部止血药，在临床上被广泛应用于消化道出血和外科手术止血。[1]此外，利用其作用的特异性，还可作为工具酶用来加工目的产物，在医学和生物学研究上的用途也很广泛。 现在，制备凝血酶的原料多为牛、猪和人的血浆。我国猪血的来源相当广泛，随着开发利用猪血的意识逐渐提高，有关猪凝血酶提取方法的文献报道也越来越多。目前，凝血酶的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法3种。[1]其中等电点沉淀法是最简单易行的分离方法，也是后续纯化工作的基础。凝血酶的等电点在5.0～5.5之间[1]，但物种之间是有差异的。已有报道显示，将猪血浆采用适宜的稀释度稀释后，用1%或2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可将猪凝血酶原粗制品沉淀出来。[2][4][5][6] 在我国，牛血的来源也是比较丰富的，因此从牛血中提取凝血酶也具有一定的社会意义。欲利用等电点沉淀法得到牛凝血酶的粗制品，需预先得知其等电点。虽然已有文献报道，将牛血浆稀释10倍后，用2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可沉淀出牛凝血酶原[7]，但其等电点的准确值在文献中尚未见报道。 随着系统生物学和蛋白质组学的迅速发展，作为其主要的研究手段之一的电泳，应用范围越来越广泛和普遍。等电聚焦（Isoelectric Focusing, IEF）电泳技术，凭借其高分辨率等优点，现已成为一种被广泛采用的蛋白质分析和制备技术。它不仅可以测定蛋白质的等电点，分离混合的蛋白质，而且与SDS-PAGE组成双向电泳后可大大提高分离蛋白质的能力。因此，可以采用双向电泳的方法（第一向：IEF，第二向：SDS-PAGE），测定牛凝血酶的等电点。根据凝胶过滤法的测定，牛凝血酶的相对分子质量为37 kDa，由两条多肽链通过一个二硫键相连，A链为5kD，B链为32kD。[2]这样就可以在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中确定牛凝血酶的条带，从IEF中得知其等电点。等电点测定后，使得采用等电点沉淀法获取牛凝血酶粗制品时纯度更高，有利于纯化操作和研究其功能，以及其它相关研究工作的进行。 2.等电聚焦基本原理 1本课题得到学校“211工程”基金资助。

《中国药典》2020版— 等电聚焦电泳法

0541电泳法 第六法等电聚焦电泳法 等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。 本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。方法 1：垂直板电泳法 除各论中另有规定外，按以下方法测定。 1.仪器装置 恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。 2.试剂 (1)水(电阻率不低于 18.2MΩ?cm)。 (2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。 (3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。 (4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3?10)溶

液 4ml，加水至 20ml。加 0.1%甲基红溶液 20μl。 (5)pI 标准商品化试剂，所选用的pI 标准的等电点范围一般应涵盖供试品的等电点。 (6)固定液称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g, 加水溶解并稀释至300ml。 (7)脱色液(平衡液) 取 95%乙醇 500ml、冰醋酸 160ml，加水稀释至2000ml。 (8)染色液称取考马斯亮蓝G250(或R250)0.35g，加脱色液300ml，在60?70℃水浴中加热，使溶解。 (9)保存液取甘油30ml，加脱色液300ml，混匀。 (10)正极液(0.01mol/L 磷酸溶液) 取磷酸1ml，加水至1800ml。 (11)负极液(0.01mol/L 氢氧化钠溶液) 称取氢氧化钠0.4g，加水溶解并稀释至1000ml。 3.测定法 (1)制胶装好垂直平板电泳槽，压水，于玻璃板和玻璃纸之间加入 60% 甘油 1ml。取水 12ml、甘油 2ml、A 液 4.0ml、两性电解质(pH3?10)溶液( 或其他两性电解质 )1.0ml, 混匀，脱气，再加 B 液 72 μl，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 3μl，混匀后注入槽内聚合，插入样品梳，注意避免气泡出现。 (2)供试品溶液的制备将供试品对水透析(或用其他方法)脱盐后，与供试品缓冲液按 3:1 体积比混匀。供试品溶液最终浓度应不低于

等电聚焦电泳和race原理

等电聚焦电泳（IEF） 在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应， 其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。 RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。SMARTTM 3'-RACE原理 利用mRNA的3' 末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。（见下图）

等电聚焦电泳的两种方法

等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点 等电点聚焦（IEF ）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH 梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH 梯度中时，这种 分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0 的区带，这时的pH 则是该分子的pI ，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH 环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI 迁移。因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI 处得以“聚焦”. 二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、 NP-40、teiton-100 电极液：1M 磷酸（阳极液）、1M 氢氧化钠（阴极液） 固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml 染色液：0.35g考马斯亮蓝R—150溶于300ml脱色液中，加热到60 - 70C,加入0.3g硫酸铜。 脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水 样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100 、9M 尿素 三、操作步骤： 1, 样品制备：用IEF 样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF 样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。 2, 制模具： 洗干净两块IEF 专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。 3, 配胶： 胶液组成：6ml 胶母液（10％，19/1） 6—8 ％尿素 1ml Ampholine （pH3.5-10） 60-80ul 10%AP 5 ul TEMED 4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具 5, 电泳： 等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置上放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，横功率25W电泳，约10min后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30min，待电流达4mA 以下，停止电泳。 6, 表面电极测定蛋白质的pI 7, 固定：取出塑料片，放入固定液中15min 8, 染色：取出塑料片放入染色液中65C染色，直至条带出现 9, 可脱色至背景消除后干燥保存。 四、结果（略）五、注意事项 1、两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含量2% -3 %较合适，能形成较好的pH梯度。 2、丙烯酰胺最好是经过重结晶的。 3、过硫酸铵一定要新配置。

等电点聚焦

等电点聚焦 姓名：张晓锋班级：生物技术121 学号：2012014111 等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）目前已广泛用于蛋白质分析和制备中，是20世纪60年代后才迅速发展起来的重要技术。IEF的基本原理是，在电泳槽中放入两性电解质，如脂肪族多氨基多羧酸（或磺酸型、羧酸磺酸混合型），pH 范围有3～10、4～6、5～7、6～8、7～9和8～10等。电泳时，两性电解质形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，正极为酸性，负极为碱性。蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中进行电泳。样品可置于正极或负极任何一端。在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。当置于负极端时，因pH＞pI，蛋白质带负电向正极移动。随着pH的下降，蛋白质负电荷量渐少，移动速度变慢。当蛋白质移动到与其等电点相应pH 位置上时即停止，并聚集形成狭窄区带。因此，IEF中蛋白质的分离取决于电泳pH梯度的分布和蛋白质的pI，而与蛋白质分子大小和形状无关。 IEF的优缺点。优点：①分辨率很高，可把pI相差0. 01的蛋白质分开；②样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用。③电泳结束后，可直接测定蛋白质pI。④分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性。缺点：①电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀，克服方法是在样品中多加些两性电解质。②许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。 一、基本原理 （1）人工pH梯度：在分离蛋白质时常用一个直立的性，以蔗糖密度梯度防止对流。当两个不同pH的缓冲液互相扩散时，在其混合区间即形成pH梯度，称为“人工pH梯度”。因为缓冲液是电解质，在电场中的它的离子移动会引起pH梯度的改变，所以不稳定。 （2）天然pH梯度：这种梯度是由电流本身所引起并保持的，比较稳定，其形成过程是，当电解硫酸钠的稀溶液时，在阳极聚焦硫酸而在阴极聚焦氢氧化钠。若将一些两性电解质放入槽中，则它们在阳极的酸性介质中就会得到质子而带正电，在阴极的碱性介质中则失掉质子而带负电，这样就会受其附近的电极所排斥而向相反方向移动。设其中有一个酸性最强的两性电解质（甲），当它由阴极逐渐接近阳极的硫酸时，就会失去电荷而停止运动，（甲）所在的位置就是它的等电点，另有一个等电点稍高于（甲）的物质（乙)，当向阳极运动靠近（甲）时，它不能超过（甲），因为那里低于它的等电点。于是（乙)将带正电荷而向阴极移动，它只能排要（甲）的阴极侧。假如有很多两性电解质，它们就会按照等电点由低到高的顺序依次排列，形成一个由阳极向阴极逐步升高的平稳的pH梯度，此梯度的进程取决于两性电解质的pH值，浓度和缓冲性质。防止对流的情况下，只要电流稳定，这个pH梯度将保持不变。 （3）两性电解质互相分离的条件：上述经验甲乙两物质形成两个相邻的不同pH的等电点层，因为在它们中间不能形成纯水层，所以它们不是完全分离开的，中间部分互相扩散，互相粘连。要使两物质完全分开，中间必须有一个介于

等电聚焦电泳测定糖化血红蛋白

等电聚焦电泳测定糖化血红蛋白 沈晶晶　(北京儿科研究所免疫遗传室,北京　100045) 陈晓穗　(海军总医院中心实验科) 摘要　建立超薄层平板聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳(PA G IEF)的方法测定糖化血红蛋白(H bA1c)。取正常人及糖尿病人血97例,制成血红蛋白溶液,使用瑞典L KB公司等电聚焦电泳及激光扫描设备,用015mm 聚丙烯酰胺平板凝胶及两性载体电解质进行电泳分离,凝胶经固定、染色、脱色后,激光扫描定量。糖化血红蛋白对照组平均值x±s=5104%±1143%,糖尿病人11117%±2125%,P<0101,血糖值与糖化血红蛋白值有显著相关性,r=01936,回归方程Y=01762+01900X。该法与其他方法相比,标本用量少,分辨率高,重复性好,结果不受温度及胎儿血红蛋白(H bF)的影响。 关键词　糖化血红蛋白　等电聚焦电泳　聚丙烯酰胺　糖尿病 糖化血红蛋白(H bA1c)是血红蛋白的成份之一,生成缓慢,和血中葡萄糖浓度持续升高成正比,而和采血当时的血糖浓度并不相关。在血糖持续升高的糖尿病人,H bA1c 的含量可明显增加,因而测定其含量对糖尿病的筛选,了解病情控制情况及预后的估计均有重要意义。本文应用超薄层平板聚丙烯酰胺等电聚焦电泳测定正常人及糖尿病人共97例的H bA1c含量,得到满意结果,现报道如下。 1　材料和方法 111　主要试剂　291g L丙烯酰胺(A cr),9 g L甲叉双丙烯酰胺(B is),四甲基乙二胺(T E M ED),10g L过硫酸胺(A P),40%两性载体电解质(Am pho line)pH5～8。 112　主要仪器　2197Pow er Supp ly电源, 2117M u1ti p ho r电泳槽,2219M u ltitem p 恒温水浴,2202U ltrascan超微扫描激光光密度计,2210R eco rder 电位计式计录器。以上仪器均为瑞典L KB公司产品。 113　方法 11311　血红蛋白溶液的制备[1]　将制得的血红蛋白溶液稀释20倍,4℃备用。 11312　制胶　使用瑞典L KB公司115mm ×230mm×015mm模具及聚丙烯酰胺凝胶用薄膜,混合215m1A cr,215m l B is,01015 m l T E M ED,018m l Am p ho line pH5～8, 816m l蒸馏水,抽气3～5分钟,加入015m l A P,轻轻摇匀后灌胶,室温一小时左右聚合。11313　等电聚焦电泳　恒温水浴设置10℃,将做好的凝胶放在电泳槽冷却板上,阴阳两极分别放置蘸011m o l L N aOH和014 m o l L H epes的电极条,加样滤纸放阴极端,加样前,将已稀释好的血红蛋白溶液离心12000r m in×10m in,准确吸取30Λl,逐个滴加,每块胶板同时加标准血红蛋白溶液作为对照。电压、电流、功率分别设置2000 V、40mA、30W,电泳开始015h后取下加样滤纸,115h后,电泳结束。 11314　固定、染色(考马斯亮蓝R250)、脱色　按文献[1]方法进行。 11315　扫描定量　待胶板底色的蓝色完全脱去后,即用超微扫描激光光密度计进行扫描,测定H bA1c含量,扫描波长415nm。2　结果与讨论 211　血红蛋白溶液经超薄层平板PA G IEF 后,可分离出清晰的H bA及H bA1c带,经与标准血红蛋白对照,即可定出H bA1c带的

等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点

北京来亨科学仪器有限公司 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 1 等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点 一、实验原理 蛋白质是两性电解质，当Ph>PI 时带负电荷，在电场作用下向正极移动；当PH

北京来亨科学仪器有限公司 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 2 在电场作用下，蛋白质在此PH梯度凝胶中泳动，当迁移到PH值等于PI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带，这种分离蛋白质的方法称为聚丙烯酰胺等电聚焦电泳。 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳操作简单，电泳时间短，分辨率高。其应用范围广，可用于分离蛋白质及测定PI，也可用于临床鉴别诊断、农业、食品研究及动物分类等各种领域。随着其他技术的不断改进，等电聚焦电泳也不断充实完善，从柱电泳发展到垂直板，又继而发展到超薄型水平板电泳等，还可与其他技术或SDS-PAGE结合，进一步提高灵敏度与分辨率。 二、实验用品 （一）器材 （1）垂直管电泳槽和玻管。 （2）恒压恒流电泳仪。 （3）酸度计 （二）试剂 （1）凝胶贮液：丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml，置棕色试剂瓶中，4℃贮存。 （2）10%TEMED:取10mlTEMED,加重蒸水至100ml,置棕色瓶内，4℃贮存。 （3）5%过硫酸胺：称AP1.0g,加重蒸水至10ml，当天配制。 （4）电极缓冲液。 5%磷酸溶液：量取58.8ml85%磷酸，定容至1000ml。 2%NaOH溶液：称20gNaOH，溶于蒸馏水并定容至1000ml。