植物突变体库的构建及突变体检测研究进展_郭建秋

收稿日期:2009-12-11

基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2009CB118400)

作者简介:郭建秋(1972-),男,河南新安人,助理研究员,主要从事大豆品质改良利用研究。

E-ma il:guojianqiu.2008@https://www.wendangku.net/doc/a117032386.html,

植物突变体库的构建及突变体检测研究进展

郭建秋,雷全奎,杨小兰,马 雯,张向召

(洛阳市农业科学研究院,河南洛阳471022)

摘要:突变体是研究基因功能的重要材料,为此,介绍了创造突变体的方法,特别是理化诱变方法以及突变体的检测方法等方面的研究进展。关键词:植物突变体;构建;检测方法

中图分类号:Q319 文献标识码:A 文章编号:1004-3268(2010)06-0150-06 随着大量基因序列和EST 资料的积累,后基因组时代诞生了。功能基因组学是后基因组时代的重点研究内容,主要研究生物有机体内各种基因的生物学功能,进而了解所有基因如何协调发挥作用,完成一系列的生长发育过程。要精确了解每个基因的功能及基因间的相互作用,必须分析单个基因和多个基因的突变表型以及它们的时空表达剖面。随着新技术新方法的不断创新开发,分析鉴定基因功能的方法越来越多,并逐渐形成功能基因组学的分支学科。目前已经发展了多种分析鉴定基因功能的方法,其中最直接最有效的方法是构建饱和的基因突变体库,通过突变体分析鉴定基因功能。因此,突变体库的构建是功能基因组学的基础。为此,综述了创造突变体的方法以及突变体的检测筛选方法等方面的研究进展。1 创造突变体的方法

突变体库有不同的分类方法[1]

。按照产生突变体的方法大致可分为自发突变体库、体细胞无性系变异突变体库、理化诱变突变体库和插入突变体库4类。1.1 自发突变

自发突变是指自然条件下发生的突变,是生物变异的重要来源,是自然进化的基础。自发突变为人类提供了极有价值的研究材料。李玮等[2]

在芥菜型油菜品系L638-g 中发现了几株无致死效应的天然叶片黄化突变体,并研究揭示了该突变体的黄化机理及生物学特性。在水稻中,矮秆突变株的发

现揭开了矮化育种的序幕;细胞质雄性不育株的发现使水稻三系法杂种优势的利用成为现实;而光(温)敏核不育株的发现则为采用两系法利用水稻亚种间的杂种优势铺平了道路。但是自发突变的频率很低,在高等生物中,大约10万个到1亿个生殖细胞中才会有1个生殖细胞发生突变,且许多突变通过表型无法鉴定而丢失,很难进行系统收集。即使获得了感兴趣的突变株,要分离突变基因并进一步鉴定其功能也是相当困难的,因为自发突变体的遗传背景非常复杂。

1.2 体细胞无性系变异

体细胞无性系变异是组织培养中的普遍现象,泛指在细胞、组织和器官培养过程中,培养细胞和再生植株中产生的遗传变异,又可细分为自发无性系变异和诱发无性系变异。体细胞无性系变异的产生没有种属特异性,出现的频率一般比较高[3,4]。其变异频率随培养时间的延长而提高,且结合化学诱变和利用选择压力进行细胞突变体筛选可实现一定程度的定向诱变[5-7]。植物通过体细胞无性系变异,可产生一系列有益的新性状,对植物品种改良和选育新品种具有重要意义。但近年来的遗传转化实践表明,经历组织培养和再生阶段后,常表现出一些非目的性状的变异,其原因属体细胞无性系变异还是外源基因的插入诱变,往往很难确定[8]。体细胞无性系变异已在农作物的育种中广泛应用,并已获得了抗逆、可遗传的新品系[5]。赵成章等[9,10]从水稻幼胚愈伤组织中,筛选出一些早熟、矮秆、千粒重高

的新品系。孙立华等[11]

获得了抗水稻白叶枯病的

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水稻新品系。凌定厚等[12]得到了抗胡麻叶斑病的水稻品系。林定波等[13]曾以脯氨酸作为选择压,筛选到了抗寒的柑橘植株,其抗寒性比对照显著增加,并发现抗寒植株叶片中脯氨酸、亮氨酸和精氨酸的含量均比对照增加2倍以上。在草坪草育种上也有应用,如Sm ith和Quesenberr y[14]利用体细胞无性系变异的方法获得了红三叶的新种质资源,其再生能力显著提高;Cro ug han等[15]获得了狗牙根的新种质Br azos-R3,对秋季黏虫Sp odop ter a f r ug i-p er da具有显著抗性。体细胞无性系变异的显著特点,一是变异频率高,一般为1%~3%,最高可达25%~100%;二是致死和不利的变异频率低;三是嵌合体的发生率相对较低,变异稳定快;四是性状变异广泛[3]。体细胞无性系变异的遗传基础主要包括染色体畸变[16,17]、基因突变、基因扩增和丢失、DNA 甲基化[18]和转座子激活[8,19]等方面。

此外,重组自交系(RILs)、双单倍体群体(DH)和近等基因系(NILs)等群体中也可找到可供利用的突变体,在基因功能鉴定上也具有重要的应用价值。

1.3 理化诱变

1.3.1 化学诱变 化学诱变是用化学诱变剂处理植物材料,以诱发遗传物质的突变,从而引起形态变异,然后根据育种目标,对这些变异进行鉴定、培育和选择,最终得到目标变异株。目前最常用的化学诱变剂是甲基磺酸乙脂(EM S)。陈忠明等[20]利用EM S处理水稻93-11,构建了包含271个家系的突变体库。Lee等[7]已在水稻上获得14000个EM S突变群体。魏玉昌等[21]用不同浓度的化学诱变剂EM S处理大豆合子,M2出现的突变类型较多,比较明显的有晚熟、黄化、矮化、半不孕等类型。王瑾等[22]用EM S处理抗旱性差的小麦品种豫麦49号和周麦17的花药愈伤组织和幼胚愈伤组织,得到13株抗旱突变体。

1.3.2 物理诱变 在辐射诱变育种的半个多世纪发展过程中,采用的辐射技术和方法越来越多。辐射源由X射线、 射线、热中子、激光发展到离子束、空间诱变等。

电离辐射主要包括 射线、X射线、中子等,其中应用最多的是 射线和X射线。这些射线由于能量高、穿透力强,可以使原子的内层电子激活释放,致使原子呈离子化而可与其他原子或分子结合,造成共价键断裂,形成染色体结构变异。研究表明,染色体结构断裂的数量与离子化射线的剂量呈正相关,常见的结构变异主要是易位、倒位和缺失。 射线诱变效果稳定,诱变当代效果直观,现在许多试验中已经把 射线诱变作为与其他诱变方法比较的标准。但是由于实际操作中,辐射的剂量往往难以控制,导致试验效果的重现性较差。曹雪芸等[23]分别用X射线和 射线处理原冬6号、京冬8号和北京411等3个冬小麦种子,在后代中得到了矮丛、育性、穗型、芒性、穗长、株高、蜡质、生育期等多种突变类型。夏璐等[24]分析由 射线诱导形成的质粒突变体的laz Z基因序列,发现碱基变异类型主要是颠换,且变异位点的分布不是随机的。

研究表明[25],热中子处理对大豆休眠种子的后代诱发突变较 射线和 射线的处理要丰富些,且突变率高,对早熟综合产量性状籽粒化学品质等均有独特的效果。张圣君[26]用快中子、热中子、电子束分别处理8个水稻品种的种子,确定了3种诱变因素对水稻的半致死剂量和致死剂量,并从中选育出有价值的一些新品种(系)。郭玉红等[27]用热中子照射杂交后代育成5个大豆新品种,其中黑农31及黑农32脂肪含量为23.1%和22.9%,为黑龙江省少有的大豆高油品种。

激光是一种相干性很强的单色射线,通过显微聚焦,激光微束可以聚焦成微米级光点,能准确地照射到事先选择好的细胞某一特定部位或某一细胞器,使细胞器或细胞组织产生选择性损伤或进行显微手术而不损伤临近部位的细胞器或组织,从而达到某一特定的研究目的。激光诱变育种在国外从20世纪60年代开始,美国、苏联、澳大利亚、加拿大等国家研究较早,苏联育出早熟,含糖量、Vc含量、胡萝卜素均高的番茄新类型,还育出高产玉米,成果显著。我国激光诱变育种始于1972年。四川大学生物系首先进行激光处理油菜诱变育种研究,之后国内相继育成了油菜、番茄、黄瓜、菜豆、蚕豆等激光新品种[28]。刘友杰[29]用H e-Ne激光照射水稻种子,发现激光照射可诱发核基因突变,如株型、株高、粒重、品质等性状变异,并可真实遗传。伍育源等[30]采用功率密度为394mW/cm2的CO2激光照射蚕豆萌动种子,L2代植株高度、分枝数及结荚数等农艺性状均产生不同程度的变异。

离子束在生物技术上的应用是我国科技工作者开创的新兴研究领域,已成为我国自主知识产权的定向遗传育种的新方法、新途径。离子束是指一束具有能量的带电粒子放射线,具有高传能线密度(LET)、尖锐的电离峰(Br ag g峰)及低氧增比,可精

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确控制其入射深度和部位。离子束物质能量的传递特征是:离子通过物质时,在物质中的局部引起高密度的电离和激发。已有研究表明:离子注入与生物体相互作用存在峰值,在峰值范围内,注入离子与生物体相互作用是局部的、双重的和不易修复的。因此,离子注入用于植物诱变有可能在损伤轻的情况下获得较高的突变率和较宽的突变谱[31]。离子辐射与X、 、e(低LET)辐射相比在辐射生物学方面有着独特的优势:(1)离子辐射的电离密度大,是属于高传能线密度辐射(高LET),其产生的相对生物效应(RBE)也高。(2)离子辐射的能量损失在小的区域内,故剂量集中度高,因而对生物体产生的总体生理损伤较小。(3)离子辐射在物质中的射程末端产生布喇格(Brag g)峰效应(高电离密度率);此时的LET更大(其相对剂量也更大)。同时也在物体中产生质量的沉积和电荷交换作用。(4)低LET辐射(X、 、e)与生物体作用产生较多易修复的DNA 单链断裂;而高LEF辐射易产生较多的难以修复的DNA双链断裂,故其诱导的染色体畸变的有效性较低LET辐射高数倍[32]。离子注入产生的生物效应的因素与辐射不同,荷能离子注入除了具有能量沉积引起机体损伤的特征外,还具有动量传递产生的级联损伤,表现为遗传物质的原子移位、重排或基因缺失,还有沉积离子、移位原子和本底元素复合反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造成的损伤。因此,注入的荷电离子的电信号和所形成的微电场影响着生物体生命过程中的基因表达和调控、细胞内外的能量交换、物质运输、信息传递,并刺激损伤DNA的修复、生物体的生长和发育。

低能离子用于遗传育种和遗传修饰的能量一般在30~50keV,注入剂量一般为1014~1017ions/cm2。安徽省农科院利用离子束技术已育成早籼S9042、晚粳D9055、中粳63、晚粳M3122、早籼14、晚粳48和晚粳M1148共7个水稻新品种[33-36]。甄卫军等[37]将离子束生物技术应用于谷氨酸高产菌株的选育,获得了产酸率比出发菌株提高2%以上的优良菌株2株。虞龙等[38]和袁成凌等[39]分别用低能离子注入选育的Vc高产菌株和花生四烯酸(AA)产生菌,其发酵水平创国内外新高。被业内专家喻为 自维生素C二步法发酵发明以来的重大突破 。离子束生物工程菌生产花生四烯酸,发酵水平是当前国内报道的10倍,比国外高50%。

空间搭载是利用空间条件下具有高能离子辐射、空间微重力、交变磁场、超真空、超净及没有昼夜变化等物理因素,诱发植物产生变异,并选育成有利用价值的新品种。航天育种是近几年发展起来的一项植物高科技育种新技术。目前我国空间诱变的搭载方式主要有3种,即高空气球、返地式卫星和飞船搭载。高空气球的条件一般为30~40km,卫星搭载的条件一般是近地点200km,远地点470km 左右[40-43]。而飞船的搭载条件一般为近地点200km,远地点300km左右。这种条件下的大气结构、气温、空气密度、压力、磁场、辐射流均与地面有很大差异,可能引起生物发生变异。自20世纪80年代开始,我国通过返回式卫星和神州号飞船搭载植物种子的航天育种研究有近20次,先后共搭载500多个植物品种,如水稻、油菜、大豆、棉花、黄瓜、青椒、番茄等,研究了空间条件对植物种子诱变机理,并选育出一些新的突变类型和具有优良农艺性状的新品种。Tripathy等[44]研究了太空小麦的生长和光合反应,发现与地面对照植株相比,幼芽的干质量降低了25%,重力条件下植株叶的光补偿点提高了约33%,这可能是由于叶的暗呼吸速率提高造成的。H or neck[45]的研究指出,微重力是通过增加植物对其他诱变因素的敏感性和干扰DNA损伤修复系统的正常运作,从而加剧生物变异,提高变异率。许多试验证明[46],空间诱变与地面辐射处理发生的变异情况有许多类似之处,辐射敏化剂预处理能增加生物损伤。H orneck G[47]研究认为,空间辐射主要导致作物遗传物质的损伤,诸如突变、肿瘤形成、染色体畸变、细胞失活、发育异常等。H ag en[48]对植物的研究证明,空间条件尤其是高能离子具有强烈的致变作用,导致细胞死亡、突变、恶性转化,而且在微重力条件下辐射的诱变作用将会加强。

1.4 生物技术创造突变体库

插入突变技术通过将特定的外源基因引入受体细胞,并使其定向稳定地转化,从而超越物种的限制,实现了基因的交流,产生具有特定性状的转基因植物,是对传统植物育种方法的补充,也是进一步实现作物产量提高、抗性增强和品质改善的重要途径。插入突变是T-DNA或转座标签插入到基因组中后,相应位点基因的功能就可能受到抑制而产生基因敲除(kno ck out)突变体,插入元件同时又可用作标签从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。T-DNA、逆转座子标签(retrotransposo n tag ging)和转座子标签(transposon tagg ing)是构建插入突变体库的3种主要方法。常用的遗传转化方

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法主要有基因枪法、农杆菌转化法和花粉管通道法等。基因枪转化法是一种DNA的直接转化法,在小麦的遗传转化中应用非常广泛。基因枪法的主要优点是受体取材广泛,不受寄主特异性限制,转化的方法相对也比较成熟,但是由于受到基因型的限制、取材的季节性、组织培养的手段的制约以及转化效率不高等诸多问题,寻找合适的受体材料及组培方法成为提高基因枪法转化效率的关键。农杆菌侵染法广泛用于植物的转化当中,主要优点是外源基因拷贝数低,大多数单一位点整合、遗传稳定性好,但受到宿主范围的限制。自1983年至今已在烟草、马铃薯、番茄、拟南芥等多种双子叶植物上转化成功。

2 突变体的筛选鉴定方法

2.1 表型鉴定

表型鉴定是以诱变育种和基因功能研究为目的的突变体筛选最常用的方法。要求必须有能遗传的、相对于野生型有显著差异的外观性状,一般也包括逆境筛选和化验分析筛选。曹健等[49]利用空间诱变处理菜心种子,其SP2代群体性状变异频率达6.7%,通过调查植株的株高、株幅、叶长、叶宽、叶形指数,发现这些性状在株系间、单株间均有较大的差异;菜心在SP3代群体中出现性状变异频率相对下降,为1.7%,群体性状表现趋于稳定。郭玉虹等[50]用EM S、NaN3处理LF837稳定系的种子后,采用品质分析的方法从后代中筛选出2个早熟突变系,蛋白质含量分别为45 38%和45 24%,较对照提高0.92个百分点和0.78个百分点。表型鉴定的方法虽然简单易行,不需要特殊的硬件设备,但是在突变体鉴别方面的作用是很有限的。

2.2 细胞学鉴定

这个层次的鉴定一般以研究诱变的机理及诱变因素的靶标为目的,主要通过观察细胞及细胞器形态的变化、染色体异常的变化,研究诱变的作用机理和效果。张月学等[51]对卫星搭载的2种苦荬菜种子SP1代根尖细胞染色体变异进行了研究,表明,太空环境诱变处理后提高了苦荬菜种子的根尖细胞有丝分裂指数,出现了包括微核、染色体桥、染色体断片等在内的多种类型的染色体变异。

2.3 生物化学鉴定

对于数量性状的变异,往往很难区分这种变异是由遗传物质的改变造成的还是由环境造成的。可以从生理生化的角度对突变体作进一步的分析。有学者用SDS-PAGE技术从一批大豆品质突变体中筛选出3个种子贮藏蛋白发生变异的稳定突变体,并发现其中一个突变体比其野生型亲本的蛋白质谱带多一个小带,从而把该突变体和其野生型亲本区分开来。李水凤等[52]对卫星搭载后的辣椒SP1 -SP4进行蛋白质的SDS-PAGE电泳和RAPD检测分析,发现SP2代蛋白条带比对照增加了2条。陈慧选等[53]比较了突变体与其亲本的叶、茎、根过氧化物同工酶电泳图谱在谱带数量、位置、宽度和颜色深浅方面的差异,从而把突变体与其亲本区别开来。2.4 分子生物学鉴定

主要鉴定基因组中酶切位点、引物结合位点或PCR扩增产物片段大小的变化,从分子层次挖掘突变体,确定突变频率。这种方法直接从DNA水平上进行分析,因此又叫DNA分子标记。分子标记技术用于突变体鉴定的主要优点在于:突变位点直接以DNA的形式表现,在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到,不受季节环境限制。缺点是找到的突变位点可能没有相应的表型功能缺失,或者找到多个突变位点后,不能确定到底哪个位点和缺失的功能相关,只能说明诱变材料从DNA水平上发生了变化以及突变发生的频率。

分子标记检测技术大致可分为四大类:第一大类是基于DNA-DNA杂交的DNA标记技术,其代表性技术有RFLP;第二大类是基于PCR技术的DNA标记技术,其代表性技术有RAPD和SSR等;第三大类是基于限制性酶切和PCR的DNA分子标记技术,其代表性技术为AFLP和CA PS等;第四大类是基于单个核苷酸多态性的DNA标记。

化学诱变剂EM S(ethy l methane sulfo nic acid)可以诱发产生点突变。利用点突变可以精确鉴定基因的功能,在基因功能鉴定上具有独特的优势,但由于点突变不易鉴定,在功能基因组学上的应用受到限制。近年来,单核苷酸多态性(sing le-nucleo tide po lymor phism)筛选技术的成熟为鉴定点突变奠定了基础[54,56]。在此基础上,M cCallum等建立了一个用于大规模筛选点突变的方法T ILLING(targ e-ting induced lo cal lessions in oeno mes)[56,57]。TILLING利用DH PLc(denatur ed high-perfo rm-ance liquid chro matogrphy)检测异源双链核酸分子之间的错配来检测点突变,其主要步骤: 利用EM S诱发点突变; 突变后代个体DNA的提取和DNA池的构建; 根据目标基因序列设计引物扩增出感兴趣的片断; PCR片段的变性、退火,形成异

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源双链核酸分子; DH PLC检测异源双链核酸分子,获得突变池; 利用相同的方法从突变池中筛选出突变个体; 突变个体PCR片段的测序验证。M cCallum等[57]利用这种方法筛选出CM T1(chro-mom ethylase,一种DNA甲基转移酶)和CMT2的相应突变体,充分说明了这个方法的可行性。M c-Callum等[57]和Colbert等[58]已经构建了拥有10000个突变体的大规模TILLIN G筛选体系,达到1周可筛选1个基因的速度。

Eco TILLING是Comai等[59]在TILLIN G的基础上发展起来的、检测自然群体中的等位基因多态性的方法。EcoTILLIN G技术不同于T ILLING 技术之处在于:EcoT ILLING技术在构建DNA池时,向被检测的DN A中加入了等量的标准DNA (对照),所以EcoT ILLING技术可以检测自然群体中的等位基因的多态性,而T ILLING技术检测的是化学诱变剂诱发的等位基因多态性[58,59]。Eco-TILLING技术还可以高效地检测单核苷酸多态性(SNPs)、小片段插入和缺失、微卫星重复数变异等[59]。EcoTILLING技术已经广泛地应用于水稻、玉米、莲属植物、杨树、芸苔属植物等[60]的研究中。

对于转基因得到的突变体(包括Ac/Ds转座子标签法得到的突变体),由于在转基因的过程中带有各种筛选标记,如GUS、GFP、潮霉素、氨苄、除草剂等,可以利用这些标记进行转基因突变体的筛选,而且导入基因的序列已知,可以利用已知DNA序列进行PCR扩增、Southern杂交等,或者对转入基因后的目标表型变化进行筛选。

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《烟草突变体库创建与功能基因组学研究》项目内容与

附件： 《烟草突变体库创建与功能基因组学研究》项目内容与目标 一、总体要求 突变体通常指某个性状发生可遗传变异的材料，或某个基因发生突变的材料。长期以来，育种家尽力地发现和分离有价值的自然突变和变异材料。自20世纪70年代以来，γ射线和 EMS 理化诱变创制的人工突变体在遗传育种中开始应用，此后，T-DNA 插入和转座子标签等插入突变筛选突变体法的发展，大大地加快了突变体的创制步伐。水稻、番茄、油菜等作物中已建立了一系列突变体库，但烟草突变体库的创制基本没有开展。 建立烟草突变体库是烟草功能基因组学研究不可缺少的重要组成部分，是克隆和阐明烟草重要功能基因的基础和前提。随着烟草饱和突变体库的建立，可望直接获得突变基因的序列信息并确证基因序列与功能的关系，从而促进烟草重要功能基因的克隆鉴定。 利用理化诱变技术创制烟草突变体库本身也是一种传统的育种技术，通过筛选突变体，可望获得一系列性状特异、能稳定遗传、有利用价值的烟草育种材料，直接应用于新品种选育。 二、招标项目内容与目标

（一）攻关内容。 1．利用EMS、快中子诱变创建二倍体烟草（绒毛状烟草）、四倍体普通烟草的饱和突变体库。 2．利用逆转座子Tto1和Tto2创建四倍体烟草插入标签突变体库。 3．建立基于Tilling技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 4．建立基于PCR技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 5．建立基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 6．在建立功能基因克隆验证体系的基础上，对突变体进行初步的遗传分析并对重要农艺性状相关基因进行表达特性和功能分析。 （二）攻关目标。 1．创建烟草饱和的突变体库4个（二倍体、四倍体突变体，EMS突变体和快中子突变体），突变体数达8万个；逆转座子标签突变体2万以上。 2．建立基于Tilling技术、基于PCR技术、基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系并进行重要基因的克隆与功能鉴定。 3．阐明控制亚硝胺、钾含量、抗病等重要农艺性状的基因3个以上，获得低亚硝胺、高钾含量、高抗病的育种材料10个以上。

利用转座子建立细菌单基因突变株库的策略和方法[1]_图文_百.

平板上的转座突变株机器自动挑蓖落 ?-————-----—-畸到38好L板上培养转到96孔板上 ?-—__—_____--—’进行P僳 I 转另一个板I 山

l 转另一个板l 山 戬.gsT分析数据整理 ●÷————————————一●}--—---————-—一 图1建立转座子突变株库的技术路线 子在铜绿假单胞菌PA01基因组中的转座插入采样数不符合泊松分布,虽然如此,但毕竟在最终还是获得了一个近饱和的突变株库。而Garsin(71等在构建粪肠球菌的Tn917转座插入突变株库时发现,测序的8865个Tn917转座突变株突变基因只对应了610个不同的开放阅读框,远远低于预期的2400个。这些结果说明使用随机性差的转座子会大大增加建库的成本。因此,有的研究利用了两种类型转座子构建突变株,这是为了防止一种转座子可能有的插入热区,而造成在基因组插入位点的随机性不佳,进而造成某些基因的突变株在筛选中漏选,而另一些基因的突变株则被多次重复筛选。两种类型转座子的使用,可以互相弥补,降低发生漏选或者重复筛选的可能性。例如在建立铜绿假单胞菌PAl4突变株库工作中,最开始采用的是Tn5来源的细菌转座子——hphoA。如前所述,尽管Tn5来源的转座子插入随机性非常好,研究者还是发现了至少一个热区(Hot spot,即gacA基因,同样也存在一些冷区(Cold spots。为了避免转座位点的选择性,研究者又采用了真核生物来源的mariner转座子,该转座子能够在很多原核生物中进行转座,而且预计与TnphoA在靶位偏嗜上存在 差异,故联合使用可以降低转座选择性;②对突变基因测定方法采用随机引物PCR的方式,以达到自动化的目的。确定突变株突变基因的方法有很多,如反向PCR等,但 这些方法的最大问题是需要人工参与,无法实现完全自动化测序,从而使确定突变基因的工作几乎不可能完成。而随机引物PCR的方法可以采用机器自动化 79

突变体构建

突变体构建 1.定点突变：快速，高效，简便 设计原理：引物与模板链退火，pfu DNA聚合酶合成突变链。DpnⅠ酶体外降解非突变型质粒模板（甲基化质粒模板） 设计引物： 引物包含5’端重叠区和3’端延伸区。 引物长度：除突变点之外，两条引物的长度大约为30个核苷酸，5’端重叠区包含15-20个碱基，3’端延伸区包含至少10个碱基。 突变引物：突变点位于两条引物上，分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区；反向突变引物5’端。 退火温度的计算不包括突变碱基。如图： 5’’3’-TACTGGTACTAATGCGGTTCGCGC G 延伸区重叠区 2.嵌合型突变体的构建： 将一个基因与另一个基因，互换构建嵌合型突变变体，可以通过overlapping PCR的方法获得。 ●原理： 比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。 A的序列为5-atgcatgctagctagaacgct acgctgactaccccctgatc-3， B的序列为5-atgctagtagctagcccccc cc aggggataattttttaaaacg-3。 ●首先我们要设计引物，假设引物的序列为： A1:5-atgcatgctagctagaacgct-3 A2:5-ggggggctagctactagcat gatcagggggtagtcagcgt-3 B1:5-acgctgactaccccctgatc atgctagtagctagcccccc-3 B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3 （设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。） ●步骤： （1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因 （2）回收A，B基因 （3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。

拟南芥突变体购买流程-完全图解

最近要购买一批拟南芥突变体，想请教有经验的虫友购买拟南芥突变体的具体流程，例如我需要一个APETALA1的突变体，应到哪个网站进行搜索，怎样进行选择订购，越具体越好，有截图就更好了，谢谢大家了！ Step 1. 打开NCBI主页：https://www.wendangku.net/doc/a117032386.html,/ 打开的页面如下： 如下 得到如下页面：

进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图： 记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：https://www.wendangku.net/doc/a117032386.html,/ 点击T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：

显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：

突变体质粒构建—PCR法-2011

实验题目：突变体质粒构建——PCR 法 背景与原理： 蛋白与蛋白间，蛋白与核酸间相互作用是后基因组学研究重要内容之一，而体外突变技术则是研究这种复杂关系的一个有效手段。通过PCR 方法可向目的DNA 片段中引入任何所需的变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。PCR 定点突变迅速、高效并且重复性好，是基因研究工作中一种非常有用的手段。其基本原理可简述如下图： 本实验拟在某基因编码区（CDS ）内，通过PCR 定点突变引入一个EcoRI 酶切位点。该基因片段长724bp ，上下游分别以XhoI 和BamHI 两个酶切位点插入真核表达载体pcDNA3.1，即pcDNA3.1-CDS 。此基因内部含有一个EcoRI 酶切位点，我们通过PCR 法诱 产物I 产物II 第一轮PCR 第二轮PCR 退火 延伸 8个循环后加入 引物1/引物4

变又形成一个EcoRI酶切位点，可以通过EcoRI单酶切验证突变是否成功。具体设计如下： 仪器、试剂及药品配方： 1.仪器：PCR仪，电泳槽，水浴锅，凝胶成像仪，离心机，振荡培养箱，温箱，超净工作 台，冰箱 2.试剂及配方： 2.1试剂：DNA回收试剂盒，限制性内切酶（BamHI，EcoRI，XhoI），T4连接酶，DNA电 泳marker 2.2PCR反应体系： primex 12.5μl 模板1μl 上游引物（5μM）2μl 下游引物（5μM）2μl 水7.5μl 2.3primex配制： primex Taq酶0.125μl 10×Taq酶buffer 2.5μl dNTP（2.5μM）2μl 水7.875μl 2.4DNA电泳buffer（TAE）： 工作液（1×）储存液（50×） 40mM Tris-乙酸242g Tris/57.1ml冰乙酸

突变体鉴定

作物突变体的细胞学研究 一、突变体的初步观察和遗传分析 在某品系材料A中发现一株突变体，将其命名为M，优先将M自交，得到具有突变性状的纯系，如果为不育等特殊性状则可以采取不断回交的方式得到相应 纯系；再将M与A和另外一品系Y分别正交和反交，得到F 1世代；将得到的F 1 自交得到各个的F 2世代；将F 1 与M进行回交，分别得到对应的BC 1 世代；如果需 要，还可以继续回交得BC 2 等世代。 观察M的突变性状在自交过程中是否始终存在，则能初步判别此突变性状是否为可遗传性状； 分别统计M与A，M与Y的正反交的表型数据，分析所有正交与反交的差异，可以判别此性状是由核基因控制或者细胞质基因控制，甚至为核质互作控制； 结合M自交过程中的突变性状的遗传特性和所有F 1 突变性状，可判别突变性状为隐性或显性； 统计分析F 2和BC 1 世代的突变表型数据，可判别控制突变性状为质量性状或 者数量性状，以及质量性状中的的基因的对数。 在数据的分析过程中要充分应用生物统计的方法，如方差分析，Χ2检验等。 二、突变体的细胞学观察 核型分析原理与步骤 核型分析是指在一个物种内，对其染色体数目。结构及其它特征进行描述性分析，从而对单一染色体进行初步分析的过程。在突变基因确定为核基因后，则可以进行核型分析。 不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。因此，染色体核型分析是植物遗传性研究的重要内容。 染色体核型分析主要包括染色体长度、染色体臂比、着丝点位置、次缢痕等。染色体的长度差异有两种，一种是不同种、属间染色体组间相对应的染色体的绝对长度差异，一种是同一套染色体组内不同染色体的相对长度差异。

【WO2019205919A1】一种生物突变体库的构建方法【专利】

20 (51)国际专利分类号：(72)发明人：姜临建(JIANG,Linjian);中国山东 C12N15/82(2006.01)C12N15/85(2006.01)省青岛市黄岛区青龙河路53号，Shandong A01H5/00(2018.01)C12N15/00(2006.01)266000(CN)。 (21)国际申请号：PCT/CN2019/081654(81)指定国(除另有指明，要求每一种可提供的国家 (22)国际申请日：2019年4月8日(08.04.2019)保护)：AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG, BH，BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU， (25)申请语言：中文CZ,DE，DJ，DK，DM,DO,DZ，EC,EE,EG，ES，FI,GB， (26)公布语言：中文GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR，IS， JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC，LK，(30)优先权： LR，LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX, 201810400607.72018年4月28日(28.04.2018)CN MY,MZ,NA,NG，NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL，(71)申请人：青岛清原化合物有限公司(QING PT，QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL， DAO KINGAGROOT CHEMICAL COMPOUND CO.,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG，LTD.)［CN/CN］:中国山东省青岛市黄岛区青US,UZ,VC,VN,ZA，ZM,ZW。 龙河路53号，Shandong266000(CN)。(84)指定国(除另有指明，要求每一种可提供的地区 保护)：ARIPO(BW，GH，GM，KE，LR，LS，MW,MZ， NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),欧业(AM, (54)Title：CONSTRUCTION METHOD FOR BIOLOGICAL MUTANT LIBRARY (54)发明名称：一种生物突变体库的构建方法 (57)Abstract:Disclosed in the present invention is a construction method for a biological mutant library.The construction method for a biological mutant library disclosed in the present invention comprises:1)introducing a DNA segment to a target organism to obtain a genetically modified organism,the DNA segment being capable of expressing elements required by implementation of site-directed mutation of target DNA in the genetically modified organism;and2)culturing the genetically modified organism to obtain a biological mutant library,the organism being a sexual reproductive organism,and the genetically modified organismbeing capable of site-directed mutation of target DNA in a germ cell.According to the mutant library obtained by using the present method,organisms having the characteristics of anti-biotic stress,anti-abiotic stress,high yield,good quality characteristics,high secondary metabolite yield,etc.can be obtained by screening.Therefore,the present method has a great application prospect. ［见续页］

拟南芥突变体购买流程-完全图解

Step 1. 打开NCBI主页： 打开的页面如下： 如下 得到如下页面： 进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图：

记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找 APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：点击 T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：

显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：

我们主要是从 ABRC 订购，点击进入页面，填写要求的相关信息，万事大吉。祝实验顺利！

水稻TOS17突变体库的创建与应用

1文献综述 1.1水稻基因组学研究现状 1.1.2 水稻全基因组测序 水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮食作物之一，全世界有一半的人口食用它，水稻年总产量占世界粮食作物产量第三位，维持较多人口的生活。亚洲是世界水稻主产区，近年稻米产量占世界的90%以上，中国稻米年产量占亚洲的38%。大米作为我国主要粮食种类，在养活我国13亿人口和改善我国居民营养结构中具有举足轻重的影响。同时，水稻又以其基因组相对较小(～430Mbp)，高效的遗传转化体系，与玉米、大麦和小麦等其它禾本科作物在基因组上存在明显的共线性，而成为研究单子叶植物的模式植物。 国际水稻基因组计划(IRGSP)启动于1998年，以粳稻品种(japonica)日本晴(Nipponbare)为模式材料，由中国、日本、美国等是十个国家参与，所采用的方法为逐步克隆策略(clone by clone sequencing)，随后在2002年由日本和中国科学家率先公布了第1、4染色体的精确序列(Feng et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Consortium 2003)；2003年9月第10条染色体的全长序列由美国Clemson大学公布(Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium, 2003)。2005年8月水稻全基因组精确序列在Nature发表(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。IRGSP公布的水稻“日本晴”精确序列经过分析表明：(1) 水稻“日本晴”基因组大小为389Mb，IRGSP公布的序列能够覆盖其全基因组的95%，并包含了所有的常染色质和两个完整的着丝粒；(2) 整个基因组中包含大约37544个非转座相关基因，其中71%的基因可能在拟南芥中有同源基因；(3)通过与拟南芥基因组序列对比分析发现，拟南芥90%的基因在水稻中可能存在同源物；(4) 水稻中预测的37544个基因中，29%是属于成簇的基因家族；(5) 水稻基因组中转座元件的数目和种类与玉米和高粱基因组共线性区段的扩张是一致的；(6) 有证据证明基因能从细胞器中转移到细胞核(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。 另外的一些科学研究部门和公司也分别启动了各自的水稻测序计划。如华大基因在2005年宣布完成籼稻品种“93-11”的全基因组序列测序，其所采用的方法为鸟枪法。Syngenta公司也于2002年宣布完成了粳稻品种“日本晴”的全基

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 摘要：通过本次实验，了解了拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握了DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。实验首先提取拟南芥的DNA，将获得的DNA进行PCR扩增，将扩增好的DNA加入上样缓冲液后与DNAmarker一起进行电泳，用凝胶成像系统对凝胶进行处理，可以看到大小不同的DNA条带分离。通过这种方法鉴定出拟南芥是否为突变体。 关键词：T-DNA插入突变体、DNA提取、PCR、电泳鉴定、凝胶成像系统 1.前言 拟南芥作为生物学研究的模式植物，由于其易于种植、生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作等特点，已被广泛应用于植物学的各种基础和应用研究领域中。同时，拟南芥T—DNA饱和突变体库的建立和T-DNA侧翼序列的确定，为功能基因组学提供了丰富、有效的遗传材料。 2.实验 2.1实验目的 （1）提取植物基因组DNA的方法； （2）PCR操作方法； （3）琼脂糖凝胶分离核酸方法。 2.2实验原理 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能够转移的DNA被叫做T-DNA。 将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中没通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。

T-DNA插图到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。 用PCR方法鉴定T-DNA插入船和突变体。农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体汇总，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。 “三引物法”的原理如图1所示，即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，野生型植株目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA 本身的长度约为17kb，过长的模版会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP（或RP）为引物进行扩增的产物，分子量约为410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段），长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和900bp两种产物。上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因 型的植株。此法的有点事可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。 “双引物法”的基本原理与“三引物法”相似，即采用特异引物扩增目的基因片段和T-DNA插入片段，通过比对扩增结果进行突变体的鉴定。具体方法图2所示：首先以基因组 DNA为模版，用一对特意产物（LP和RP）扩增目的基因片段，初步鉴定出纯合突变体（图

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

姓名系年级学号日期 科目遗传学实验题目模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 摘要： 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。本次实验意在对模式植物拟南芥T-DNA插入突变体进行鉴定。实验中用到的主要实验方法有：CTAB法提取拟南芥基因组DNA、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。DNA经EB染色，EB可与核酸结合，在紫外光激发下产生荧光。现广泛应用于核酸的研究中。 引言 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。 T-DNA插入基因内部导致基因突变：T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的

植物突变体库的构建及突变体检测研究进展_郭建秋

收稿日期:2009-12-11 基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2009CB118400) 作者简介:郭建秋(1972-),男,河南新安人,助理研究员,主要从事大豆品质改良利用研究。 E-ma il:guojianqiu.2008@https://www.wendangku.net/doc/a117032386.html, 植物突变体库的构建及突变体检测研究进展 郭建秋,雷全奎,杨小兰,马 雯,张向召 (洛阳市农业科学研究院,河南洛阳471022) 摘要:突变体是研究基因功能的重要材料,为此,介绍了创造突变体的方法,特别是理化诱变方法以及突变体的检测方法等方面的研究进展。关键词:植物突变体;构建;检测方法 中图分类号:Q319 文献标识码:A 文章编号:1004-3268(2010)06-0150-06 随着大量基因序列和EST 资料的积累,后基因组时代诞生了。功能基因组学是后基因组时代的重点研究内容,主要研究生物有机体内各种基因的生物学功能,进而了解所有基因如何协调发挥作用,完成一系列的生长发育过程。要精确了解每个基因的功能及基因间的相互作用,必须分析单个基因和多个基因的突变表型以及它们的时空表达剖面。随着新技术新方法的不断创新开发,分析鉴定基因功能的方法越来越多,并逐渐形成功能基因组学的分支学科。目前已经发展了多种分析鉴定基因功能的方法,其中最直接最有效的方法是构建饱和的基因突变体库,通过突变体分析鉴定基因功能。因此,突变体库的构建是功能基因组学的基础。为此,综述了创造突变体的方法以及突变体的检测筛选方法等方面的研究进展。1 创造突变体的方法 突变体库有不同的分类方法[1] 。按照产生突变体的方法大致可分为自发突变体库、体细胞无性系变异突变体库、理化诱变突变体库和插入突变体库4类。1.1 自发突变 自发突变是指自然条件下发生的突变,是生物变异的重要来源,是自然进化的基础。自发突变为人类提供了极有价值的研究材料。李玮等[2] 在芥菜型油菜品系L638-g 中发现了几株无致死效应的天然叶片黄化突变体,并研究揭示了该突变体的黄化机理及生物学特性。在水稻中,矮秆突变株的发 现揭开了矮化育种的序幕;细胞质雄性不育株的发现使水稻三系法杂种优势的利用成为现实;而光(温)敏核不育株的发现则为采用两系法利用水稻亚种间的杂种优势铺平了道路。但是自发突变的频率很低,在高等生物中,大约10万个到1亿个生殖细胞中才会有1个生殖细胞发生突变,且许多突变通过表型无法鉴定而丢失,很难进行系统收集。即使获得了感兴趣的突变株,要分离突变基因并进一步鉴定其功能也是相当困难的,因为自发突变体的遗传背景非常复杂。 1.2 体细胞无性系变异 体细胞无性系变异是组织培养中的普遍现象,泛指在细胞、组织和器官培养过程中,培养细胞和再生植株中产生的遗传变异,又可细分为自发无性系变异和诱发无性系变异。体细胞无性系变异的产生没有种属特异性,出现的频率一般比较高[3,4]。其变异频率随培养时间的延长而提高,且结合化学诱变和利用选择压力进行细胞突变体筛选可实现一定程度的定向诱变[5-7]。植物通过体细胞无性系变异,可产生一系列有益的新性状,对植物品种改良和选育新品种具有重要意义。但近年来的遗传转化实践表明,经历组织培养和再生阶段后,常表现出一些非目的性状的变异,其原因属体细胞无性系变异还是外源基因的插入诱变,往往很难确定[8]。体细胞无性系变异已在农作物的育种中广泛应用,并已获得了抗逆、可遗传的新品系[5]。赵成章等[9,10]从水稻幼胚愈伤组织中,筛选出一些早熟、矮秆、千粒重高 的新品系。孙立华等[11] 获得了抗水稻白叶枯病的 150

转座子

转座子 科技名词定义 中文名称：转座子 英文名称：transposon;Tn 定义1：转座元件中的一种，具有完整转座元件的功能特征并能携带内外源基因组片段(单基因或多基因)。在基因组内移动或在生命体之间传播并可表达出新的表型。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；基因表达与调控（二级学科） 定义2：转座因子中的一种。除含与转座有关的基因外，还含抗药基因、抗重金属基因和接合转移基因等，可赋予受体细胞一定的表型特征。 所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 Ac-Ds转座元件 转座因子或转座子是一类在很多后生动物中（包括线虫、昆虫和人）发现的可移动的遗传因子。一段DNA顺序可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，此过程称转座。这段序列称跳跃基因或转座子，可分插入序列（Is因子），转座（Tn），转座phage。 目录

编辑本段简介 Transposon a segment of DNA that can become integrated at many different sites along a chromosome (especially a segment of bacterial DNA that can be translocate 转座子引起的插入突变 d as a whole)

转座子是一类在细菌的染色体,质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分,是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列. 转座子是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分 转座(因)子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。 复合型的转座因子称为转座子(trans—poson，Tn)。这种转座因子带有同转座无关的一些基因，它的两端就是IS，构成了“左臂”和“右臂”。两个“臂”可以是正向重复，也可以是反向重复。这些两端的重复序列可以作为Tn的一部分随同Tn转座，也可以单独作为IS而转座。 玉米“花斑”由一种转座因子的存在所导致 转座子是细菌细胞里发现的一种复合型转座因子，这种转座因子带有同转座无关的一些基因，如抗药性基因；它的两端就是IS，构成了“左臂”和“右臂”。两个“臂”可以是正向重复，也可以是反向重复。这种复合型的转座因子称为转座子(trans—poson，Tn)。这些两端的重复序列可以作为Tn的一部分随同Tn转座，也可以单独作为IS而转座。Tn两端的IS有的是完全相同的，有的则有差别。当两端的IS完全相同时，每一个IS都可使转座子转座；当两端是不同的IS时，则转座子的转座取决于其中的一个IS。Tn有抗生素的抗性基因，Tn很容易从细菌染色体转座到噬菌体基因组或是接合型的质粒。因此，Tn可以很快地传播到其他细菌细胞，这是自然界中细菌产生抗药性的重要来源。 两个相邻的IS可以使处于它们中间的DNA移动，同时也可制造出新的转座子。Tn10的两端是两个取向相反的IS1O，中间有抗四环素的抗性基因(TetR)，当TnlO整合在一个环状DNA分子中间时，就可以产生新的转座子。当转座子转座插人宿主DNA时，在插入处产生正向重复序列，其过程是这样的：先是在靶DNA插入处产生交错的切口，使靶DNA产生两个突出的单链末端，然后转座子同单链连接，留下的缺口补平，最后就在转座子插入处生成了宿主DNA的正向重复。

两种致病真菌(Botryosphaeria dothidea和Alternaria alternata)T-DNA突变体库的建立与分析

两种致病真菌(Botryosphaeria dothidea和Alternaria alternata)T-DNA突变体库的建立与分析由葡萄球座菌(B.dothidea)及链格孢(A.alternata)引发的病害在世界范围内流行,也是影响我国水果生产的两大主要病害,给我国水果生产造成巨大的经济损失。目前,对于该两种病原菌的研究仍处于初级阶段。虽对AM毒素(AM-toxin)合成基因的研究取得一些进展,但对其他相关基因及功能的研究仍较为缺乏。 农杆菌介导的T-DNA随机插入突变法是目前应用于植物和真菌基因功能研究中常用且有效的方法。为能够尽早的揭示B.dothidea及A.alternata与寄主之间的互作关系,开展致病相关基因的研究,本研究旨在建立农杆菌介导的 T-DNA转化体系,初步构建起两种致病菌的突变体库,并对部分突变体菌株进行 分析,以获得一些性状差异显著的菌株。主要结果如下:1.成功构建了农杆菌介导的B.dothidea原生质体遗传转化体系,转化效率为220株/106个原生质体;筛选获得901株突变体,初步建立了B.dothidea突变体库,PCR验证eGFP基因及抗潮霉素B基因均成功整合到B.dothidea基因组中。 2.对120株突变体菌株表型分析发现,4 3.3%的突变体菌株色素沉积加 深,14.2%的菌株色数沉淀减弱;对其生长速率测量发现,59.3%的突变体菌丝生长速率加快,仅有6.2%的菌丝生长速率有较为明显的减慢。3.对500个突变体菌株致病性检测,筛选获得16株致病性明显减弱的菌株,占供试突变体菌株的3.2%。 4.构建了链格孢苹果致病型农杆菌介导的孢子转化体系,优化了转化程序,以培养36-48 h所产孢子4℃处理6 h用于转化,转化效率为200株/106个分生孢子。 5.筛选获得880个突变体,初步构建起链格孢苹果致病型XP-1菌株突变体库,通过PCR检测及Southern blot杂交分析,抗潮霉素B基因成功整合到病原菌的

突变体在农作物改良中的应用

突变体在农作物改良中的应用 摘要从六十年代以来，利用诱发突变直接培育成农作物新品种已在国内外取得较快的发展。人工诱变已成为育种学家创造新的种质资源的重要途径，有效地促进了农作物新品种选育工作的发展。作物遗传改良离不开突变体的创造，本论文主要介绍筛选、诱导及在农作中的应用等。 关键词突变体育种诱导 21世纪是我国面临挑战的时期，人口增多，耕地减少；干旱严重；水灾频繁；环境污染；病虫害严重等等一系列的问题都需要我们一起解决。然而最基本的是如何生产出高效优质的产品来满足大家的需求，只有通过改变植物的遗传特性，才能让其生产出高效、优质的产品。本论文就是介绍用突变体来改良作物的遗传特性。改良作物的遗传特性，以培育高产优质品种的技术，又称作物品种改良。它以遗传学为理论基础，并综合应用植物生态、植物生理、生物化学、植物病理和生物统计等多种学科知识。作物的改良方法可以利用植物的遗传转化、原生质体融合与体细胞杂交、体细胞无性系变异。突变体就属于体细胞无性系变异。 1.突变体材料的选择[1] 1.1选择的要求 在分离突变体时，植物细胞材料的选择是非常重要的。首先应该用优良的、仅少许性状需要改进的基因型；其次，应该避免采用不能再生或难以再生的材料；最后，选用染色体数稳定的细胞系。在许多情况下所用材料的倍性水平也是研究者考虑的一个方面。从理论上讲，单倍体材料是较理想的，它不仅对筛选隐性突变体有利，而且，对显性突变体的选择也具有意义；另外，单倍性材料还能通过加倍形成纯合二倍体，但其遗传不稳定也影响了它的使用。 1.2材料的种类 目前用于分离突变体的细胞材料有：愈伤组织培养物、细胞培养物、原生质体培养物等[2]。 1.2.1愈伤组织是分离突变体的最简单的细胞材料，但也具有许多不利因素，如培养物相对生长速率较慢，由于处于表面的少部分细胞材料能够直接接触到培养

水稻突变体介绍及鉴定(很详细)

RMD水稻突变体信息及基因型鉴定 1.背景介绍： 突变体对于遗传学研究有着重要作用，随着拟南芥和水稻等物种全基因组测序的开展，人类积累了前所未有的基因序列信息，为了弄清这些基因序列的生物学信息，寻找该基因区段序列发生变异的突变体是阐释基因功能最直接最有效的方法。 植物在自然的环境条件下也会产生突变性状，早期普通正向遗传学研究往往通过寻找与某种生物学特性相关的突变体来发掘或定位某个特定基因。为配合植物功能基因组研究高通量的策略，构建水稻等物种的大型突变体库已成为必然，借助水稻全基因组测序信息、通过反向遗传学的手段大规模地筛选突变体库，理论上可以获得基因组中任一基因的突变体，最终实现阐释基因功能的目的。 2.原理： 2.1农杆菌介导的T-DNA 插入 农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤和毛状根的发生。1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid），简称Ti 质粒。Ti 质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。 研究发现，T-DNA 两端存在非常保守的同向重复的25bp 序列，分别称为左边界（LB）和右边界（RB）。T-DNA 的转移只与边界序列相关，尤其是RB，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关。我们将T-DNA 区段上的致瘤基因和其它无关序列去掉，利用其转移的特性，实现农杆菌介导的T-DNA 转入水稻愈伤，从而构建水稻突变体库。大量研究表明，农杆菌T-DNA 整合到植物基因组中的位置是随机的，并且整合到植物基因组中的T-DNA 能稳定遗传。由于插入到植物基因组中的T-DNA 区段序列已知，这样随机插入到植物基因组中的T-DNA 类似于给植物基因“贴”了一个序列标签。我们利用这个标签，通过各类PCR技术最终可以获取其插入的位点。 2.2 水稻Tos17 反转录转座子 创造水稻突变体的另一种方法是利用植物的反转录转座子，它们是以DNA→RNA→DNA 的方式进行转座，在水稻上已发现大约40 种长未端重复的反转录转座子，它们是Tos1-Tos32，RIRE1-RIRE8，其中5 类被证明是有转座活性的，分别是Tos10、Tos17、Tos19、Tos25 和Tos27。这些反转录转座子只有在组织培养条件下才具备转座活性，其中Tos17 的转座活性最强，容易插入到富含基因的区域，因此可以直接用于创造插入失活的突变体库。利用含有Tos17 插入的水稻突变体库，可以进行突变性状的筛选， T os17 反转录转座子正成为水稻功能基因组研究的一个有力工具。由于Tos17 反转录转座子为水稻内源的转座子，不需要进行转基因的过程，而且平均每株含有8 个Tos17 个拷贝，在正常情况下能够稳定遗传，因此Tos17 转座子突变体库是水稻功能基因组研究的一个有用资源。但也有研究表明，Tos17 在转座过程中

8.突变体的诱导和选择(植物组织培养)

第八章突变体的诱导与选择 一、突变体选择的概念 组织培养筛选突变体（mutatin)方法，又称离体筛选。一类细胞组织培养过程中表现出的变异，Larkin和Scowcroft（1981）首次将这种变异称体细胞无性系变异（somaclonal variation);另一类在培养基中加选择压（化学物质）诱导产生变异，具有定向突变特征。 植物细胞工程目前分为五个分支：脱毒与快速繁殖、细胞的大量培养、体细胞杂交、细胞遗传转化及产生转基因植株、无性系变异与分离突变体。 前两者主要利用遗传自动调节，本身遗传潜力进行繁殖；后三者则主要利用遗传变异，创建新种质。 离体筛选的优点： 离体筛选突变体的可控程度高，便于进行定向选择。 突变频率高，筛选群体大，在较小容器中可操作百万到千万个植物细胞。 与种子、芽体比较，细胞水平突变重复性、稳定性好。 离体筛选的意义： 对农作物形状进行遗传改良；为细胞杂交和转基因技术提供选择标记，如互补选择；对突变体细胞进行遗传及生理代谢研究。突变是遗传变异性的终极来源，它为种群变异提供原材料。是体现生物多样性和适应多变环境的重要方式。 二、变异的类型 1、农作物的品质改良 2、抗病突变体 3、抗除草剂突变体：要得到抗除草剂新品种可通过突变体筛选途径，也可通过转基因技术的达到。 4 抗逆突变体 三、变异的来源 1 .离体培养细胞的自发突变 组织培养后植株变异的原因：源植株中预先存在的变异表达；组织培养过程中引起的可遗传的变异；植株的再生方式、生长调节物质、继代培养的时间；由外源遗传及生理作用引起的变异 植物的细胞、组织、在离体培养时，由于环境条件可以人为控制和培养基中化学因素的影响，会发生各种各样的变异，外植体体细胞发生的变异称为体细胞变异 体细胞无性系变异的特征表现在：随机性，无法精确地分批重复。再生植株的遗传变异性广，包括染色体变异畸变，点突变，DNA序列的扩增、缺失和转座，以及线粒体和叶绿体基因组的改变等。 2. 人工诱发突变 物理方法：主要有X射线，r射线处理，32P、14C等。有时用热中子或快中子处理。物理诱变的好处是，使用方便，干净，穿透力强，重复性好，突变频率高，但需专门的设备。 化学诱变：在组织培养中常用化学诱变剂处理，好处是不需专门设备，操作方便，由于处理的材料是组织块、细胞团、游离的单细胞或原生质体，因此可以在一定程度上克服化学诱变剂穿透力差的缺点。所以对培养组织进行诱变，目前较多采用化学诱变剂。用各种诱导剂处理可以提高突变频率10～100倍，下面介绍植物组织培养诱变中常用的诱变剂的种类： 烷化剂（烷化剂是栽培作物中诱发突变极其重要的一类化学诱变剂）、亚硝基胍（是已知的最强的化学诱变剂）、叠氮化物（是在常规诱发突变中对植物诱变效果最好的一种诱变剂） 四、突变体的选择方法 1.直接选择法 通常是把细胞培养在一种亲本细胞不能生长的培养基上，或亲本细胞死亡的培养基上，即施加选择压。经诱变或未经诱变的培养组织都可用增加选择压抑制未突变细胞生长的化学物质的方法进行选择。在培养基中施加不同的选择压可以对所需要的性状进行定向选择。 2.富集选择法 在选择突变体中，确定抑制物浓度的原则是：①如果筛选对抑制剂的抗性比起始材料高许多倍的突变体，可直接利用比较高浓度的抑制剂，它这样可以缩小寻找的范围。此方法存活率极低，只要存活，便是高抗突变体。②如果需中等程度抗性的突变体，或估计只能找到这种突变体时，就选用较低浓度的抑制剂，在抑制剂浓度下能正常生长的组织继续进行培养分化成植株，就会得到所需要的抗性突变体。 在离体筛选时，由于生理上的适应性，在选择因子作用下生存下来的细胞和愈伤组织有时并未发生突变，当选择因子消失时，这种抗性也随之消失，也就是修饰变异，为了消除这种修饰变异，获得遗传性的突变，离体筛选时对选择对象（细胞或愈伤组织）原则上需要在选择压的作用下反复进行加强性的处理。