水稻TOS17突变体库的创建与应用

1文献综述

1.1水稻基因组学研究现状

1.1.2 水稻全基因组测序

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮食作物之一，全世界有一半的人口食用它，水稻年总产量占世界粮食作物产量第三位，维持较多人口的生活。亚洲是世界水稻主产区，近年稻米产量占世界的90%以上，中国稻米年产量占亚洲的38%。大米作为我国主要粮食种类，在养活我国13亿人口和改善我国居民营养结构中具有举足轻重的影响。同时，水稻又以其基因组相对较小(～430Mbp)，高效的遗传转化体系，与玉米、大麦和小麦等其它禾本科作物在基因组上存在明显的共线性，而成为研究单子叶植物的模式植物。

国际水稻基因组计划(IRGSP)启动于1998年，以粳稻品种(japonica)日本晴(Nipponbare)为模式材料，由中国、日本、美国等是十个国家参与，所采用的方法为逐步克隆策略(clone by clone sequencing)，随后在2002年由日本和中国科学家率先公布了第1、4染色体的精确序列(Feng et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Consortium 2003)；2003年9月第10条染色体的全长序列由美国Clemson大学公布(Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium, 2003)。2005年8月水稻全基因组精确序列在Nature发表(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。IRGSP公布的水稻“日本晴”精确序列经过分析表明：(1) 水稻“日本晴”基因组大小为389Mb，IRGSP公布的序列能够覆盖其全基因组的95%，并包含了所有的常染色质和两个完整的着丝粒；(2) 整个基因组中包含大约37544个非转座相关基因，其中71%的基因可能在拟南芥中有同源基因；(3)通过与拟南芥基因组序列对比分析发现，拟南芥90%的基因在水稻中可能存在同源物；(4) 水稻中预测的37544个基因中，29%是属于成簇的基因家族；(5) 水稻基因组中转座元件的数目和种类与玉米和高粱基因组共线性区段的扩张是一致的；(6) 有证据证明基因能从细胞器中转移到细胞核(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。

另外的一些科学研究部门和公司也分别启动了各自的水稻测序计划。如华大基因在2005年宣布完成籼稻品种“93-11”的全基因组序列测序，其所采用的方法为鸟枪法。Syngenta公司也于2002年宣布完成了粳稻品种“日本晴”的全基

因组序列测序。

随着目前水稻基因组已测序完成，以及构建了水稻高密度的遗传图谱和高质量的物理图谱(Chen et al., 2002)。同时获得了超过25万条来源于水稻不同组织的ESTs及28000条全长cDNA序列(Kikuchi et al., 2003)。人们对有益基因的定位、克隆、转移和聚合越来越关注。因此，可以说对水稻生命科学的研究步入到后基因组时代即对基因功能大规模研究的时代(Jeon et al., 2000)，其核心内容是植物功能基因组学。因此，接下来的任务就是利用水稻功能基因组学，诠释全基因组测序所获得的遗传信息，分析基因的功能。

1.1.3 基于突变体的水稻功能基因组研究

目前来讲克隆分析基因最有效的方法，就是利用突变体来研究分析基因的功能。其基本原理是通过破坏植物基因内部或邻近位点，造成基因的突变。然后再利用各种方法分离被破坏的基因。目前构建饱和的基因突变群体，通过突变体分析鉴定基因已经成为最直接最有效的方法。在水稻测序完成之前，植物学家利用一些自然产生的突变体及利用物理和化学等方法产生的突变体，克隆了一些控制水稻重要农艺性状的基因(Yoshimura et al., 1996; Yoshimura et al., 1998; Yano et al., 2000)，但自然界自发产生的突变很少，频率仅有10-5。所以目前有很多的方法通过人为的手段提高突变频率，满足与构建大规模饱和突变题库的需要。目前大规模构建突变体库的主要的方法有：物理和化学诱变法，T-DNA、转座子及反转绿转座子插入突变等。

1.1.3.1 物理和化学诱变

物理和化学诱变主要是利用一些物理和化学的手段如快中子(Fast neutron)、伽玛射线(Gamma ray)、双环氧丁二烯(Diepoxybutane, DEB)、甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS) 等方法处理种子，然后通过播种处理的种子来筛选突变表型。快中子轰击法是物理方法中被认为是非常有效的一种方法，快中子轰击往往导致基因组片段的缺失。而以EMS诱导为代表的化学诱变的方法，往往导致DNA中的碱基转换，如G到A的转换。物理和化学诱变的方法非常简单，快速和经济且不存在组织培养或遗传转化汇总基因型的限制，被广泛应用于大型突变体库的创建，如Li等(2001)利用Deletegene系统，在水稻中构建了含24,660个快中子轰击群体，筛选到5个基因位点，得到一个位点发生缺失的突变体。而使用EMS作为化学诱变剂同样也可以得到遗传稳定的点突变体，而且已经被广泛

用于水稻等植物诱变育种。但是物理和化学的方法处理得到突变体，只能通过图位克隆的方法克隆基因，需要构建庞大的克隆群体，精细的遗传图谱，费时费力，无法适应大规模筛选鉴定突变体的要求。

1.1.3.2构建插入突变体库

利用T-DNA、转座子和反转录转座子等插入元件，通过插入元件插入到植物基因组中，是植物基因不能正常的转录和翻译，达到破坏基因的效应产生突变体，而且可以通过插入元件很容易找到被插入元件的位点，目前构建插入突变体是最有效的构建大规模饱和突变体库的方法。

元件的插入效应是多样的。Krysan等(1999)探讨了元件插入到植物基因组中后引起的靶位点基因功能的变化的几种情况：当插入元件插入到靶位点基因的编码区或启动子区就有可能使被插入的基因功能完全敲除，产生功能缺失性的突变体，即无义突变(null mutant)；当插入到启动子或3’端的非翻译区就有可能使靶位点基因表达量下降；当元件接上一个35S的启动子的时候，插入到基因的启动子区域，就可以使基因表达量上升；当插入基因编码区时，还有可能无法看到表型的缺失，因为高等植物中存在大量基因冗余的现象，突变基因的功能被其它同家族的基因补偿；在植物基因组内部存在多个拷贝的元件插入是，有可能多个基因被同时敲除掉，使多个基因同时失活；元件的插入还有可能导致插入位点附近的染色体重排的现象，本实验室张健同学的一个突变体就是由于插入位点附件的染色体重排，而引起植物出现一个不育的突变表型（私下交流）。

图1.植物基因组中中由T-DNA插入引起靶基因表达的不同效应（Kryson et al，1999）

Fig1. The insertion of a T-DNA into a plant genome chromosome can lead to many different outcomes

T-DNA(Transferred DNA)是农杆菌(Agrobacterium)的Ti质粒(Tumor-inducing Plasmid)上一段DNA序列，它可以从农杆菌中转移并稳定的整合到植物核基因组当中。农杆菌介导的T-DNA转化技术已被广泛的应用于构建拟南芥和水稻的插入失活突变体库(Azpiroz-Leehan and Feldmann, 1997)。如在拟南芥中已经建立饱和的插入突变体库(Alonso et al., 2003)。随着水稻粳稻的高效遗传转化体系的建立(Hiei Y et al., 1994)，水稻中的T-DNA插入突变体库开始大量建立如本室已经建立了超过120,000个含有T-DNA标签的独立的转化子，平均每个突变体含有约为2.0个T-DNA拷贝，并且能稳定遗传(Wu et al., 2003)，并且通过对突变体的筛选，克隆到了一系列的重要基因如RID1(Wu et al., 2008)。而其它的一些研究机构也纷纷建立了大型的T-DNA插入突变体库，如韩国的POSTECH研究所，法国的Genoplant研究所。T-DNA在拟南芥中的插入被认为是一个随机的过程(Sallaud et al., 2004)，而在水稻中的插入则存在热点，如比较倾向于插入水稻中较大的染色体，倾向于插入远离着丝粒的区域，倾向于插入基因区，在基因的间隔区插入比较均一，倾向于插入基因编码区(Zhang et al., 2007)。而且T-DNA

插入也有一些缺点如：可能会引起插入位点的重排、插入过程中T-DNA的边界序列容易缺失，并且组织培养容易激活其它元件如Tos17。

Tos17是水稻中的一个内源性的反转录转座子，全长4114bp，在栽培稻中含有1-5个拷贝(Cheng et al., 2006)，并且在日本晴中有两个原始拷贝，一个位于第7染色体上，具有转座子活性，另一个位于第10染色体上，没有转座子活性活性，而现在认为第10染色体上一段20bp的碱基缺失，造成其转座活性的缺失。Hirochika 等(1996)在1996年发现了15个水稻品种“日本晴”中的反转录转座子，其中Tos10，Tos17，Tos19在组培的条件下被激活，经过详细研究后发现Tos17具有以下特点：1.Tos17在组培的条件下激活，分化成植株后失活，因此Tos17插入引起的突变可以稳定遗传；2.Tos17的拷贝数随着组培的时间而增多，经5个月的组培后，可平均产生10个拷贝，可以通过组培时间的长短来控制转座的拷贝数；3.突变体产生过程不涉及转基因。4.Tos17是水稻内源性的反转录转座子，因此在插入植物基

因组内部时，一般不会产生片段的缺失和改变，而且相对于T-DNA，Tos17突变体的侧翼序列的分离相对容易。因此Hirochika认为Tos17很适合用来构建插入突

变体库。并构建了超过50,000个独立的再生植株，大约含有500,000个插入位点，并对M2代突变产生的表型进行了详细的分类(Miyao et al., 2003; 2007)，发现后代中大约50%的家系出现至少一个突变表型，在田间出现最多的表型是不育和矮化。但是Tos17突变体库也有一些缺点如其插入的拷贝数多，对以后的遗传分析不利；其产生的突变体只有10%是真正由Tos17的插入引起的，其余的突变体是在组培

的情况下或是由其它的未知的转座子专座产生的。

Miyao等(2003)通过大量的Tos17的插入位点的分析发现，Tos17在水稻中的插入事件并不是一个随机的过程，存在热点，Tos17偏向于插入水稻中的较大的染

色体，且插入密度和染色体大小高度相关。在染色体两端分布较多，在着丝粒附近和染色体中部分部较少。偏向于插入基因区，而极度不偏向插入转座子相关基因和基因间隔区以及基因调控区。偏爱于插入基因的编码区。并且偏爱于“Motor”, “Signal transducer”, “Transcription regulator” “Transporter”等4类功能基因（Miyao et al., 2003; Piffanelli et al., 2007），因此利用Tos17比较容易获得饱和突变体库。

Ac/Ds转座子是McClintock于1948年在玉米中发现的。Ac是具有自主转座活性的元件，Ds是没有自主转座活性，需要Ac元件提供转座酶。因为Ac元件具有自

主转座活性，因此产生的突变遗传不稳定，不利于基因的分析，而Ds元件本身

没有转座活性。因此人们提出了双组分系统。将Ac和Ds分别导入不同的植株，Ac经过了改造只能提供转座酶而无法转座，通过杂交的方法，将Ac元件导入含

有单拷贝Ds的植株中，使Ds元件转座，然后再自交筛选不含Ac元件的后代。从

理论上讲Ac/Ds元件是最理想的水稻插入突变体构建体系。产生的突变体通常是Ds元件的单拷贝的插入，大大方便了突变体表型的分析和基因的鉴定；Ds可以

在导入转座酶的情况下重新转座，验证突变是由Ds的插入引起的；Ac/Ds双因子系统可用于转基因效率较低的籼稻品种，因为突变体是从Ac转座酶株系和Ds植

株的有性杂交后代中筛选的，不需要大量的转基因工作；但是Ac驱动下的Ds可

能发生的多次跳动所形成的痕迹(footprint)也可能影响突变表型的分析。

1.1.3.2 构建Gene Trap突变体

利用插入元件构建插入突变体同样存在一定的缺点，如：插入元件插入到一些植物生长发育的关键基因时，往往会导致插入致死；而且植物基因组存在大量是功能冗余的基因，敲除掉一个基因并不能产生表型的变化。针对这些情况人们通过对T-DNA进行一定的修饰，利用不同的原理进行基因功能研究。

Gene trap系统是基于报告基因的表达模式而研究外源DNA插入位点基因的表达及其功能的方法(Campisi et al., 1999; Jeon et al., 2000)，主要有三种类型：Enhancer trap，Gene trap和Promoter trap。在Enhancer trap 中，报告基因连接了一个小型的弱启动子，这个启动子通常包含一个TATA box 和一个转录启始位点，它并不能独立启动报告基因的表达，但是可以被邻近的增强子所激活。Promoter trap 和gene trap的报告基因不含启动子，因此只有当插入位点在转录单位内部并且位于正确的起始位点时报告基因才能表达。Promoter trap的报告基因的表达要求它插入到一个外显子中，从而形成一个可以转录的融合基因。Gene trap 中的报告基因安装了一个或几个剪接受点，因此即使报告基因插入到内含子中也能得到表达。相比而言，Enhancer trap中报告基因表达不像Gene trap和Promoter trap 那样需正确方向插入，所以报告基因表达频率相对要高。但Enhancer trap存在远距离激活基因表达，不如Gene trap和Promoter trap容易鉴定和分离基因。本室已利用修饰的酵母转录因子GAL4/VP16成功地构建了水稻的Enhancer trap系，并且检测到报告基因GUS在各种组织中的表达率为25-59%(Wu et al., 2003)。Ito

等(2002)利用Ac/Ds 系统构建了水稻的Enhancer trap系，同时检测到10%的报告基因在各种器官的表达。

图2. Enhancer trap, Gene tarp和Promoter trap 载体结构示意图(Springer，2000)

Fig2. Structure of enhancer, gene and promoter trap vectors

1.2.3构建Activation tagging突变体

拟南芥和水稻测序完成后，拟南芥大约有三分之二的基因组是由染色体的大片段复制而来的，而且，大约由4000个基因是串联重复成两个或多个拷贝(Arabidopsis Genome Initiative, 2000)。在水稻不同的染色体上，其基因的重复比例约为15.4-30.4%(Goff et al., 2002)。因此T-DNA或转座子插入到这些基因内很可能得不到相应的表型。为了研究这类基因的功能，植物学家将T-DNA的边界构建了多个CaMV调节序列35S Enhancers和Promotors，来启动相邻基因的表达而得到功能获得性突变体(Hayashi et al., 1992; Suzuki et al., 2001)。一般认为，Activation tagging产生的突变体为显性或半显性的。这种基因的激活会引起一些新的表型，因此无论是功能冗余基因还是发育相关基因都能够通过表型来鉴定。目前，在水稻和拟南芥中都已经建立了Activation tagging的突变体库(Weigel et al., 2000; Jeong et al., 2002)，Zubko等(2002)用这种策略在矮牵牛中分离了与细胞色素合成

相关的Sho基因。拟南芥中也用该方法克隆了一些基因(Kakimoto et al., 1996; Kardailsky et al., 1999; Ito and Meyerowitz, 2000; Vander et al., 2000; Huang et al., 2001; Zhao et al., 2001)。

Fox-hunting突变体也是将基因超表达，从而获得显性和半显性突变体的一种方法。其原理是将全长cDNA，连接到含有强启动子的T-DNA载体上，从而使基因超量表达。Nakamura(2007)收集了水稻中的13980条独立的全长cDNA，在玉米的Ubiquitin-1的启动子下超量表达。得到了超过12000个独立的转化株系。大约16.6%的株系出现了突变表型，并且从中克隆一个新的赤霉素-2-氧化酶。

1.2. 4 突变表型的筛选

功能基因组的研究方法很多，归纳起来分为两类：一类，即正向遗传学(Forward genetics)，从一个突变体的表型开始，研究其基因是什么；反向遗传学(Reverse genetics)，从一个突变体的序列开始，研究引起什么样的表型的改变。

1.2. 4.1 正向遗传学筛选

插入突变体库构建完成后，就可以利用正向遗传学和反向遗传学进行基因的鉴定，而正向的突变体的筛选是一件很费时费力的事。Tos17是目前应用最为成功的反转录转座子，但多拷贝的插入是突变体的表型鉴定和分子鉴定较为困难，且只有10%左右的突变是真正由Tos17的转座产生的。Hirochika（2007）对其超

过50,000份的Tos17突变体进行了大规模的表型筛选，将其突变表型分为53个大类。

1.2.4.2 反向遗传学筛选

利用反向遗传学筛选方法主要包括两种：一种是建立大型的侧翼序列信息库；一种是根据已知基因的保守序列设计一条基因特异引物，同对应的插入元件边界的特异引物组合扩增，如果外源片段插入到了目标基因内就应该可以得到PCR的扩增产物。该方法首先是在果蝇中应用，后来大范围的应用到各种生物中(Krysan et al., 1999)。现在主要是利用三维或二维的DNA混合池的方法来进行PCR筛选。如Kaneko等(2004)利用在大麦糊粉层细胞中分离的转录因子(GAMYB)的保守引

物设计引物，筛Tos17突变体的DNA混合池，成功的分离到了在水稻中同源的GAMYB基因。

1.3 水稻插入突变体的侧翼序列的分离方法

1.3.1 热循环不对称PCR(Themal Asymmetric Interlaced PCR，简称Tail-PCR)

TAIL-PCR又叫巢式PCR，是目前比较流行的分离侧翼序列的方法。由

Liu(1995)等首先报道使用，其原理是通过利用三条嵌套配对的能与插入元件特异配对的引物，和1条具有低Tm值的短的随机简并引物(Arbitary degenerate primer，简称AD)相组合，根据引物的长短和特异性差异，设计不对称的热循环，通过分级反应来选择性的扩增特异片段。目前日本NIAS研究所的Tos17突变体库和本室的水稻T-DNA突变体库都采用了TAIL-PCR技术来分离侧翼序列

TAIL-PCR有很多优点，它通过PCR反应来分离侧翼序列，操作简单快捷，灵敏度高，不需要经过酶切反应，对模板质量要求不高，并且产物的特异性高，扩增效率好(Liu and Whittier，1995)。但是，由于TAIL-PCR使用的是AD引物和复杂的反应条件，因此其产物容易产生公共带，而且测序效率不稳定。

1.3.2 反向PCR

1988年，Ochman研究组和Triglia研究小组首先报道了反向PCR技术(Triglia., 1998；Ochman et al., 1988)。反向PCR的原理是：用限制性内切酶酶切模板DNA，然后用DNA连接酶将酶切产物连接成环状DNA分子，再用转座元件载体序列左右边界上的一对PCR引物进行扩增，即可获得插入元件位点附近的基因组序列。而且为了提高扩增产物的特异性，往往还要利用另外一对左右边界的嵌套引物，来进行第二轮扩增，以提高产物的特异性。反向PCR的优点是：它利用两条可以和插入元件特异匹配的引物进行PCR扩增，不易产生非特异性扩增，并且操作简单，可以进行批量大规模的分离侧翼序列。但是其涉及酶切和连接反应，因此对模板的质量要求比较高，相对于TAIL-PCR反应时间也长。而且如果插入位点附件没有或酶切位点离插入位点过长，都无法将侧翼序列扩出。因此对于限制性内切酶的选择十分重要。韩国POSTECH研究所的T-DNA插入突变体库分离侧翼序列的方法就采用了反向PCR的方法，而且本实验室在分离T-DNA侧翼序列时也采用了反向PCR的方法。

图3. Tail-PCR扩增流程示意图(Liu and Whittier 1995)

Fig 3. Schematic diagram of TAIL-PCR controlling the amplification of

target fragment)

1.3.3 接头PCR (ADAPTER LIGATION-MEDIATED PCR,简称接头PCR)

1990年，Rosenthal等首先报道了一种新的分离侧翼序列的方法—接头PCR(Rosenthal and Jones 1990)。由于接头PCR不稳定而且容易产生非特异性扩增，

所以研究者对其进行了一系列的改进(Lagerstrom et al., 1991; Nthangeni et al., 2005)。目前比较成熟的接头PCR的原理为：首先用能够产生粘性末端的限制性内切酶酶切基因组DNA，然后用DNA连接酶在酶切产物的两端加上能和粘性末端特异结合的接头。接头(Ligate adapters)是由一长一短两条链组成。首先利用可以和转座元件特异匹配的一条引物，做单边扩增，补平接头的“缺口”。然后利用一条特异和短链“缺口”处匹配的特异引物，一条特异和转座元件载体序列特异匹配的引物，进行PCR扩增，将插入位点附近的基因组序列扩增出。有时为了提高产物的特异性，也可以利用第二对巢式引物，进行第二轮扩增(Ronan et al., 2007)。接头PCR以其稳定，高效的特点，被广泛用于侧翼序列的分离。

图5. 接头PCR扩增示意图(Ronan et al., 2007)

Fig 5. The procedure of adapter ligation-mediated PCR.

1.4 水稻突变体库现状

目前在水稻中已经构建了超过了2,000,000独立的水稻插入突变体，分离侧翼序列数目超过200,000条。并且建立了很多水稻侧翼序列数据库，通过数据库的检索可以很容易的检索到目的基因的突变体并进行基因克隆。如韩国

POSTECH研究所分离到84,680条水稻T-DNA插入突变体的侧翼序列，收录于RISD(http://an6.postech.ac.kr/pfg)数据库中，日本的NIAS研究所分离到34,844条水稻Tos17侧翼序列，收录于数据库(http://tos.nias.affrc.go.jp)中，武汉华中农业大学国家植物基因研究中心分离到了16,158条水稻T-DNA侧翼序列，收录于RMD(https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,/)中，除此之外，我国上海植物生理生态研究所，我国台湾地区的IPMB研究所，澳大利亚的CSIRO研究所，法国的Genoplanter研究所，美国的UCDavis大学等研究机构都在开展水稻突变体侧翼序列的分离工作，详细的侧翼序列信息如表1所示。

表1. 水稻突变体资源和侧翼序列数据库(Krishnan et al., 2009) Table 1. Rice mutant resources and flanking sequence databases

Institution Genotype Mutagen Mutated

Loci FSTs/Screen FSTLines

Availability

Database Web Site Contact

CIRAD-INRA-I RD-CNRS,

Génoplante, FR Nipponbare T-DNA ET

Tos17

45,000

100,000

14,137

13,745

17,414 11,488

(March 2009)

http://urgi.versailles.inr

a.fr/OryzaTagLine

E. Guiderdoni

guiderdoni@cirad.fr

CSIRO Plant Industry, AU Nipponbare Ac-Ds GT/ET16,000611Approximately 50%

lines no seed

http://www.pi.csiro.au/f

grttpub

N.M. Upadhyaya

narayana.upadhyaya@csiro.a

u

EU-OSTID, EU Nipponbare Ac-Ds ET25,0001,3801,300http://orygenesdb.cirad.

fr/E. Guiderdoni guiderdoni@cirad.fr

IRRI, PH IR64Fast neutron

γ-ray DEB,

EMS 500,000Deletion

database:

400 genes

Selected lines b https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,/

cgibin/MutantHome.pl

H. Leung h.leung@https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,

Gyeongsang National University, KR Dongjin

Byeo

Ac-Ds GT30,0004,8204,820KRDD

http://www.niab.go.kr/

RDS

C.-

D. Han

cdhan@nongae.gsnu.ac.kr

NIAS, JP Nipponbare Tos17500,00034,84434,844http://tos.nias.affrc.go.j

p H. Hirochika

hirohiko@nias.affrc.go.jp

NIAS, JP Nipponbareγ-ray ion beam15,000 M2 DNA pools Selected lines M. Nishimura

7,000 M2nisimura@affrc.go.jp

POSTECH, KR Dongjin,

Hwayoung T-DNA ET/AT

Tos17

150,000

400,000

84,68058,943RISD

http://an6.postech.ac.kr

/pfg

G. An genean@postech.ac.kr

HuazhongAgricul tural University, CN Zhonghua 11

Zhonghua 15

Nipponbare

T-DNA ET113,262

14,197 1,101

16,15826,000 Dec. 2008RMD

https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,

Q. Zhang

qifazh@https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,

SIPP, CN Zhonghua 11T-DNA ET97,5008,8408,840 FST + 11,000

lines http://ship.plantsignal.c

n/home.do

F. Fu ship@https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,

Temasek

Lifesciences, SG

Nipponbare Ac-Ds GT20,0003,5002,000R. Srinivasan sri@https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,.sg

IPMB, Academia Sinica, TW Tainung 67T-DNA A T30,00018,38231,000TRIM

https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,.tw

Y.C. Hsing

bohsing@gate.sinica.ed.tw

University of California, Davis Nipponbare Ac-Ds GT

Spm/dSpm

20,000Ds 4,735

dSpm 9,469

4,630 9,036http://www-plb.ucdavis

.edu/Labs/sundar

V. Sundaresan

sundar@https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,

University of California, Davis Nipponbare Sodium azide

+ MNU

6,000TILLING

screen

Selected lines http://tilling.ucdavis.ed

u

L. Comai

lcomai@https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,

Zhejiang University, CN Nipponbare

Zhonghua 11

T-DNA1,0091,009http://www.genomics.zj

https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,/ricetdna

P. Wu clspwu@https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,

Zhejiang University, CN Kasalath

SSBM

γ-ray EMS40,000Selected lines http://www.genomics.zj

https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,

P. Wu clspwu@https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,

2.本研究的目的和意义

本研究在通过在水稻粳稻品种中花11为材料构建Tos17插入突变体库，运用接头PCR的方法分离Tos17插入侧翼序列，筛选后代突变体观察突变表型并且进行共分离的验证。本研究的目的和意义在于：1) 构建水稻中花11 Tos17插入突变体库，分离侧翼序列，为水稻突变体的正反向遗传学研究搭建平台。2) 通过侧翼序列的生物学分析，研究Tos17插入位点的特征。3) 对突变体后代进行表型和基因型的共分离鉴定，为克隆水稻基因提供材料。4) 与我室T-DNA插入突变体库形成互补，研究我室T-DNA插入突变体库中的Tos17转座情况。

3材料和方法

3.1材料

3.1.1植物材料

材料为水稻粳稻品种中花11号，由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供。

3.1.2试剂

限制性内切酶、外切酶、rTaq、DNA连接酶，组培所用试剂均由Takara公司提供。

PCR引物由英杰公司合成。

其余试剂均为国产分析纯

3.2方法

3.2.1 T0代植株的创建

将野生型中花11种子脱壳，干燥-20℃保存。

将野生型中花11种子，于75%酒精中消毒15min，10%HgCl2消毒30min，转移到诱导培养基中。待30天后愈伤长出，为防止产生的后代Tos17突变体之间有相同的突变位点，所以每一颗种子诱导出的愈伤仅取一颗转移到继代培养基中，继代培养3个月，每30天更换培养基一次。共计诱导种子32000颗，产生愈伤25365颗。将经过3个月继代培养的愈伤转移到分化培养基中，分化产生T0代突变植株。每一个愈伤上诱导出的植株只取一株，夏季种于武汉华中农业大学试验田，共计产生T0代Tos17突变体15,543株。培养基配方见林拥军博士论文。

3.2.2DNA抽提小样（CTAB法）

本研究中共分离检测所用样品DNA使用CTAB小样法抽提。取3cm左右长的新鲜水稻叶片，在800μl 1.5 ×CTAB中研碎，56℃水浴30min，上下颠倒数次，加入600μl氯仿：异戊醇（体积比24：1），摇30min，11,500rpm室温离心10

分钟，吸上清450μl，加入2倍体积预冷的95%乙醇，-20℃冰箱中20min以上，12，000rpm离心15min；倒掉上清，用75%乙醇浸洗沉淀，自然风干，DNA沉淀溶于100μl无菌水中。

3.2.4侧翼序列用DNA样品分离（CTAB法）

取水稻新鲜叶片叶尖(3cm)3-4片，在-20℃预冷的研钵中磨至粉末状转入预冷的2ml离心管中，加入约半管。每管加入600μl 2% CTAB混合液（2% CTAB、1.4mM NaCl，20mM EDTA、100mM Tris-HCl、15μl RNA酶、0.2%β-巯基乙醇），上下颠倒摇匀，于65℃水浴锅中水浴15min，11,000rpm 离心5min，吸上清约500μl。加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下颠倒轻摇5min。11，000rpm 离心5min，吸上清400μl。加入异丙醇400μl，上下颠倒轻摇沉淀DNA。离心5000rpm，30sec沉淀DNA，丢弃上清。加入500μl 75%乙醇，洗沉淀，离心10s，弃上清，自然风干，DNA沉淀溶于50μl无菌水中。

3.2.5 Tos17插入植株的侧翼序列的分离

本室采用接头PCR的方法分离侧翼序列，所用引物见表2

接头(AD)制备方法：等体积混合引物AD-L (100mM)和引物AD-S (100mM)，

最终反应浓度为50mM，在95%水浴锅中水浴10min，自然冷却至室温。具体的反应步骤和反应程序如下：

第一步：模板DNA的酶切和连接。体系：取用分离侧翼序列用CTAB法分离的模板DNA样品1μl，接头(50mM) 0.2μl，10×M buffer 1μl，10×T4 DNA连接酶buffer 1μl，Dra? (15U/μl) 0.15μl, T4 DNA 连接酶(10U/μl) 0.2μl，补ddH2O水到10μl。反应置于25℃（室温）反应约16-20h。

第二步：PCR反应第一步。第一步反应产物1μl，10×PCR buffer 2μl，2mM dNTPs 1.8μl 25mM MgCl2 1.3μl，ADS-1(50mM) 0.5μl,

3’端或5’端特异引物（TRB1或TosRP2），rTaq DNA polymerase（Takara 公司）0.2μl, 补充ddH2O到20μl。反应程序：94℃4min；94℃30sec，72℃3min，7cycles；94℃30sec，67℃3min，32cycles；67℃7min；25℃10sec。

第三步：PCR反应第二步。第一步PCR反应产物1μl，10×PCR buffer 2μl，2mM dNTPs 1.8μl，25mM MgCl2 1.2μl, ADS-2(50mM) 0.5μl, 3’端或5’端特异引物（TRB2或TosRP3），rTaq DNA polymerase（Takara 公司）0.2μl, 补充ddH2O 到20μl。反应程序：94℃4min；94℃30sec，72℃3min，5cycles；94℃30sec，67℃3min，35cycles；67℃7min；25℃10sec。

表2. 接头PCR所用引物及其用途

Tab 2.The primer sequences used for Adapter-PCR.

Primer Usage Sequence(5’-3’)

AD-L 接头CTAATACGAGTCACTATAGCGCTCGAGCGGCCGCCGGGGAGGT

AD-S 接头P-ACCTCCCC-NH2

ADS-1 接头特异引物PCR1:GGATCCTAATACGAGTCACTATAGCGC

ADS-2 接头特异引物PCR2: CTA TAGCGCTCGAGCGGC

TosRP 2 Tos17左端引物PCR1: TACAAGTCGCTGATTTCTTCACCAAGGC

TosRP3 Tos17左端引物PCR2: CGGTTACATCTTCTCAAACTCAATGTGGTAGA

TRB1 Tos17右端引物PCR1: GCATCTTTCACACGTTCTCATTGTCAG

TRB2 Tos17右端引物PCR2: CGGTTACATCTTCTCAAACTCAATGTG

接头PCR产物的测序：取5μl第二步反应产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳，选取大于250bp的产物，采用酶消化法对PCR产物进行纯化：PCR产物5μl，10×PCR buffer 0.3μl，25mM MgCl2 0.18μl，SAP(2U/μl，Takara) 0.13μl，Exonuclease ? (20 U/μl，New England Biolabs) 0.25μl，加ddH2O至8μl，37℃1hr，80℃水浴10min。纯化产物送到上海国家基因研究中心测序。测序采用双脱氧链末端终止法，所以试剂为BigDye Terminator Cycle Sequence V3.1(Applied Biosystems，CA，USA)。测序仪型号为ABI3730xl (Applied Biosystems, CA, USA)。

3.2.6 DNA抽提大样(CTAB)

取水稻新鲜叶片3-4片，迅速放到冰中，带回实验室-20℃保存。将叶片在-20℃预冷的研钵中，用液氮磨至粉末状，转入10ml离心管中。在离心管中加入预热至95℃的1.5×CTAB 15-20ml，上下颠倒混匀，于56℃水浴锅中水浴30min。每管加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，手摇30-45min至溶液上下分三层。4000 rpm 离心20min，倒出上清液至另外一离心管中，每管加已预热(56℃)的10×CTAB 约2ml，再加一倍体积的氯仿：异戊醇(24：1)。轻摇约30min。常温，4000rpm 离心20min，吸出上清400ml，加等体积的1×CTAB, 旋转20下左右，即可见絮状DNA。5000rpm离心30sec，倒去上清，加入500μl的Nacl (1mol/l)和1μl 的RNA酶(1mg/L)，56℃水浴溶解DNA，DNA经预冷的95%乙醇沉淀，75%乙醇清洗，微干后溶解在ddH2O中备用。

3.2.7 Southern杂交

取用DNA抽提大样法抽提的样品的DNA5μg，用Xba?酶切过夜，跑1%TAE 凝胶电泳，然后转移到尼龙膜上，详细操作步骤参照张健博士毕业论文（张健，2007）；杂交探针长度为600bp，杂交探针引物为：TosL：5'-GCT ACCCGTTCTTG GACTAT-3'；TosR：5'-CTGAAATCGGAGCACTGACA-3'；探针合成PCR反应体系：野生型中花11样品DNA5ng，10×PCR Buffer 2μl，2mmol/L dNTP 1.5μl, 10μmol/L引物0.3μl, 10U/μl Taq酶0.2μl。PCR反应程序：94℃5min；94℃45sec，55℃45sec，72℃，1min，30cycles；72℃，7min；25℃30sec；

3.2.8 T1代表型筛选

2009年4月在华中农业大学实验田播种Tos17突变体T1代家系1,883个，5

月20日，每个家系以16.5cm×26.4cm的密度随机取20株移栽大田，分苗期，

分蘖期，临近抽穗期，成熟期四个时期观察表型。记载产生突变的家系的编号，并且对突变表型拍照。

3.2.9 T1共分离检测

根据侧翼序列的信息在Tiger (https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,/)上检索，确定Tos17插入的位点，根据插入位点附近的侧翼序列信息，利用Premier5设计引物，通过PCR反应验证插入位点是否正确。具体原理如下：在插入位点两端设计特

异引物，通过两条能和基因组特异匹配的引物以及一条能和Tos17特异匹配的引物和一条基因组特异匹配的引物配对扩增来确定插入位点是否正确。如果Tos17在该位点插入是纯合的，那么用一条基因组特异匹配的引物和一条能和Tos17特异匹配的引物来配对扩增时，能够得到目的条带。但是由于Tos17的插入，使两条基因组之间的距离变大，当使用两条基因组引物来配对扩增时就不能得到目的条带；如果Tos17在该位点的插入是杂合的，则用两条特异和基因组匹配的引物配对以及一条特异和基因组匹配的引物和一条和Tos17特异匹配的引物配对扩增，都能扩增出目的条带。从而很容易验证后代植株的基因型，通过基因型与后代植株突变表型的之间的是否符合，来判断后代植株的突变表型是否与该位点的插入共分离。PCR反应在ABI9700PCR仪(Applied Biosystem)上进行，反应体系如下：模板DNA 5ng，10×PCR Buffer 2μl，2mmol/L dNTP 1.5μl, 10μmol/L引物0.3μl, 10U/μl Taq酶0.2μl。PCR反应程序：94℃5min；94℃45sec，55℃45sec，72℃，

1min，30cycles；72℃，7min；25℃30sec；

表3 共分离检测引物

Tab 3. The primer used for co-segregation analysis.

Primer Sequence(5’-3’) Primer Sequence(5’-3’)

AD56L TACTGTCCCCAAATCCAAA AH77L GAATAAGGGCAGCGAATG

AD56R CAACACCAAAGCATATTCCA AH77R GGCAAGAATAATAGACGAAATAC AF4L GCAAGGTTTATCTGAGTTCC AH77BL TGGCTAACGACTTTCACTCA

AF4R GCAGTTGTGGCAGGTGT AH77BR GAATCACGACATTTCTCCCT

AF90L GTTCAGTTCTATCCAAAATCCC AM32L GTTGATGATTTGCTTTGTGC

AF90R AAGACGACAGGAATGGCTC AM32R CTGTGCGTGGATGCTGTA

AF91L CACCTTCAGACGCAAAACA AM86L CTCTTATGCGGAACTATGGC

AF91R GCCGAACAAACAGAAACG AM86R TGGGGATTTCGGGTTG

AF91BL GTTTCGGACTGCGTCTTC AO40L GTGGGAATGTGAAATACGG

AF91BR TCAATCCACTGCTTGCTTAC AO40R AGGAGGGCAGGAAGTGA

AF92L GTCGTTTTAGGCGTGGCT AO41L GAGGTTGGGCTGCTGTT

AF92R CGTTTTGGAGTCCGTGTT AO41R GGATTGTAGATCGGATGAGTAA

《烟草突变体库创建与功能基因组学研究》项目内容与

附件： 《烟草突变体库创建与功能基因组学研究》项目内容与目标 一、总体要求 突变体通常指某个性状发生可遗传变异的材料，或某个基因发生突变的材料。长期以来，育种家尽力地发现和分离有价值的自然突变和变异材料。自20世纪70年代以来，γ射线和 EMS 理化诱变创制的人工突变体在遗传育种中开始应用，此后，T-DNA 插入和转座子标签等插入突变筛选突变体法的发展，大大地加快了突变体的创制步伐。水稻、番茄、油菜等作物中已建立了一系列突变体库，但烟草突变体库的创制基本没有开展。 建立烟草突变体库是烟草功能基因组学研究不可缺少的重要组成部分，是克隆和阐明烟草重要功能基因的基础和前提。随着烟草饱和突变体库的建立，可望直接获得突变基因的序列信息并确证基因序列与功能的关系，从而促进烟草重要功能基因的克隆鉴定。 利用理化诱变技术创制烟草突变体库本身也是一种传统的育种技术，通过筛选突变体，可望获得一系列性状特异、能稳定遗传、有利用价值的烟草育种材料，直接应用于新品种选育。 二、招标项目内容与目标

（一）攻关内容。 1．利用EMS、快中子诱变创建二倍体烟草（绒毛状烟草）、四倍体普通烟草的饱和突变体库。 2．利用逆转座子Tto1和Tto2创建四倍体烟草插入标签突变体库。 3．建立基于Tilling技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 4．建立基于PCR技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 5．建立基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 6．在建立功能基因克隆验证体系的基础上，对突变体进行初步的遗传分析并对重要农艺性状相关基因进行表达特性和功能分析。 （二）攻关目标。 1．创建烟草饱和的突变体库4个（二倍体、四倍体突变体，EMS突变体和快中子突变体），突变体数达8万个；逆转座子标签突变体2万以上。 2．建立基于Tilling技术、基于PCR技术、基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系并进行重要基因的克隆与功能鉴定。 3．阐明控制亚硝胺、钾含量、抗病等重要农艺性状的基因3个以上，获得低亚硝胺、高钾含量、高抗病的育种材料10个以上。

利用转座子建立细菌单基因突变株库的策略和方法[1]_图文_百.

平板上的转座突变株机器自动挑蓖落 ?-————-----—-畸到38好L板上培养转到96孔板上 ?-—__—_____--—’进行P僳 I 转另一个板I 山

l 转另一个板l 山 戬.gsT分析数据整理 ●÷————————————一●}--—---————-—一 图1建立转座子突变株库的技术路线 子在铜绿假单胞菌PA01基因组中的转座插入采样数不符合泊松分布,虽然如此,但毕竟在最终还是获得了一个近饱和的突变株库。而Garsin(71等在构建粪肠球菌的Tn917转座插入突变株库时发现,测序的8865个Tn917转座突变株突变基因只对应了610个不同的开放阅读框,远远低于预期的2400个。这些结果说明使用随机性差的转座子会大大增加建库的成本。因此,有的研究利用了两种类型转座子构建突变株,这是为了防止一种转座子可能有的插入热区,而造成在基因组插入位点的随机性不佳,进而造成某些基因的突变株在筛选中漏选,而另一些基因的突变株则被多次重复筛选。两种类型转座子的使用,可以互相弥补,降低发生漏选或者重复筛选的可能性。例如在建立铜绿假单胞菌PAl4突变株库工作中,最开始采用的是Tn5来源的细菌转座子——hphoA。如前所述,尽管Tn5来源的转座子插入随机性非常好,研究者还是发现了至少一个热区(Hot spot,即gacA基因,同样也存在一些冷区(Cold spots。为了避免转座位点的选择性,研究者又采用了真核生物来源的mariner转座子,该转座子能够在很多原核生物中进行转座,而且预计与TnphoA在靶位偏嗜上存在 差异,故联合使用可以降低转座选择性;②对突变基因测定方法采用随机引物PCR的方式,以达到自动化的目的。确定突变株突变基因的方法有很多,如反向PCR等,但 这些方法的最大问题是需要人工参与,无法实现完全自动化测序,从而使确定突变基因的工作几乎不可能完成。而随机引物PCR的方法可以采用机器自动化 79

突变体构建

突变体构建 1.定点突变：快速，高效，简便 设计原理：引物与模板链退火，pfu DNA聚合酶合成突变链。DpnⅠ酶体外降解非突变型质粒模板（甲基化质粒模板） 设计引物： 引物包含5’端重叠区和3’端延伸区。 引物长度：除突变点之外，两条引物的长度大约为30个核苷酸，5’端重叠区包含15-20个碱基，3’端延伸区包含至少10个碱基。 突变引物：突变点位于两条引物上，分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区；反向突变引物5’端。 退火温度的计算不包括突变碱基。如图： 5’’3’-TACTGGTACTAATGCGGTTCGCGC G 延伸区重叠区 2.嵌合型突变体的构建： 将一个基因与另一个基因，互换构建嵌合型突变变体，可以通过overlapping PCR的方法获得。 ●原理： 比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。 A的序列为5-atgcatgctagctagaacgct acgctgactaccccctgatc-3， B的序列为5-atgctagtagctagcccccc cc aggggataattttttaaaacg-3。 ●首先我们要设计引物，假设引物的序列为： A1:5-atgcatgctagctagaacgct-3 A2:5-ggggggctagctactagcat gatcagggggtagtcagcgt-3 B1:5-acgctgactaccccctgatc atgctagtagctagcccccc-3 B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3 （设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。） ●步骤： （1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因 （2）回收A，B基因 （3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。

拟南芥突变体购买流程-完全图解

最近要购买一批拟南芥突变体，想请教有经验的虫友购买拟南芥突变体的具体流程，例如我需要一个APETALA1的突变体，应到哪个网站进行搜索，怎样进行选择订购，越具体越好，有截图就更好了，谢谢大家了！ Step 1. 打开NCBI主页：https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,/ 打开的页面如下： 如下 得到如下页面：

进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图： 记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,/ 点击T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：

显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：

水稻EMS诱变

水稻EMS诱变 1、EMS诱导水稻中花11突变体的筛选和鉴定,顾佳清，等.上海农业学报，2005，21(1)：7～ll。这篇文献所使用的方法主要是：（1）先用清水浸种16h，再用0.5%的EMS在28℃下处理4h，播种，收种子（M1）。 （2）将M1代种子用清水浸种16h，用0.5%的EMS在28℃下处理4h，再用0.7%的EMS处理4h，播种，收种子M2代。 （3）将M2代播种，筛选突变植株。 在这篇文献中，经两次诱变后，突变率达12.4%，有各种突变体产生，其中有叶片形状的突变。只是两次诱变所花时间长。 2、三种化学诱变剂对不同水稻品种的生物学效应研究，彭波，等.湖南人文科技学院学报，2007年8月，第4期。这篇文献主要使用的方法是： 用三种浓度（0.5%，1.0%，2.0%）的EMS，在26℃的培养箱中处理水稻种子12h，再用清水冲洗4h，播种。其中0.5%的发芽率最高，在80-90%之间，1.0%的发芽率在40%-50%之间，作者认为这种半致死量（1.0%）的浓度为诱导水稻突变的最佳浓度，我想对我们工作来说，我们是寻找表皮和气孔的突变体，所以用0.5%的比较适宜。 3、水稻“9311"突变体筛选和突变体库构建，叶俊，等. 作物学报，第32卷第10期，2006年10月 1525～1529页。这篇文献主要使用的方法是： 将9311种子浸种16 h，用0.4％ EMS处理8h。

4、Selection of stable mutants from cultured rice anthers treated with ethyl methane sulfonic acid.Joong Ho Lee & Seung Yeob Lee. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 71: 165–171, 2002。这篇文献主要使用的方法是： 用0.5%的EMS在25±2 ?C下处理，轻微摇晃6h。 所以，我们诱变可以选用0.5%的EMS，在25 ?C下处理6-8h为宜。

突变体质粒构建—PCR法-2011

实验题目：突变体质粒构建——PCR 法 背景与原理： 蛋白与蛋白间，蛋白与核酸间相互作用是后基因组学研究重要内容之一，而体外突变技术则是研究这种复杂关系的一个有效手段。通过PCR 方法可向目的DNA 片段中引入任何所需的变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。PCR 定点突变迅速、高效并且重复性好，是基因研究工作中一种非常有用的手段。其基本原理可简述如下图： 本实验拟在某基因编码区（CDS ）内，通过PCR 定点突变引入一个EcoRI 酶切位点。该基因片段长724bp ，上下游分别以XhoI 和BamHI 两个酶切位点插入真核表达载体pcDNA3.1，即pcDNA3.1-CDS 。此基因内部含有一个EcoRI 酶切位点，我们通过PCR 法诱 产物I 产物II 第一轮PCR 第二轮PCR 退火 延伸 8个循环后加入 引物1/引物4

变又形成一个EcoRI酶切位点，可以通过EcoRI单酶切验证突变是否成功。具体设计如下： 仪器、试剂及药品配方： 1.仪器：PCR仪，电泳槽，水浴锅，凝胶成像仪，离心机，振荡培养箱，温箱，超净工作 台，冰箱 2.试剂及配方： 2.1试剂：DNA回收试剂盒，限制性内切酶（BamHI，EcoRI，XhoI），T4连接酶，DNA电 泳marker 2.2PCR反应体系： primex 12.5μl 模板1μl 上游引物（5μM）2μl 下游引物（5μM）2μl 水7.5μl 2.3primex配制： primex Taq酶0.125μl 10×Taq酶buffer 2.5μl dNTP（2.5μM）2μl 水7.875μl 2.4DNA电泳buffer（TAE）： 工作液（1×）储存液（50×） 40mM Tris-乙酸242g Tris/57.1ml冰乙酸

突变体鉴定

作物突变体的细胞学研究 一、突变体的初步观察和遗传分析 在某品系材料A中发现一株突变体，将其命名为M，优先将M自交，得到具有突变性状的纯系，如果为不育等特殊性状则可以采取不断回交的方式得到相应 纯系；再将M与A和另外一品系Y分别正交和反交，得到F 1世代；将得到的F 1 自交得到各个的F 2世代；将F 1 与M进行回交，分别得到对应的BC 1 世代；如果需 要，还可以继续回交得BC 2 等世代。 观察M的突变性状在自交过程中是否始终存在，则能初步判别此突变性状是否为可遗传性状； 分别统计M与A，M与Y的正反交的表型数据，分析所有正交与反交的差异，可以判别此性状是由核基因控制或者细胞质基因控制，甚至为核质互作控制； 结合M自交过程中的突变性状的遗传特性和所有F 1 突变性状，可判别突变性状为隐性或显性； 统计分析F 2和BC 1 世代的突变表型数据，可判别控制突变性状为质量性状或 者数量性状，以及质量性状中的的基因的对数。 在数据的分析过程中要充分应用生物统计的方法，如方差分析，Χ2检验等。 二、突变体的细胞学观察 核型分析原理与步骤 核型分析是指在一个物种内，对其染色体数目。结构及其它特征进行描述性分析，从而对单一染色体进行初步分析的过程。在突变基因确定为核基因后，则可以进行核型分析。 不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。因此，染色体核型分析是植物遗传性研究的重要内容。 染色体核型分析主要包括染色体长度、染色体臂比、着丝点位置、次缢痕等。染色体的长度差异有两种，一种是不同种、属间染色体组间相对应的染色体的绝对长度差异，一种是同一套染色体组内不同染色体的相对长度差异。

水稻突变体介绍及鉴定(很详细)汇总教材

RMD水稻突变体信息及基因型鉴定 1.背景介绍： 突变体对于遗传学研究有着重要作用，随着拟南芥和水稻等物种全基因组测序的开展，人类积累了前所未有的基因序列信息，为了弄清这些基因序列的生物学信息，寻找该基因区段序列发生变异的突变体是阐释基因功能最直接最有效的方法。 植物在自然的环境条件下也会产生突变性状，早期普通正向遗传学研究往往通过寻找与某种生物学特性相关的突变体来发掘或定位某个特定基因。为配合植物功能基因组研究高通量的策略，构建水稻等物种的大型突变体库已成为必然，借助水稻全基因组测序信息、通过反向遗传学的手段大规模地筛选突变体库，理论上可以获得基因组中任一基因的突变体，最终实现阐释基因功能的目的。 2.原理： 2.1农杆菌介导的T-DNA 插入 农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤和毛状根的发生。1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid），简称Ti 质粒。Ti 质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。 研究发现，T-DNA 两端存在非常保守的同向重复的25bp 序列，分别称为左边界（LB）和右边界（RB）。T-DNA 的转移只与边界序列相关，尤其是RB，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关。我们将T-DNA 区段上的致瘤基因和其它无关序列去掉，利用其转移的特性，实现农杆菌介导的T-DNA 转入水稻愈伤，从而构建水稻突变体库。大量研究表明，农杆菌T-DNA 整合到植物基因组中的位置是随机的，并且整合到植物基因组中的T-DNA 能稳定遗传。由于插入到植物基因组中的T-DNA 区段序列已知，这样随机插入到植物基因组中的T-DNA 类似于给植物基因“贴”了一个序列标签。我们利用这个标签，通过各类PCR技术最终可以获取其插入的位点。 2.2 水稻Tos17 反转录转座子 创造水稻突变体的另一种方法是利用植物的反转录转座子，它们是以DNA→RNA→DNA 的方式进行转座，在水稻上已发现大约40 种长未端重复的反转录转座子，它们是Tos1-Tos32，RIRE1-RIRE8，其中5 类被证明是有转座活性的，分别是Tos10、Tos17、Tos19、Tos25 和Tos27。这些反转录转座子只有在组织培养条件下才具备转座活性，其中Tos17 的转座活性最强，容易插入到富含基因的区域，因此可以直接用于创造插入失活的突变体库。利用含有Tos17 插入的水稻突变体库，可以进行突变性状的筛选， T os17 反转录转座子正成为水稻功能基因组研究的一个有力工具。由于Tos17 反转录转座子为水稻内源的转座子，不需要进行转基因的过程，而且平均每株含有8 个Tos17 个拷贝，在正常情况下能够稳定遗传，因此Tos17 转座子突变体库是水稻功能基因组研究的一个有用资源。但也有研究表明，Tos17 在转座过程中

【WO2019205919A1】一种生物突变体库的构建方法【专利】

20 (51)国际专利分类号：(72)发明人：姜临建(JIANG,Linjian);中国山东 C12N15/82(2006.01)C12N15/85(2006.01)省青岛市黄岛区青龙河路53号，Shandong A01H5/00(2018.01)C12N15/00(2006.01)266000(CN)。 (21)国际申请号：PCT/CN2019/081654(81)指定国(除另有指明，要求每一种可提供的国家 (22)国际申请日：2019年4月8日(08.04.2019)保护)：AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG, BH，BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU， (25)申请语言：中文CZ,DE，DJ，DK，DM,DO,DZ，EC,EE,EG，ES，FI,GB， (26)公布语言：中文GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR，IS， JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC，LK，(30)优先权： LR，LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX, 201810400607.72018年4月28日(28.04.2018)CN MY,MZ,NA,NG，NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL，(71)申请人：青岛清原化合物有限公司(QING PT，QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL， DAO KINGAGROOT CHEMICAL COMPOUND CO.,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG，LTD.)［CN/CN］:中国山东省青岛市黄岛区青US,UZ,VC,VN,ZA，ZM,ZW。 龙河路53号，Shandong266000(CN)。(84)指定国(除另有指明，要求每一种可提供的地区 保护)：ARIPO(BW，GH，GM，KE，LR，LS，MW,MZ， NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),欧业(AM, (54)Title：CONSTRUCTION METHOD FOR BIOLOGICAL MUTANT LIBRARY (54)发明名称：一种生物突变体库的构建方法 (57)Abstract:Disclosed in the present invention is a construction method for a biological mutant library.The construction method for a biological mutant library disclosed in the present invention comprises:1)introducing a DNA segment to a target organism to obtain a genetically modified organism,the DNA segment being capable of expressing elements required by implementation of site-directed mutation of target DNA in the genetically modified organism;and2)culturing the genetically modified organism to obtain a biological mutant library,the organism being a sexual reproductive organism,and the genetically modified organismbeing capable of site-directed mutation of target DNA in a germ cell.According to the mutant library obtained by using the present method,organisms having the characteristics of anti-biotic stress,anti-abiotic stress,high yield,good quality characteristics,high secondary metabolite yield,etc.can be obtained by screening.Therefore,the present method has a great application prospect. ［见续页］

拟南芥突变体购买流程-完全图解

Step 1. 打开NCBI主页： 打开的页面如下： 如下 得到如下页面： 进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图：

记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找 APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：点击 T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：

显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：

我们主要是从 ABRC 订购，点击进入页面，填写要求的相关信息，万事大吉。祝实验顺利！

水稻TOS17突变体库的创建与应用

1文献综述 1.1水稻基因组学研究现状 1.1.2 水稻全基因组测序 水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮食作物之一，全世界有一半的人口食用它，水稻年总产量占世界粮食作物产量第三位，维持较多人口的生活。亚洲是世界水稻主产区，近年稻米产量占世界的90%以上，中国稻米年产量占亚洲的38%。大米作为我国主要粮食种类，在养活我国13亿人口和改善我国居民营养结构中具有举足轻重的影响。同时，水稻又以其基因组相对较小(～430Mbp)，高效的遗传转化体系，与玉米、大麦和小麦等其它禾本科作物在基因组上存在明显的共线性，而成为研究单子叶植物的模式植物。 国际水稻基因组计划(IRGSP)启动于1998年，以粳稻品种(japonica)日本晴(Nipponbare)为模式材料，由中国、日本、美国等是十个国家参与，所采用的方法为逐步克隆策略(clone by clone sequencing)，随后在2002年由日本和中国科学家率先公布了第1、4染色体的精确序列(Feng et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Consortium 2003)；2003年9月第10条染色体的全长序列由美国Clemson大学公布(Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium, 2003)。2005年8月水稻全基因组精确序列在Nature发表(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。IRGSP公布的水稻“日本晴”精确序列经过分析表明：(1) 水稻“日本晴”基因组大小为389Mb，IRGSP公布的序列能够覆盖其全基因组的95%，并包含了所有的常染色质和两个完整的着丝粒；(2) 整个基因组中包含大约37544个非转座相关基因，其中71%的基因可能在拟南芥中有同源基因；(3)通过与拟南芥基因组序列对比分析发现，拟南芥90%的基因在水稻中可能存在同源物；(4) 水稻中预测的37544个基因中，29%是属于成簇的基因家族；(5) 水稻基因组中转座元件的数目和种类与玉米和高粱基因组共线性区段的扩张是一致的；(6) 有证据证明基因能从细胞器中转移到细胞核(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。 另外的一些科学研究部门和公司也分别启动了各自的水稻测序计划。如华大基因在2005年宣布完成籼稻品种“93-11”的全基因组序列测序，其所采用的方法为鸟枪法。Syngenta公司也于2002年宣布完成了粳稻品种“日本晴”的全基

EMS诱变水稻突变体致变基因的鉴定0725

EMS突变体致变基因鉴定 在植物遗传学研究中，研究者除了采用传统的正向遗传学手段外，反向遗传学也得到广泛应用。采用各种物理或化学突变，导致遗传物质发生突变，进而根据突变性状来研究变异基因的生物学功能。在众多的致突变手段中，EMS突变技术由于导致的突变多为单碱基突变，且遵循C>T突变规律，在近代遗传学研究中得到广泛的应用。常规的对突变基因的鉴定多采用建立F2连锁群体，通过分子标记进行图位克隆，研究的周期长、工作量大且过程繁琐。随着高通量测序技术的快速发展，实现了在短期时间内获得植物的基因组信息，为研究突变体的突变基因的鉴定提供了一条新的研究途径。 根据对研究材料中突变基因的信息不同可以分为两种策略： 方案一：对于已经比较纯合的突变体植株，可以直接对野生型植物和突变体植株进行深度测序，通过对野生型和突变体中的变异信息的分析，直接对导致表型的致变位点进行鉴定。 方案二：对于没有初步定位突变位点信息的材料，可以对突变植株的自交F2后代中，选择具有突变表型的植株进行混合测序，突变位点在混合群体中应该处于高度纯合而极低的杂合度，因此通过对全基因组中位点进行扫描，从而定位到突变位点。该方法特别适合于大量突变体的鉴定，可以同时鉴定大量的株系，且群体建立方法简便，工作量低。

变位点，并定位突变基因，然后对可能的突变基因的表达进行检测。 方案二：如果没有定位信息，可以将多株具有突变表型的F2个体的DNA按等量混合，并进行低深度（30X）测序，即可减少工作量

又可降低测序成本。由于EMS诱变F2代中具有表型的多为隐性纯合突变，突变基因所在区间为纯合子，为了减少假阳性出现，结合分析该区间的杂合度综合分析，获得突变位点后在扩大样品群体中进一步验证，即可定位导致突变表型的位点和基因。 水稻、拟南芥、玉米等重要模式和粮食作物已经完成了基因组的完整测序，为基于高通量测序技术的突变基因的鉴定奠定了丰富的资源基础。该方案的实施将为加快作物突变体的鉴定具有重要的推动作用，并为作物功能基因组研究提供了一种高效、便捷的技术手段。该方案一中针对具有明显表型的突变体方案包括以下三个步骤：（1）测序样本的选择及测序深度的确定 选择连续多代自交的突变体植株，以及野生型植株个体，提取基因组DNA，按照标准的Illunima 建库流程，建立插入片段为350bp 的文库，根据不同作物基因组大小进行30X测序。 （2）基因组重测序数据的获得与生物信息学分析 通过对测序数据的质控之后，将获得的reads同野生型基因组序列进行，找出测序数据中的SNP、InDel，对全基因组的SNP纯合度进行分析，找出可能的突变位点，并进一步采用其他分析软件进行确认，从而锁定出突变表型相关位点及基因。 （3）突变位点的鉴定和扩大群体中验证 根据生物信息学获得突变位点信息，利用Sanger测序进一步在突变体中进行验证。

【CN110218811A】一种筛选水稻突变体的方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910379866.0 (22)申请日 2019.05.08 (71)申请人 中国科学院植物研究所 地址 100093 北京市海淀区香山南辛村20 号 (72)发明人 漆小泉　张英春　冯来宝　池旭　 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 魏少伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种筛选水稻突变体的方法 (57)摘要 本发明公开了一种筛选水稻突变体的方法。 本发明公开的筛选水稻突变体的方法包括：利用 多重PCR富集待测水稻中的目标DNA片段，得到富 集的目标DNA片段；对富集的目标DNA片段测序， 得到待测水稻目标DNA片段序列；比较待测水稻 目标DNA片段序列与野生型水稻目标DNA片段的 序列，确定待测水稻目标DNA片段是否发生突变， 以确定待测水稻是否为突变体。实验证明，利用 本发明的方法可成功检测目标DNA片段是否发生 突变， 进一步可用于筛选突变体。 权利要求书3页 说明书43页序列表1页 附图7页CN 110218811 A 2019.09.10 C N 110218811 A

权　利　要　求　书1/3页CN 110218811 A 1.鉴定生物目标DNA片段突变的方法，包括： 1)利用多重PCR富集待测生物中的目标DNA片段，得到富集的目标DNA片段；所述利用多重PCR富集待测生物中的目标DNA片段包括利用多重PCR方法扩增得到目标DNA片段，实现目标DNA片段的富集；所述多重PCR方法，包括：利用成套引物对目标DNA片段进行PCR扩增，得到PCR产物，将该PCR产物记为PCR产物1；所述成套引物满足如下a1)、a2)和a3)：a1)所述成套引物由n个引物对组成，n为大于等于2的自然数； a2)所述成套引物中的每个引物对的因素J小于50％，所述因素J为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物形成引物二聚体的个数占所述成套引物中引物个数的百分比； a3)所述成套引物中的每个引物对的9个因素中至多一个因素不在标准范围内；所述9个因素为因素A、B、C、D、E、F、G、H和I； 所述因素A为引物对的反向引物的GC含量； 所述因素B为引物对的反向引物的TM值， 所述因素C为目标片段的GC含量； 所述因素D为从目标片段上游400bp处至该目标片段下游400bp处间的DNA片段的GC含量； 所述因素E为目标片段的结构自由能； 所述因素F为目标片段及目标片段下游150bp的连续DNA片段的结构自由能； 所述因素G为目标片段及目标片段上游150bp的连续DNA片段的结构自由能； 所述因素H为引物对的正向引物3’末端5个核苷酸的结构自由能； 所述因素I为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物中部连续大于等于5个核苷酸所形成的多个双链DNA的TM值总和； 所述9个因素的标准范围如下： 35％≤所述因素A≤60％； 68℃≤所述因素B≤79℃； 30％≤所述因素C≤70％； 30％≤所述因素D≤70％； 15kcal/mol≤所述因素E的绝对值≤70kcal/mol； 所述因素F的绝对值＜100kcal/mol； 所述因素G的绝对值＜100kcal/mol； 4kcal/mol≤所述因素H的绝对值≤10kcal/mol； 所述因素I＜100℃； 2)对所述富集的目标DNA片段测序，得到待测生物目标DNA片段序列； 3)比较所述待测生物目标DNA片段序列与野生型生物所述目标DNA片段的序列，确定所述待测生物目标DNA片段是否发生突变：所述待测生物目标DNA片段序列与野生型生物所述目标DNA片段的序列相同，所述待测生物目标DNA片段未发生或候选未发生突变；所述待测生物目标DNA片段序列与野生型生物所述目标DNA片段的序列不同，所述待测生物目标DNA 片段发生或候选发生突变。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述成套引物中各引物对的正向引物含有相同的序列，记为正向引物共同序列；各引物对的反向引物含有相同的序列，记为反向引物 2

植物突变体库的构建及突变体检测研究进展_郭建秋

收稿日期:2009-12-11 基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2009CB118400) 作者简介:郭建秋(1972-),男,河南新安人,助理研究员,主要从事大豆品质改良利用研究。 E-ma il:guojianqiu.2008@https://www.wendangku.net/doc/a785778.html, 植物突变体库的构建及突变体检测研究进展 郭建秋,雷全奎,杨小兰,马 雯,张向召 (洛阳市农业科学研究院,河南洛阳471022) 摘要:突变体是研究基因功能的重要材料,为此,介绍了创造突变体的方法,特别是理化诱变方法以及突变体的检测方法等方面的研究进展。关键词:植物突变体;构建;检测方法 中图分类号:Q319 文献标识码:A 文章编号:1004-3268(2010)06-0150-06 随着大量基因序列和EST 资料的积累,后基因组时代诞生了。功能基因组学是后基因组时代的重点研究内容,主要研究生物有机体内各种基因的生物学功能,进而了解所有基因如何协调发挥作用,完成一系列的生长发育过程。要精确了解每个基因的功能及基因间的相互作用,必须分析单个基因和多个基因的突变表型以及它们的时空表达剖面。随着新技术新方法的不断创新开发,分析鉴定基因功能的方法越来越多,并逐渐形成功能基因组学的分支学科。目前已经发展了多种分析鉴定基因功能的方法,其中最直接最有效的方法是构建饱和的基因突变体库,通过突变体分析鉴定基因功能。因此,突变体库的构建是功能基因组学的基础。为此,综述了创造突变体的方法以及突变体的检测筛选方法等方面的研究进展。1 创造突变体的方法 突变体库有不同的分类方法[1] 。按照产生突变体的方法大致可分为自发突变体库、体细胞无性系变异突变体库、理化诱变突变体库和插入突变体库4类。1.1 自发突变 自发突变是指自然条件下发生的突变,是生物变异的重要来源,是自然进化的基础。自发突变为人类提供了极有价值的研究材料。李玮等[2] 在芥菜型油菜品系L638-g 中发现了几株无致死效应的天然叶片黄化突变体,并研究揭示了该突变体的黄化机理及生物学特性。在水稻中,矮秆突变株的发 现揭开了矮化育种的序幕;细胞质雄性不育株的发现使水稻三系法杂种优势的利用成为现实;而光(温)敏核不育株的发现则为采用两系法利用水稻亚种间的杂种优势铺平了道路。但是自发突变的频率很低,在高等生物中,大约10万个到1亿个生殖细胞中才会有1个生殖细胞发生突变,且许多突变通过表型无法鉴定而丢失,很难进行系统收集。即使获得了感兴趣的突变株,要分离突变基因并进一步鉴定其功能也是相当困难的,因为自发突变体的遗传背景非常复杂。 1.2 体细胞无性系变异 体细胞无性系变异是组织培养中的普遍现象,泛指在细胞、组织和器官培养过程中,培养细胞和再生植株中产生的遗传变异,又可细分为自发无性系变异和诱发无性系变异。体细胞无性系变异的产生没有种属特异性,出现的频率一般比较高[3,4]。其变异频率随培养时间的延长而提高,且结合化学诱变和利用选择压力进行细胞突变体筛选可实现一定程度的定向诱变[5-7]。植物通过体细胞无性系变异,可产生一系列有益的新性状,对植物品种改良和选育新品种具有重要意义。但近年来的遗传转化实践表明,经历组织培养和再生阶段后,常表现出一些非目的性状的变异,其原因属体细胞无性系变异还是外源基因的插入诱变,往往很难确定[8]。体细胞无性系变异已在农作物的育种中广泛应用,并已获得了抗逆、可遗传的新品系[5]。赵成章等[9,10]从水稻幼胚愈伤组织中,筛选出一些早熟、矮秆、千粒重高 的新品系。孙立华等[11] 获得了抗水稻白叶枯病的 150

转座子

转座子 科技名词定义 中文名称：转座子 英文名称：transposon;Tn 定义1：转座元件中的一种，具有完整转座元件的功能特征并能携带内外源基因组片段(单基因或多基因)。在基因组内移动或在生命体之间传播并可表达出新的表型。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；基因表达与调控（二级学科） 定义2：转座因子中的一种。除含与转座有关的基因外，还含抗药基因、抗重金属基因和接合转移基因等，可赋予受体细胞一定的表型特征。 所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 Ac-Ds转座元件 转座因子或转座子是一类在很多后生动物中（包括线虫、昆虫和人）发现的可移动的遗传因子。一段DNA顺序可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，此过程称转座。这段序列称跳跃基因或转座子，可分插入序列（Is因子），转座（Tn），转座phage。 目录

编辑本段简介 Transposon a segment of DNA that can become integrated at many different sites along a chromosome (especially a segment of bacterial DNA that can be translocate 转座子引起的插入突变 d as a whole)

转座子是一类在细菌的染色体,质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分,是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列. 转座子是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分 转座(因)子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。 复合型的转座因子称为转座子(trans—poson，Tn)。这种转座因子带有同转座无关的一些基因，它的两端就是IS，构成了“左臂”和“右臂”。两个“臂”可以是正向重复，也可以是反向重复。这些两端的重复序列可以作为Tn的一部分随同Tn转座，也可以单独作为IS而转座。 玉米“花斑”由一种转座因子的存在所导致 转座子是细菌细胞里发现的一种复合型转座因子，这种转座因子带有同转座无关的一些基因，如抗药性基因；它的两端就是IS，构成了“左臂”和“右臂”。两个“臂”可以是正向重复，也可以是反向重复。这种复合型的转座因子称为转座子(trans—poson，Tn)。这些两端的重复序列可以作为Tn的一部分随同Tn转座，也可以单独作为IS而转座。Tn两端的IS有的是完全相同的，有的则有差别。当两端的IS完全相同时，每一个IS都可使转座子转座；当两端是不同的IS时，则转座子的转座取决于其中的一个IS。Tn有抗生素的抗性基因，Tn很容易从细菌染色体转座到噬菌体基因组或是接合型的质粒。因此，Tn可以很快地传播到其他细菌细胞，这是自然界中细菌产生抗药性的重要来源。 两个相邻的IS可以使处于它们中间的DNA移动，同时也可制造出新的转座子。Tn10的两端是两个取向相反的IS1O，中间有抗四环素的抗性基因(TetR)，当TnlO整合在一个环状DNA分子中间时，就可以产生新的转座子。当转座子转座插人宿主DNA时，在插入处产生正向重复序列，其过程是这样的：先是在靶DNA插入处产生交错的切口，使靶DNA产生两个突出的单链末端，然后转座子同单链连接，留下的缺口补平，最后就在转座子插入处生成了宿主DNA的正向重复。

水稻脆性突变体叶的解剖结构和化学特性

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(8): 1417?1423https://www.wendangku.net/doc/a785778.html,/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@https://www.wendangku.net/doc/a785778.html, DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01417 水稻脆性突变体叶的解剖结构和化学特性 韦存虚1谢佩松1周卫东2陈义芳2严长杰3,* (1扬州大学生物科学与技术学院; 2扬州大学测试中心; 3教育部植物功能基因组学重点实验室/江苏省作物遗传生理重点实验室, 江 苏扬州225009) 摘要: 植物机械强度是一个十分重要的农艺性状, 为了解作物控制机械强度的机制, 本文对一个水稻脆性突变体[bc7(t)]叶进行了细胞学观察及叶细胞化学组成分析。光镜和电镜观察都发现突变体厚壁细胞的细胞壁变薄; 对细胞 壁成分的化学分析显示突变体纤维素含量明显低于对照, 硅含量明显升高, 而木质素变化不明显; 木质素的组化反 应也显示了木质素在突变体和对照之间差异不大; X-射线微区分析表明, 硅元素在突变体叶表面明显提高。上述结果 表明, 突变体叶纤维素含量的降低影响了厚壁细胞次生壁的形成, 导致细胞壁变薄, 机械强度降低, 硅含量的升高 有助于突变体增强机械强度。 关键词:水稻; 脆性突变体; 叶; 纤维素; 硅 Anatomical Structure and Chemical Features of Leaf in Brittle Mutant of Rice WEI Cun-Xu1, XIE Pei-Song1, ZHOU Wei-Dong2, CHEN Yi-Fang2, and YAN Chang-Jie3,* (1 College of Bioscience and Biotechnology; 2 Analytical Centre; 3 Key Laboratory of Plant Functional Genomics, Ministry of Education / Jiangsu Key Laboratory for Crop Genetics and Physiology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China) Abstract: Plant mechanical strength is an important agronomic trait. A rice brittle mutant bc7(t) which derived from japonica variety Zhonghua 11 by radiation of 60Co-γ displayed normal phenotype similar to its wild type (WT) plants except for the fragi- lity of all plant body. To understand the mechanism of controlling plant mechanical strength, the anatomical structure and chemical features of leaf of brittle mutant bc7(t) were investigated. Anatomical analyses were carried out by means of various microscopic techniques, such as light microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. It was found that the cell walls of sclerenchyma cells of leaf sheath and leaf blade in the mutant were thinner than that in WT. For histochemical loca- lization of lignin, fresh freezing-cut transverse sections of leaf blade and sheath were stained with Wiesner reagents. Responding to the Wiesner reaction, the sclerenchyma cells below the epidermis, vascular bundle sheath and xylem were stained red. Though no noticeable staining difference in leaf blade between WT and mutant, the sclerenchyma cells of leaf sheath of mutant were stained slightly deeper than that of WT. Separation and purification of cell wall of leaf blade and sheath were carried out. The lignin content of cell wall was determined by thioglycollic acid method, the results revealed a slightly higher lignin content in mutant than in WT without significant difference. The cellulose content of cell wall was assayed with the anthrone reagent; the results showed that the amount of cellulose of leaf blade and sheath in mutant was significantly lower than that in WT. The test of silicon content of cell wall showed an increased content in the mutant. The energy dispersive X-ray micro-analysis attached to the FE-SEM provided the information on the distribution and content of silicon in the epidermal cells of leaf blade and sheath. The X-ray map analysis at the upper and lower epidermis of leaf blade and outer epidermis of leaf sheath showed that the content of silicon in mutant was obvious higher than that in WT. The result from silicon X-ray mapping of upper epidermis of leaf blade indicated that the distribution of silicon was concentrated in cell wall of silica cells. X-ray point analysis on the upper epidermis of leaf blade in the cell walls of silica cell, dork cell, long cell, and bulliform cell showed that the contents of silicon at these locations in mutant were all higher than these in WT. These results suggested that the reduction of cellulose might affect the formation of 基金项目:国家自然科学基金项目(30300215, 30300220); 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2005CB120804) 作者简介:韦存虚(1973–), 男, 安徽临泉人, 博士, 副教授, 从事植物细胞结构与功能研究。 *通讯作者(Corresponding author):严长杰。 Received(收稿日期): 2007-12-27; Accepted(接受日期): 2008-03-28.