利用变性高效液相色谱(dHPLC)进行小麦等位基因差异表达分析＊____韩宗福--DNASep柱

　第18卷　第11期　2008年11月

利用变性高效液相色谱(dHPLC )进行小麦等位基因差异表达分析＊

韩宗福　倪中福＊＊王晓娜　逯腊虎　姚颖垠　孙其信＊＊

中国农业大学植物遗传育种系,农业生物技术国家重点实验室,教育部杂种优势研究与利用重点实验室,

北京市作物遗传改良重点实验室,农业部作物基因组与遗传改良重点实验室,北京100193

　2008-03-19收稿,2008-04-25收修改稿

　＊国家重点基础研究发展计划(批准号:2007C B109000)和国家自然科学基金(批准号:30671297)资助项目　＊＊通信作者,E -mail :w heat3392@cau .edu .cn ;qxsun @cau .edu .cn

摘要 等位基因变异是生物体基因组中普遍存在的现象,也是物种进化和育种的重要基础.等位基因可以通过编码区的改变或者表达来影响基因的功能,因此研究等位基因的表达具有重要的

生物学意义.由于小麦基因组的复杂性,造成等位基因的鉴定比较困难,这极大地制约了小麦等位基因表达研究的开展.利用CA U36和CA U328两个ES T -SSR 标记,结合变性高效液相色谱(dHPLC )分析技术,在35个小麦基因型中分别检测到4种和3种等位变异类型,并且以抽穗期的穗下节节间为材料,对其在4×6的小麦双列杂交组合杂交F 1代中进行了表达分析.结果表明,这两个ES T -SSR 引物扩增的等位基因在多个组合中均存在显著的差异表达,且CA U36标记检测到的等位基因表达变化值与部分杂交种的株高之间存在显著的相关性.

关键词 EST

-SSR 等位基因　表达变异　变性高效液相色谱　小麦 等位基因是位于一对同源染色体的相同位置上而序列有差异的基因,其变异是物种进化和育种的重要基础.在植物上,对一些重要的农艺性状基因(水稻的淀粉合成酶基因(Oriza sativa )和玉米(Zea may )的D war f8矮秆基因)的等位基因变异分析已有较多报道,并已鉴定出了多个功能优异的等位基因[1,2]

.研究表明,不同等位基因之间的序列差异

主要表现为单核苷酸多态性及较短序列的插入或缺

失

[3]

,而这些变异可能会引起编码蛋白质的改变,

也可能通过影响基因的表达水平而导致基因功能发生差异[4].

不同等位基因不仅存在序列变异,也存在表达上的变异[4].全基因组水平上的表达分析结果显示,等位基因差异表达在人类(H omo sapiens )、小鼠(Mus musculus )、果蝇(D rosophila melano -gaster )和拟南芥(Arabidopsis thaliana )中是广泛存

在的[5—9],并且可能与生物的抗病和抗逆性及杂种优势形成有关.例如,不同等位基因对于非生物逆境的响应存在明显差异,其在抗旱过程中所起的作用可能有所不同[4].又如,在授粉早期的玉米杂合子胚中来自父本的部分等位基因就已经被激活,并且在授粉后15d 的杂合子胚中,来自两个亲本的许多等位基因存在表达差异,这可能与胚的杂种优势有关[10,11].

关于小麦的等位基因序列和表达变异研究也有报道,其中对品质相关基因,如编码麦谷蛋白、醇溶蛋白、淀粉合成酶和多酚氧化酶基因的研究最为深入,但主要集中在基因组和蛋白质水平.迄今为止,在转录水平上对小麦等位基因表达的研究相对较少,这是因为普通小麦A ,B 和D 三个不同基因组上的部分同源基因存在很高的序列相似性.例如,Shitsukava 等

[12]

对小麦MADS -BOX 基因

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W SE P的研究发现,其对应的3个部分同源基因具有相似的基因组结构和表达谱,因此对每个位点上的等位基因表达进行研究具有一定难度.

最近,以大规模的cDNA测序为基础而新开发出了一种新的标记类型,即ES T-SSR(Exepressed Sequence T ag SSR).该标记来自表达的基因内部,是对基因组转录区域变异的直接鉴定,该标记已被广泛应用到植物遗传多样评价和遗传图谱构建中.对小麦的研究结果表明,许多EST-SSR标记具有非常高的特异性,因此可以利用这些标记进行小麦等位基因表达分析.

变性高效液相色谱(dH PLC)是一种高通量筛选DNA序列变异的新技术.该方法具有自动化、准确快速、检出率高等特点,现已广泛应用于与人类疾病相关基因的突变分析上,但应用在植物上的相关研究比较少.Guo等利用dH PLC方法探讨了玉米F1代杂交种中两个等位基因的相对表达量,在所研究的15个基因中,有11个存在等位基因表达差异[4].在本研究中我们利用CA U36和CA U328两个ES T-SS R标记,结合dH PLC技术,鉴定了35份不同小麦品种(系)中的等位基因变异类型,并配制了4×6的小麦双列杂交组合,以抽穗期的穗下节节间为材料,对这两个基因在杂交F1代中的等位基因表达差异进行了分析,发现其中一个基因的等位表达变异与部分杂交种的株高之间存在显著的相关性.

1　材料和方法

1.1　实验材料

供试的35个小麦材料包括来自我国北方的30份普通小麦品种(系),1份斯卑尔脱小麦以及4份穗分枝小麦(表1).同时,以6份普通小麦(5027, 5097,5084,3472,3197和3159)品种(系)为母本,4份穗分枝小麦为父本配制4×6的不完全双列杂交组合.亲本及杂交F1代播种于中国农业大学昌平试验站,抽穗期各取20株穗下节节间混样,进行EST-SSR标记及其等位基因的表达分析.

选用以农大3338为母本,以Altg old为父本所构建的重组近交系群体F2:8后代175个株系为材料,对ES T-SS R标记进行染色体定位分析.

表1　35个小麦基因型的名称及来源

编号名称来源编号名称来源

13338中国农业大学19270中国农业大学

22463中国农业大学203159中国农业大学

36554北京农林科学院213197中国农业大学

43214中国农业大学223218中国农业大学

53235中国农业大学233251中国农业大学

6227中国农业大学243458中国农业大学

7101中国农业大学253472中国农业大学

8390北京农学院263672中国农业大学

9411北京市种子公司273741中国农业大学

10皖38安徽省涡阳县农业

科学研究所

285019中国农业大学

11晋72山西农业科学院295021中国农业大学

12豫66河南省豫东农作物

品种展览中心

305029中国农业大学136036中国农业大学315084中国农业大学145027中国农业大学325097中国农业大学

15分841山西农业科学院33224中国农业大学

16普分3山西农业科学院344185河北石家庄市农业

科学研究所

17圆81山西农业科学院35中农4中国农业科学院

18柱1山西农业科学院

1.2　DNA和RNA提取

取供试小麦材料的穗下节节间,采用CTAB法进行DNA提取.RNA提取选用T RNzo l总RNA 提取试剂(DP405-01,Tiangen).提取的RNA用RQ1RNase-Free DNase(M6101,Promega)进行纯化,所有操作按照产品说明书进行.

1.3　cDNA合成

cDNA合成反应总体系为20μL(含2μg总RNA,50m mol/L Tris-HC l(pH8.3),75mm ol/L KCl,3mmol/L MgCl2,10mmol/L DTT,50μmol/L dNTPs,锚定引物50pmol,RNase抑制剂20U, M M LV反转录酶200U),37℃温育2h,取1μL用于PCR反应.

1.4　利用EST-SSR标记进行等位基因变异筛选

实验所用的两个ES T-SSR标记CA U36和CA U328,为本实验室根据GenBank中的小麦ES T 获得,并在中国春缺体-四体系或3338/A ltg old重

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组近交系上进行了染色体定位(结果未发表).微卫

星引物序列如下:

CAU36-L:5′CGTTCGTCATGGTTACCTCC3′,

CA U36-R:5′CCC TCA T TGA T TTA TT TGT-TCG3′;

CAU328-L:5′GATATGGAGTGGAGGCAAGC3′,

CA U328-R:5′AAGTCGA TGGTGAC TGAC-CC3′.

PCR扩增反应体积为20μL,内含PCR缓冲液,1.5mmol/L MgCl2,200μmol/L dNTPs,50ng 微卫星引物和50—100ng模板DNA,1U Taq DNA 聚合酶.反应程序:94℃变性3min;94℃30s, 60℃30s,72℃30s,共28个循环;72℃延伸7min.取2.5μL扩增产物经5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳约1h后硝酸银染色.

1.5　EST-SSR标记等位基因的克隆和鉴定

以CA U36和CAU328为引物各检测到4种和3种等位变异类型,按序列由小到大的顺序,分别命名为CAU36-A,CAU36-B,CAU36-C,CAU36-D 和CA U328-A,CAU328-B及CA U328-D.对于每种等位变异类型,选择一个品种(系)的扩增条带进行回收测序.测序结果用CLUSTA L W程序进行序列比对.

以CA U36和CAU328标记对应的cDNA序列为种子序列,利用BLAS TN在GenBank的EST库中搜索与之高度同源的小麦EST序列,再利用DNAM AN软件把这些ES T拼接在一起,根据这些序列设计引物进行RT-PCR.引物序列如下

CA U36-P1:5′-A TGGAGGAGAGTGGGAGC-G TG-3′,

CA U36-P2:5′-CCCCTCAT TGAT TTA T TT-G TTCGT T-3′;

CA U328-P1:5′-CACCACCAACAACAA TCT-GAA-3′,

CA U328-P2:5′-AAG TCGA TGG TGACTGA-CCC-3′.

将扩增产物连接到PGEM-T载体(Promega)上进行测序.通过BLASTX在GenBank中进行氨基酸同源比对,推测EST序列可能代表的基因功能.1.6　等位基因差异表达分析

以4×6组合亲本及其杂交F1代穗下节间的DN A和cDNA为模板,按前述条件对小麦β-Actin (引物序列β-Actin-L:5′-GGAATCCA TGAGAC-CACC TAC-3′,β-A ctin-R:5′-GACCCAGACAAC-TCGCAAC-3′),CAU36和CA U328进行PC R扩增,每个反应做3次重复.

dH PLC检测系统的流动相由A液(0.1m ol/L TEAA,0.025%乙腈)和B液(0.1m ol/L TEAA, 25%乙腈)按设定梯度自动混合而成.进样器自动吸取5μL PCR产物注入DNASep柱(TRANS-GENOM IC),柱温为50℃.运行梯度:时间(min)/ A缓冲液浓度/B缓冲液浓度,分别为0/65%/ 35%,1/60%/40%,17/28%/72%,每个程序运行时间为19.5min,溶液流速为0.9m L/min,并根据目的基因与β-Actin基因扩增产物峰高值计算其比值.利用两尾等方差t测验的方法进行显著性检验.

1.7　等位基因差异表达与株高的相关分析

以等位基因表达的变化值(H比值-P比值)为变量,与2004—2005和2005—2006两年度杂交F1代的株高进行相关性分析(用Micro soft Excel软件的CORREL函数).

2　结果与分析

2.1　小麦等位基因变异的鉴定和序列分析

以35份小麦品种(系)的DNA为模板,利用CA U36和CA U328两个ES T-SSR引物进行的PCR 扩增结果表明,CAU36和CAU328引物分别扩增出4和3条多态性带(图1).为了进一步确定检测到的等位变异序列信息,对于每种多态性类型,选择一个品种(系)的扩增条带进行测序.由图2可以看出,在CAU36的4种等位变异类型中,均存在串联重复序列(T TG),其中A和D变异类型中的重复次数都为13次,而B和C分别为8和14次.进一步分析发现,与其他变异类型相比,D中存在一个小片段(GGA TT T)的插入.另外,还检测到两个碱基突变位点.在CAU328的3种等位变异类型中,也存在重复序列结构(AC T),其中A和B变

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异类型的重复次数都为6次,而C 类型为5次.与C 类型相比,A 在两个位点有小片段的缺失,而B

类型中仅在其中一个位点上存在缺失.另外,也发

现一个单碱基突变位点.这说明,利用EST -SSR 标记检测的等位基因变异并不是全部由于重复次数的差异引起的

.

采用生物信息学方法,结合RT -PCR 分析,我们获得了与CA U36和CAU328对应的cDNA 序列.在GenBank 中进行氨基酸同源比对分析后发现,CA U36和CA U328所代表的基因分别编码紫

杉醇乙酰转移酶(tax adieno l acety l transferase -like )和单链核酸蛋白(Single -stranded nucleic acid bind -ing R3H ),分别命名为TaAL (基因登录号E U569762)和TaAM (基因登录号EU569763).核

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苷酸比对分析结果显示,CAU36和CA U328扩增片段分别位于上述两个cDNA 序列的3′端不翻译

区,并且没有内含子的存在(结果未显示).另外,利用CA U36标记,以3338×Altgold 重组近交系群体为材料,将TaAL 基因定位在4A 染色体长臂上,

位于标记Xksm216和Xkam206之间(结果未发表).以中国春缺体-四体系,将TaAM 定位于4A 染色体

上(图3).因此,可以利用上述两个EST -SSR 引物进行等位基因表达分析

.

图3　CAU36和CAU328标记的染色体定位

(a )以3338×Altgold 重组近交系群体建立的小麦4A 染色体上的SS R 标记连锁图谱.CA U36定位于4A 染色体长臂上;(b )CA U328引物扩增中国春第四部分同源群缺体-四体系,电泳结果显示CAU328也定位于4A 染色体上

2.2　等位基因的差异表达分析及其调控模式预测我们以4×6的小麦双列杂交组合及其亲本抽

穗期的穗下节节间为材料,采用PC R 方法,结合变性高效液相色谱(dH PLC )技术,对等位基因的表达水平进行分析.为了保证表达结果的可靠性,首先以杂种F 1代的DN A 为模板进行了分析(图4),发现来自两个亲本的不同等位基因的扩增产物在数量上差异不显著,表明这两对EST -SSR 引物在不同小麦品种(系)中是非常保守的,可以用于等位基因表达分析

.

图4　部分杂交F 1DNA 水平的等位基因检测结果

等位基因类型(a )C AU36(3472/分841);(b )CAU328(5084/圆81)

等位基因的表达变异可以用两个参数来反映,即P 比值(亲本间等位基因表达水平之比)和H 比值(杂交种中来自两个亲本等位基因表达水平之比).以CA U36引物进行的表达研究结果显示,在13个杂交组合中,有6个P 比值经t 检验证实达到显著水平,而H 比值有8个差异显著(p <0.05)(表2).对CAU328检测结果分析发现,在11个杂交组合中,有7个P 比值达到显著水平,而H 比值仅有3个达到显著水平(p <0.05),说明在这些杂交组合中等位基因存在明显的表达差异.进一步分析发现,H 比值的变化与亲本的遗传背景和所分析的基因有关,例如分841与不同亲本配制的所有杂交F 1代个体中用CA U36检测到的H 比值均达到显著水平,但是用CA U328检测到的H 比值均未达到显著水平.

在杂交种中,由于来自两个亲本的等位基因处于同一个细胞中,两者背景相同,如果H 比值≠1,则表明等位基因的表达差异受顺式作用(Cis )的调

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控;如果H比值=1,则不存在Cis的作用,此时如果P比值≠1,则基因的表达受反式作用(Trans)调控;如果H比值≠1且P比值≠1,则基因的差异表达受Cis和Trans的共同作用[8].依据P比值和H比值的关系,可以把等位基因的调控模式分为几类:(i)无变异型(Co nserved)(等位基因不存在表达差异,即:P比值=1且H比值=1);(ii)顺式作用调控(P比值≠1,H比值≠1,P比值=H 比值);(iii)反式作用调控(P比值≠1,H比值= 1);(iv)Cis+Trans(P比值≠1,H比值≠1,P 比值>H比值)[13];(v)Cis×Trans(H比值≠1, P比值

表2　不同杂交组合中CAU36标记检测的

等位基因表达比值及其调控模式

P比值a)H比值b)调控模式

5027/普分31.1911.240无变异型

5027/圆810.9111.289＊Cis×Trans

3472/分8410.9951.760＊Cis×Trans 3472/普分31.330＊1.395＊Cis

3472/圆810.9412.093＊Cis×Trans 3472/柱10.9191.115无变异型

3197/分8410.762＊1.298＊Cis×Trans 3197/普分30.8831.254无变异型

3197/圆810.746＊1.277＊Cis×Trans 3197/柱10.610＊1.117Tr ans

5097/分8410.8031.239＊Cis×Trans 5097/柱10.682＊1.065Tr ans

3159/分8410.8791.265＊Cis×Trans

＊差异达到显著水平,p<0.05

a)P比值:母本等位基因与父本等位基因表达量之比;b)H比值:杂交F1中,来源于母本的等位基因与来源于父本等位基因表达量之比

表3　不同杂交组合中CAU328标记检测的

等位基因表达比值及其调控模式

P比值a)H比值b)调控模式5027/普分30.601＊0.842Trans

5027/圆811.0610.936无变异型

5027/柱11.1401.100无变异型

3197/分8411.637＊0.950Cis×Tr ans

3197/普分31.0290.678＊Cis×Tr ans

3197/圆811.816＊0.941Trans

3197/柱11.952＊1.119Trans

5097/分8411.299＊0.887Trans

5097/柱11.549＊1.083Trans

5084/圆810.8200.692＊Cis×Tr ans

5084/普分30.464＊1.777＊Cis×Tr ans

＊差异达到显著水平,p<0.05

a)P比值:母本等位基因与父本等位基因表达量之比;b)H比值:杂交F1中,来源于母本的等位基因与来源于父本等位基因表达量之比

2.3　等位基因差异表达与杂交F1株高之间的关系

对2004—2005和2005—2006年度本实验所用的4×6的小麦双列杂交组合的农艺性状进行了分析,发现不同杂交F1代植株在株高性状上存在明显的差异(结果未发表).许多研究表明,穗下节对小麦株高贡献最大[14,15].因此,为了进一步探讨这些等位基因差异表达与株高之间的关系,我们将等位基因表达变化值与杂交F1的株高进行了相关分析.结果发现,利用CA U36和CA U328检测到的等位基因表达变化值与相应杂交F1株高之间的相关系数都未达到显著水平(表4).而以分841为父本配制的4个杂交F1代个体(3472/分841,3197/分842,5097/分841和3159/分841)用CA U36检测到的H比值均达到显著水平,我们将这些F1中等位基因的表达变化值与其株高进行相关分析发现,在两个年度均达到显著水平(p<0.01),与两年的株高平均值也存在显著的相关关系(p<0.01) (表4),说明这些等位基因的表达变异可能与株高的生长发育有关.

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表4　各杂交组合中等位基因表达的变化值与株高的相关系数2004—2005年2005—2006年两年度平均值

10.115-0.0360.038

20.0980.5330.355

30.968＊＊0.937＊＊0.970＊＊

＊＊差异达到极显著水平,p<0.01

1.CAU36标记检测的等位基因表达变化值与株高的相关系数;

2.CA U328标记检测的等位基因表达变化值与株高的相关系数;

3.CA U36标记检测的以分841为共同父本的4个杂交组合(3472/分841,3197/分841,5097/分841和3159/分841)等位基因表达变化值与株高的相关系数

3　讨论

迄今为止,对基因组水平的等位基因变异研究已有大量报道,并且开发出了多种等位基因表达检测方法,如单链构象多态性(SSCP)、焦磷酸测序、变性高效液相色谱和基因芯片等.由于普通小麦的多倍体遗传特点,导致研究小麦的等位基因表达具有很大的难度.Bottley等[16]采用SSCP技术对236个小麦单拷贝基因进行了研究,并认为利用该方法可以检测基因表达的有无,但很难量化分析.目前已知,1.34%的小麦ES T具有SSR重复序列,由此已经开发出了大量ES T-SSR标记,并且其中许多仅能扩增出单一条带.例如,Gao等[17]对88个新开发的小麦EST-SSR标记进行了定位分析,发现仅有10个被定位到多个位点上,其余78个位于单一染色体位点上.本实验利用EST-SSR标记,结合dH PLC方法,成功分析了多个小麦杂交组合中等位基因的相对表达水平,并与DNA扩增结果进行了比较,证明可以利用EST-SS R开展小麦等位基因表达研究,这也为更有效地利用ES T-SSR 标记提供了一个新的利用途径和思路.由于普通小麦为异源六倍体,所以该物种中的大部分基因具有3个部分同源的拷贝,但是在基因组结构上具有很高的相似性,对每个位点上的等位基因表达进行研究具有一定难度.因此,本实验中仅选择扩增单一位点的引物进行了等位基因表达变异研究.为进一步明确普通小麦中3个位点上等位基因的表达差异,可以在所有基因序列获得的基础上,找出每个等位基因的特异引物或者酶切位点,采用RT-PCR 或酶切扩增产物多态性位点(CAPS)[18]方法,结合dH PLC技术,对等位基因的表达进行精确的定量分析.在实验过程中,我们也发现dH PLC方法存在一些局限性,例如对检测的DNA片段长度具有较高的要求,以100—300bp为最佳;而且对仅存在单碱基突变的等位变异分析有一定难度.

由于等位基因表达的复杂性,导致对于其差异表达的调控机制认识仍非常有限.研究表明,基因表达受顺式作用元件和反式作用因子的影响,其中顺式作用元件主要有启动子和增强子等,而反式作用因子主要有RNA聚合酶及各类转录因子.通过等位基因的差异表达分析,可以推测出其表达的调控模式.酵母(Saccharomy ces cerevisiae)和人类医学的研究表明,反式作用因子在基因差异表达中起更重要的作用[19—21].Wittko pp等[8]对果蝇种间等位基因的表达差异进行分析后认为,顺式和反式调控都有重要贡献.以上研究都以较少的实验材料为研究对象,对多个基因的等位表达变异进行分析,因此没有涉及多个不同遗传背景.本实验我们以多个杂交F1代个体及其亲本为材料进行了研究.结果发现,在CA U36的检测结果中,有9个组合中存在等位基因表达差异,占所鉴定组合总数(13个)的69.2%,其中7个为Cis×Trans模式.CAU328的研究结果显示,也有9个组合存在等位基因表达差异,占组合总数的81.8%,其中5个为Trans模式,4个为Cis×Trans模式.因此,顺式作用元件和反式作用因子对小麦等位基因的表达调控也是普遍存在的,这与果蝇上的研究结果类似,但是调控模式与所研究基因及小麦材料类型有关,这也说明小麦中等位基因表达及其调控是极其复杂的.

以玉米杂交种及其亲本自交系的叶片、胚和胚乳等不同组织器官为材料研究发现,杂交种中的等位基因存在广泛的表达变异,并认为这可能与玉米杂种优势形成有关[10,11,22,23].实验中我们对株高进行了观察,发现其中在抽穗期的穗下节节间中存在显著的等位表达变异,并且其中一个基因的等位基因表达变异与部分杂交F1代株高之间存在显著的相关关系,说明不仅基因表达总量的改变与杂种优势形成有关,在杂交种遗传背景下,等位基因的差异表达也可能与杂种优势形成有关.目前的结果仅是一种现象,进一步的研究重点应是获得不同等位

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基因的全长序列,明确等位表达变异产生的原因及生物学功能,进而分析其在小麦株高杂种优势形成过程中的作用.

参　考　文　献

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　第18卷　第11期　2008年11月

化学分析试题及答案

化学分析试题及答案 一、判断题。10分 1、（× ）在化学定量分析中，常采用的分析方法是微量分析。 2、（√ ）金属指示剂与金属离子生成的配合物的稳定性应比金属EDTA配合物的稳定性要差一些。 3、（√ ）指示剂的变色范围越窄越好。 4、（× ）酸碱滴定中溶液愈浓，突跃范围愈大，可供选择的指示剂愈多。 5、（√ ）当金属离子与指示剂形成的显色配合物的稳定性大于金属离子与EDTA 形成的配合物的稳定性时，易产生封闭现象。 6、（× ）高锰酸钾法通常在强酸性溶液如HNO 溶液中进行。 3 7、（√ ）使用酸式滴定管时，应大拇指在前，食指和中指在后。 8、（√ ）随机误差具有重复性，单向性。 9、（× ）滴定分析中，指示剂颜色突变时停止滴定，这一点称为化学计量点。 10、（× ）有两组分析数据，要比较它们的测量精密度有无显着性差异，应当用Q验。 二、选择题。20分

1、分析化学依据分析的目的、任务可分为：…………………………………………（ A ） A：定性分析、定量分析、结构分析 B：常量分析、半微量分析、微量分析C：无机分析、有机分析 D：化学分析、仪器分析 2、下列误差属于系统误差的是：……………………………………………………（ B ） A：天平零点突然变化 B：读取滴定管的度数量偏高 C：环境温度发生变化 D：环境湿度发生变化 3、用于反应速度慢或反应物是固体，加入滴定剂后不能立即定量完成或没有适当的指示剂的滴定反应，常采用的滴定方法是：………………………………………………（ B ） A：直接滴定法 B：返滴定法 C：置换滴定法 D：间接滴定法 4、以下试剂不能作为基准物质的是：…………………………………………… （ D ） A：优级纯的Na 2B 4 O 7 ·10H 2 O B：99.99％的纯锌 C：105-110。C烘干2h的Na 2C 2 O 4 D：烘干的Na 2 C0 3

动物结核病原菌检测方法变性高效液相色谱法

动物结核病原菌检测方法变性高效液相色谱法 1范围 本标准规定了结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌多重PCR联合变性高效液相色谱（mPCR-DHPLC）检测方法的技术要求和操作规范。 本标准适用于快速检测细菌培养物、动物组织、血样、痰液等临床样品中结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 3.1 DHPLC：Denaturing high-performance liquid chromatography，变性高效液相色谱。 3.2 dNTP：deoxyribonuclesosde triphosphate，脱氧核苷三磷酸。 3.3 PBS：phosphate buffer solution，磷酸盐缓冲液。 3.4 mPCR：multiplex-polymerase chain reaction，多重聚合酶链式反应。 3.5 TEAA：三乙基铵醋酸盐 4 概述 人与动物结核病涉及多种病原菌或病原菌复合群。结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTC）是感染人与哺乳动物的结核病原菌，包括结核分枝杆菌和牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。其中，主要感染人与家畜并致病的是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。与MTC相对应的是种类繁多的各种非结核分枝杆菌（NTM）。NTM感染患者的临床症状及病理变化与MTC引起的结核病极为相似，但多数NTM对抗结核药物有天然耐药性。此外，NTM感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性。采用多重PCR联合变性高效液相色谱检测的方法可同步区分结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌复核群，并鉴别结核分枝杆菌与牛分枝杆菌 多重PCR反应的原理、操作过程与普通PCR相同。在同一PCR反应体系里加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模版不同区域扩增出多个目的DNA片段。DHPLC分析技术是利用液相色谱技术，在高压闭合液相流路中，将DNA样品自动注入并在缓冲液携带下流过DNA分离柱，DNA片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的DNA片段分离。由紫外或荧光检测被分离的DNA样品。根据DNA扩增片段长度大

高效液相色谱实验报告

高效液相色谱实验报告 一、实验目的 1了解液相色谱的发展历史及最新进展 2 学习液相色谱的基本构造及原理 3 掌握液相色谱的操作方法和分析方法，能够通过HPLC分离测定来对目标化合物的分析鉴定。 二、实验原理 液相色谱法采用液体作为流动相，利用物质在两相中的吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的。当两相做相对移动时，被测物质在两相之间进行反复多次的质量交换，使溶质间微小的性质差异产生放大的效果，达到分离分析和测定的目的。液相色谱与气相色谱相比，最大的优点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质，这类物质在已知化合物中占有相当大的比例，这也确定了液相色谱在应用领域中的地位。 高效液相色谱可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化合物。80%的有机化合物都可以用高效液相色谱分析，目前以已经广泛应用于生物工程、制药工程、食品工业、环境检测、石油化工等行业。 三、高效液相色谱的分类 吸附色谱法、分配色谱法、空间排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、化学键合相色谱法 四、高效液相色谱仪的基本构造 高效液相色谱至少包括输液系统、进样器、分离柱、检测器和数据处理系统等几部分。 1 输液系统： 包括贮液及脱气装置、高压输液泵和梯度洗脱装置。贮液装置用于存贮足够量、符合HPLC要求的流动相。高效液相色谱柱填料颗粒比较小，通过柱子的流动相受到的流动阻力很大，因此需要高压泵输送流动相。 2 进样系统： 将待测的样品引入到色谱柱的装置。液相色谱进样装置需要满足重复性好、死体积小、保证柱中心进样、进样时引起的流量波动小、便于实现自动化等多项要求。进样系统包括取样、进样两项功能。 3 分离柱： 色谱柱是色谱仪的心脏、柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。商品化的HPLC微粒填料，如硅胶和以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）等的粒度通常在3μm、5μm、7μm、以及10μm。采用的固定相粒度甚至可以达到1μm，而制备色谱所采用的固定相粒度通常大于10μm。HPLC填充柱效的理论值可以达到50000/m～160000/m理论板，一般采用100-300mm的柱长可满足大多数样品的分析的需要。由于柱效内、外多种因素的影响，因此为使色谱柱达到其应有的效率。应尽量的减小系统的死体积。 4 检测系统： HPLC检测器分为通用型检测器和专用型检测器两类。通用型检测器可连续测量色谱柱流出物（包括流动相和样品组分）的全部特性变化。这类检测仪器包括示差折光检测器、介

高效液相色谱法的应用

高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展 摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。 关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术 Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect. Keywords: high performance liquid chromatography，HPLC ,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques 引言： 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。 1 在药物分析中的应用 1.1 在药物鉴别中的应用 在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，

变性高效液相色谱在分子生物学中的应用

变性高效液相色谱在分子生物学中的应用 白 桦综述 邓大君 潘凯枫审阅 北京市肿瘤防治研究所病因室(北京,100034) 摘要 变性高效液相色谱法(DHPL C)是在高效液相色谱法的基础上发展起来的一种新方法。它因使用的温 度不同而有不同的应用价值:在非变性温度下进行双链DN A 分离,在部分变性温度下进行基因突变、单核苷酸多态性和甲基化测定,在完全变性温度下对寡核苷酸进行质控和纯化等。由于该技术具有快速、经济、准确和自动化程度高等特点,目前已经成为分子生物学常用技术之一。 关键词 变性高效液相色谱法;突变;单核苷酸多态性;甲基化;基因型 DNA 序列变异分析是遗传学研究的基础。随着人类基因组计划的完成,迫切需要一种敏感、高效、经济的方法来检测庞大的序列变异。大规模检测SNP 和突变的技术要求经济、自动化,高通量,无需修饰引物,无需纯化样品等。在目前分析点突变的诸多方法中,变性高效液相色谱法是少数能同时满足上述条件的技术之一。它可以自动检测单碱基置换,小片段插入和缺失。DHPLC 利用杂合双链和纯合双链部分变性温度的不同来检测这些变异。 1 DHPLC 的基本工作原理 DNA 分子带负电荷,而分离用色谱柱的固相呈电中性疏水性,因此DNA 分子本身不能直接吸附到柱子上。一种充当-桥梁.作用的分子)))离子对试剂TEAA(三乙铵醋酸盐),可以帮助DNA 分子与柱子固相填料表面分子结合,使TEAA 的阳性铵离子与DNA 相互作用,同时烷基链与柱子的疏水表面相互作用。这样DNA 分子越长,结合的TEAA 越多,与固相结合得越牢固。羟基链与固相结合的强度会随着流动相中乙睛浓度的增加而减弱,DNA 片段越长,结合的TEAA 越多,越不易被洗脱。因此DNA 片段大小分析是长度依赖性分离,而非序列依赖性分离。变性温度是影响DNA 片段分析的一个重要因素,变性温度升高保留时间缩短,在适宜的温度下可使DNA 双螺旋呈舒展状态,最大限度的暴露出用于离子对形成的磷酸根基团,使DNA 分子与分离柱产生很强的相互作用,因此40e ~50e 最适合做DNA 片段大小分析,随着温度的升高,分离效率迅速下降,较高的温度常用于进行突变分析。 如果一个二倍体细胞的单拷贝DNA 序列中的 碱基存在多态性,或其中一个等位基因(点)存在胚 系突变,则其杂合或突变位点上2种碱基的出现频率均等;如果组织中的部分细胞发生了均一的体细胞点突变(如肿瘤细胞),则组织中突变位点上2种碱基的出现比例不均等。在经历95e 变性再缓慢 复性后,这种存在多态或突变位点的靶序列PCR 产物会杂交形成杂合双链(heteroduplex )和纯合双链(homoduplex )混合物(图1)。 图2 N 端晶体结构 通常一个杂合个体中突变型G/C(或多态性)与野生型A /T 的比例是1B 1。分别进行P CR 扩增后,将两种产物混合并加热至95e 再缓慢降温,形成2种杂合双链(A/C 和G/T )和2种纯合双链(A /T 和G/C) 如果PCR 产物源自纯合子或者发生了纯合突变的个体,那么只有在与另外一种纯合野生型序列的PCR 产物混合,再变性复性,才能够形成上述杂合和纯合双链。杂合双链存在错配碱基,其变性温度低于纯合双链,当温度升高到一定程度,先于纯合双链在错配碱基周围解链变性,导致双链减少和单链增多。由于单链比双链所带的负电荷少,杂合双链比纯合双链更容易形成单链,其保留时间短于纯合双链,在图谱上先于未解链的纯合双链出现。随着变性温度升高,纯合双链也会部分变性,A=T 含有2个氢键,C S G 含有3个氢键,前者变性程度比后者低,因此先出现的峰为含有AT 的双链,后出现的为含CG 的双链。利用这种杂合和纯合双链在保

高效液相色谱习题及参考答案

高效液相色谱习题及参考答案 一、单项选择题 1. 在液相色谱法中，按分离原理分类，液固色谱法属于（）。 A、分配色谱法 B、排阻色谱法 C、离子交换色谱法 D、吸附色谱法2. 在高效液相色谱流程中，试样混合物在（）中被分离。 A、检测器 B、记录器 C、色谱柱 D、进样器 3. 液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜？ A、0.5μm B、0.45μm C、0.6μm D、0.55μm 4. 在液相色谱中，为了改变色谱柱的选择性，可以进行如下哪些操作？ A、改变流动相的种类或柱子 B、改变固定相的种类或柱长 C、改变固定相的种类和流动相的种类 D、改变填料的粒度和柱长 5. 一般评价烷基键合相色谱柱时所用的流动相为（） A、甲醇/水（83/17） B、甲醇/水（57/43） C、正庚烷/异丙醇（93/7） D、乙腈/水（1.5/98.5） 6. 下列用于高效液相色谱的检测器，（）检测器不能使用梯度洗脱。 A、紫外检测器 B、荧光检测器 C、蒸发光散射检测器 D、示差折光检测器 7. 在高效液相色谱中，色谱柱的长度一般在（）范围内。 A 、10～30cm B、20～50m C 、1～2m D、2～5m 8. 在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力（） A、组分与流动相 B、组分与固定相 C、组分与流动相和固定相 D、组分与组分

9. 在液相色谱中，为了改变柱子的选择性，可以进行（）的操作 A、改变柱长 B、改变填料粒度 C、改变流动相或固定相种类 D、改变流动相的流速 10. 液相色谱中通用型检测器是（） A、紫外吸收检测器 B、示差折光检测器 C、热导池检测器 D、氢焰检测器 11. 在环保分析中，常常要监测水中多环芳烃，如用高效液相色谱分析，应选用下述哪种检波器 A、荧光检测器 B、示差折光检测器 C、电导检测器 D、紫外吸收检测器 12. 在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（） A、提高柱温 B、降低板高 C、降低流动相流速 D、减小填料粒度 13. 在液相色谱中，不会显著影响分离效果的是（） A、改变固定相种类 B、改变流动相流速 C、改变流动相配比 D、改变流动相种类 14. 不是高液相色谱仪中的检测器是（） A、紫外吸收检测器 B、红外检测器 C、差示折光检测 D、电导检测器 15. 高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了（） A、恒温箱 B、进样装置 C、程序升温 D、梯度淋洗装置 16. 在高效液相色谱仪中保证流动相以稳定的速度流过色谱柱的部件是（） A、贮液器 B、输液泵 C、检测器 D、温控装置 17. 高效液相色谱、原子吸收分析用标准溶液的配制一般使用（）水

高效液相色谱仪培训测试题

高效液相色谱仪培训测试题 一、名词解释 1．分离度：相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。 2、保留时间：从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间间隔，即从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔。 二、填空题 1．高效液相色谱仪一般由输送系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统、数据记录处理系统五部分组成。 2．不对称峰有两种：T小于0.95为前延峰、T大于1.05为拖尾峰。 3、流动相使用前必须先脱气。 4．系统适用性试验包括理论板数、分离度、重复性、拖尾因子四个评指标。 5．在色谱条件中，固定相的种类、流动相组成、检测器类型不得改变，其余如流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、梯度洗脱程序中的时间长短、色谱柱的内径、长度、填料粒度、检测器的灵敏度等均可适当改变。 6．梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度、高压梯度。 三、问答题 简述提高分离度的几种途径？ 答：（1）增加塔板数。（2）增加选择性。A、改变流动相的组成；B、改变柱温；C、改变固定相。（3）改变容量因子，主要是改变流动相的配比、PH值、离子强度等，或改用梯度淋洗。 气相色谱仪培训测试题 1．气相色谱仪由气路系统、进样系统、柱分离系统、数据采集系统、数据处理系统、控制系统六个系统组成。 2．气相色谱法所能直接分离的样品应是可挥发、热稳定的物质，沸点一般不超过500度。 3、常用的载气有氦气、氮气、氢气或混有甲烷的氩气。 4、我公司的气相色谱仪所安装的检测器有火焰离子化检测器、电子捕获检测器两种。 5、各品种项下规定的条件中色谱柱种类、固定相的极性和检测器类型不得任意修改。 6、气相色谱仪主要是利用物质的沸点、极性、吸附性质的差异来实现混合物的分离。 7、气化温度可比样品中最高沸点组份的沸点高30~40度。 8、色谱柱使用一段时间后，基线会出现波动或鬼峰，解决此问题的办法是老化。

高效液相色谱分析中异常峰的分析与处理_龚时琼

高效液相色谱分析中异常峰的分析与处理 龚时琼 (华中科技大学化学与化工学院,湖北武汉 430074) 摘 要:高效液相色谱(hig h perf ormance liquid chr omato gr aphy ,H PL C)在高等院校、医药卫生、食品、环保等多个领域的应用越来越广泛。叙述了高效液相色谱仪的工作原理,针对高效液相色谱分析中的异常峰问题进行了分析,并提出了相应的处理方法。关键词:高效液相色谱仪;异常峰;缓冲液 中图分类号:O 657.7 文献标志码:B 文章编号:1002-4956(2010)06-0037-02 Analysis and treatment of unusual peaks in analysis of high performance liquid chromatography Gong Shiqiong (School of Chemistry and Chemica l Eng ineering.H uazhong U niversit y of Science and T echnolog y,Wuhan 430074,China) Abstract:T he hig h perfo rmance liquid chro matog raphy (H PL C)is increasing ly w ide in application,for ex am -ple,colleges and universit ies,medicine health,fo od,env iro nmental pro tect ion,and so o n.T he buffer solution was cho sen and unusual questio ns w ere pro cessed. Key words:hig h per for mance liquid chr omato gr aphy(H PL C);unusual peak;buffer solution 收稿日期:2009-06-17 作者简介:龚时琼(1969)),女,湖北省仙桃市人,工程师,主要从事大 型仪器设备的使用、研发与管理维护. E -mail:370749606@https://www.wendangku.net/doc/b55500329.html,;gongs hiqiong@https://www.wendangku.net/doc/b55500329.html, 高效液相色谱(H PLC)具有分离效率高、分析速度快和应用范围广等特点,特别适合于高沸点、大分 子、强极性和热稳定性差的化合物的分离、分析。自20世纪60年代后期发展以来,是现代分离测定的重要手段[1] 。目前高效液相色谱已成为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检和法检等领域中重要的分离技术,是分析化学和生物化学等用于解决各种实际分析和分离课题必不可少的工具之一。但在高效液相色谱分析中因各种原因会经常出现异常峰形,严重影响对结果的分析。 1 高效液相色谱仪工作原理 高效液相色谱仪是由溶剂贮液器、高压泵、进样器、色谱分离柱、检测器和数据处理系统等部分组成。 高压泵从溶液贮液器中抽走流动相,流经整个仪器系统,形成密闭的液体流路。样品通过进样系统注入色谱分离柱,在柱内进行分离。柱流出液进入检测 器,使已被分离的组分逐一被检测器收集,并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰,通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算,从而完成整个分析过程 [2] 。 2 异常峰分析 异常的色谱峰指的是色谱图中的无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。异常峰是色谱实验工作中最棘手的问题。这些峰严重影响色谱分析的结果。色谱图中不可能有纯正的高斯对称峰,轻微的拖尾是正常的,这是由分离系统所决定的。在此仅对其中几种异常峰进行分析。2.1 峰前或峰后有小峰的分析 某个单组分样品的大峰附近带小峰,如图1中的第3个峰右下的小峰以及图2中第2个峰左下的小峰。产生原因大致分为以下几种情形,针对不同情况可采取具体的措施是完全可以解决此种异常峰的。 (1)样品不纯。可改变不同的流动相和色谱柱,对样品进行分离比较,选择合适的分离条件。(2)分析柱或保护柱柱头塌陷。此情况较常见,可更换分析柱或保护柱后对峰形进行比较。柱头塌陷时往往所有的峰都会出现峰分裂[3] 。对色谱柱再生和 ISS N 1002-4956 CN11-2034/T 实 验 技 术 与 管 理 Ex perim ental Technology and M anagem ent 第27卷 第6期 2010年6月Vol.27 No.6 Ju n.2010

高效液相色谱思考题试卷及答案

高效液相色谱法的习题和参考答案 思考题与练习题 1.高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的？ 解： 气相色谱理论和技术上的成就为液相色谱的发展创造条件，从它的高效、高速和高灵敏度得到启发，采用5-10μm微粒固定相以提高柱效，采用高压泵加快液体流动相的流速；设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器，提高检测灵敏度，克服经典液相色谱的缺点，从而达到高效、快速、灵敏。 2.简述液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素，如何减少谱带扩，提高柱效？ 解： 液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动相传质、停留流动相传质及柱外效应。 在液相色谱中要减少谱带扩，提高柱效，要减少填料颗粒直径，减小填料孔穴深度，提高装填的均匀性，采用低黏度溶剂作流动相，流速尽可能低，同时要尽可能采用死体积较小的进样器、检测器、接头和传输管线等。 3.色谱柱A柱长为15cm，载体粒度为5μm。另一B柱长为30cm，载体粒度为10μm。两 柱的柱效相等吗？ 解： ∵l=L/dp ∴lA=15/0.0005=30000 lB= 30/0.0010=30000 A柱的折合柱长为30000，B柱的折合柱长也为30000，表明组分在两根柱从柱入口到出口都经过30000个载体颗粒，两柱的柱效相等。 4.流动相为什么要脱气？常用的脱气方法有拿几种？ 解： 流动相中溶解气体存在以下几个方面的害处

（1）气泡进入检测器，引起光吸收或电信号的变化，基线突然跳动，干扰检测； （2）溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流动相或固定相发生化学反应； （3）溶解气体还会引起某些样品的氧化降解，对分离和分析结果带来误差。因此，使用前必须进行脱气处理。 常用的脱气法有以下几种: （1）加热脱气法； （2）抽吸脱气法 （3）吹氦脱气法； （4）超声波振荡脱气法。 5.在液相色谱中。常用作固定相，又可用作键合相基体的物质是 A. 分子筛 B. 硅胶 C. 氧化铝 D. 活性炭 解： B硅胶 要形成化学键合固定相，所用的基质材料应有某种化学反应活性，在四种固体固定相中只有硅胶含有硅醇基，是能进行键合的活性官能团。 6.在150×Φ2mm硅胶柱流动相为己烷/甲醇（150:2），紫外检测器色谱条件下分离丙烯 酰胺，判断以下组分的出峰次序，为什么？ A. B. 解： 在给定的色谱条件下，组分B先出峰，组分A后出峰。以硅胶为固定相，己烷/甲醇（150:2）为流动相，该体系为正相色谱，样品的极性A>B，在正相色谱体系极性小的组分先出峰，极性大的组分后出峰，所以出峰次序为B先出，A后出。 7.在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留时间为30min，如果改用四氯化碳或乙醚 为流动相，试指出选用哪中溶剂能减少该组分的保留时间？为什么？ 解： 该体系为正向色谱体系。在该体系中流动相的极性增大保留值减少。流动相甲苯、四氯化碳及乙醚的溶剂强度参数分别是0.29、0.18、0.38，因此选用溶剂强度参数大于甲

变性高效液相色谱原理

高效液相色谱原理 DHPLC变性高效液相色谱技术是近年来发展起来的一项新的分析技术，它是分离核苷酸片段及分析检测已知未知基因突变和SNP的最佳技术平台，其核心技术采用Transgenomic公司专利技术的DNA SepCartridge分离柱。DHPLC能够分析检测已知未知突变和SNP，技术关键是依靠这样专利技术的分离系统，在专利技术的DNA SepCartridge分离柱中的基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）交联聚合物微球体，固定相为碳-18烷烃链，PS-DVB微球体与碳-18烷烃链之间形成碳碳共价键共同组成柱填料，填料是电中性、疏水性的，不易与核酸发生反应。三乙基铵醋酸盐（TEAA）是一种离子对试剂，离子对试剂既是疏水性的又带正电荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时TEAA的疏水基团又与固定相碳-18链的疏水基团发生反应。这种离子对试剂是连接核酸和柱基质之间的桥梁，因此，它作为“桥分子”使DNA片段吸附在固定相上面。通过改变流动相中乙氰及离子对试剂的浓度实现DNA片段的分离。

WAVE? DHPLC分离系统的三种操作模式： WAVE?系统是一套经济、高效及多用途的仪器。标准WAVE系统提供可选择的冷却设备、双板自动进样器、柱箱、紫外检测器和分离柱组成。这套系统可在同一分析标准下实现三种模式的运行。将标准WAVE系统加工和升级可以进一步提升系统的可用性。 执行模式温度应用分离基础 非变性 50℃测量双螺旋DNA的大小（小于2000bp）依赖大小 PCR质量检测及纯化依赖序列定量分析

部分变性 52-75℃变性检测依赖大小 （平均范围）单核酸多态性检测依赖序列完全变性 75-80℃测量双螺旋DNA大小（小于2000bp）依赖大小 （平均范围） DNA分析（DNA SepR柱）依赖序列 寡核苷酸质量（DNA SepR柱和OLIGO SepR柱）和纯度分析（片段收集器） 大量纯化需要OLIGOSepPrep TM HC柱 非变性条件：依赖分子量的分离

高效液相色谱中异常峰分析范文

异常峰分析 异常的色谱峰指的是色谱图中的无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。异常峰是色谱实验工作中最棘手的问题。这些峰严重影响色谱分析的结果。色谱图中不可能有纯正的高斯对称峰 , 轻微的拖尾是正常的 , 这是由分离系统所决定的。在此仅对几种异常峰进行分析。 1.峰前或峰后有小峰的分析 产生原因大致分为以下几种情形 (1) 样品不纯。可改变不同的流动相和色谱柱 ,对样品进行分离比较 , 选择合适的分离条件。 (2) 分析柱或保护柱柱头塌陷。此情况较常见 ,可更换分析柱或保护柱后对峰形进行比较。柱头塌陷时往往所有的峰都会出现峰分裂。对色谱柱再生和清洗可以改善分离效果。

(3) 色谱柱柱容量下降。当长时间使用后 , 有一些强保留组分吸附在柱子中 , 不大的进样量往往就会出现峰分裂。用强洗脱能力的溶剂清洗色谱柱 , 或更换色谱柱可使问题得到改善。 (4) 样品溶剂与流动相不匹配或进样体积过大。当样品溶剂比流动相极性大时 , 有时即使进样体积很小 , 也容易出现峰变形和裂分现象。建议用流动相溶解样品。 (5) 流动相不恰当。此情况较罕见 , 有些样品在特定的色谱条件下可能存在结构的动态平衡 , 而出双峰 , 这种双峰是无法分离完全的 , 改变色谱条件尤其是p H 值会使峰形正常。 (6) 样品分解。不稳定的样品在色谱分离过程中变成其他物质而出现双峰。这时需改变样品处理方法或色谱分离条件。 2.负峰分析 在色谱分析中有时会出现负峰或倒峰 , 如图 3 中的大峰的左下就有一负峰。出现这种现象可能是由以下几种原因引起的 , 可针对不同情况进行排除 , 进而使问题得到解决。 (1) 流动相吸收本底值过高。此时可适当改变检测波长。 (2) 进样过程中进入空气。进行排气处理 , 直到基线平稳再进样。 (3) 样品组分的吸收低于流动相。可改变流动相或改变检测波长。 (4) 配制样品的溶液与流动相不一样。重新配制样品 , 用与流动相一样的溶剂配制或稀释样品。 3.前沿、拖尾峰分析 拖尾：1 干扰峰，优化条件分离；2 色谱柱塌陷，更换色谱柱； 3 流动相pH 不合适，调节pH值；4 管路没有接好，存在较大的死体积，可以重新接一下。 前沿：1 溶剂选择不合适，选择合适的溶剂；2 样品过载，降低进样量； 3 柱温太低，升高柱温；4 色谱柱损坏，更换色谱柱； 图谱前沿和拖尾的原因主要是流动相选择不合适，可以相应调整流动相的极性，或者适当加入酸来调整，可以得到较好的改善。一般来讲，酸碱在流动相中对于前沿和拖尾影响较大。柱前沿是可能因为柱超载，拖尾是可能因为样品被污染，选择合适的流动相，调节好PH能够改善这以情况。 前辈们总是会告诉我们，拖尾峰与柱子有关，可能是过载，稀释样品再做，或换新柱做。有时候托尾峰往往是有机性相近杂质没有分开，此时，可以优化分析方法，或更换柱子试一试；也可能由于柱子使用时间太久柱效下降出现塌陷等原

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高效液相色谱试题 部门姓名得分 一、选择题 1. 在液相色谱法中，按分离原理分类，液固色谱法属于（） A. 分配色谱法 B 排阻色谱法 C. 离子交换色谱法 D. 吸附色谱法 2. 在高效液相色谱流程中，试样混合物在（）中被分离。 A. 检测器 B. 记录器 C.色谱柱 D. 进样器 3. 液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜？（） A.0.5 μm B.0.45 μm C.0.6 μ m D.0.55 μm 4.在高固定液含量色谱柱的情况下，为了使柱效能提高，可选 用( ) A. 适当提高柱温 B. 增加固定液含量 C. 增大载体颗粒直径 D.增加柱 5.在液相色谱中 , 为了提高分离效率 , 缩短分析时间 , 应采用的装置 是( ) A. 高压泵 B. 梯度淋洗 C. 6. 下列用于高效液相色谱的检测器，（贮液器 D.加温 ）检测器不能使用梯度洗脱。 A.紫外检测器 B.荧光检测器 C. 蒸发光散射检测器 D.示差折光检测器 7.在高效液相色谱中, 色谱柱的长度一般在( ) 范围内。 A.10-30cm B.20-50cm C.1-2cm D.2-5cm 8.在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是( ) A. 直形填充柱 9.纸色B. 毛细管柱 谱的分 C. Ｕ形柱 D. 离原理 螺旋形柱 ,与下列哪种方法相 似？( ) A. 毛细管扩散作用 B. 萃取分离 C.液- 液离子交换 10. 高效 液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了（） A. 恒温箱 B. 进 样装置 C. 程序升温 D. 梯度淋洗装置 D.液- 固吸附 二、填空题

1.高效液相色谱仪一般由、、、 、五部分组成。 2.流动相使用前必须先。 3.系统适用性试验包括、、、四个指标。 4. 梯度洗脱有两种实现方式：、。 三、名词解释 1.分离度： 2.保留时间： 四、简答题 1.在液相色谱中，色谱柱能在室温下工作，不需恒温的原因是什么？ 2.简述提高分离度的几种途径？

利用变性高效液相色谱(dHPLC)进行小麦等位基因差异表达分析＊____韩宗福--DNASep柱

第18卷　第11期　2008年11月 利用变性高效液相色谱(dHPLC )进行小麦等位基因差异表达分析＊ 韩宗福　倪中福＊＊王晓娜　逯腊虎　姚颖垠　孙其信＊＊ 中国农业大学植物遗传育种系,农业生物技术国家重点实验室,教育部杂种优势研究与利用重点实验室, 北京市作物遗传改良重点实验室,农业部作物基因组与遗传改良重点实验室,北京100193 　2008-03-19收稿,2008-04-25收修改稿 　＊国家重点基础研究发展计划(批准号:2007C B109000)和国家自然科学基金(批准号:30671297)资助项目　＊＊通信作者,E -mail :w heat3392@cau .edu .cn ;qxsun @cau .edu .cn 摘要 等位基因变异是生物体基因组中普遍存在的现象,也是物种进化和育种的重要基础.等位基因可以通过编码区的改变或者表达来影响基因的功能,因此研究等位基因的表达具有重要的 生物学意义.由于小麦基因组的复杂性,造成等位基因的鉴定比较困难,这极大地制约了小麦等位基因表达研究的开展.利用CA U36和CA U328两个ES T -SSR 标记,结合变性高效液相色谱(dHPLC )分析技术,在35个小麦基因型中分别检测到4种和3种等位变异类型,并且以抽穗期的穗下节节间为材料,对其在4×6的小麦双列杂交组合杂交F 1代中进行了表达分析.结果表明,这两个ES T -SSR 引物扩增的等位基因在多个组合中均存在显著的差异表达,且CA U36标记检测到的等位基因表达变化值与部分杂交种的株高之间存在显著的相关性. 关键词 EST -SSR 等位基因　表达变异　变性高效液相色谱　小麦 等位基因是位于一对同源染色体的相同位置上而序列有差异的基因,其变异是物种进化和育种的重要基础.在植物上,对一些重要的农艺性状基因(水稻的淀粉合成酶基因(Oriza sativa )和玉米(Zea may )的D war f8矮秆基因)的等位基因变异分析已有较多报道,并已鉴定出了多个功能优异的等位基因[1,2] .研究表明,不同等位基因之间的序列差异 主要表现为单核苷酸多态性及较短序列的插入或缺 失 [3] ,而这些变异可能会引起编码蛋白质的改变, 也可能通过影响基因的表达水平而导致基因功能发生差异[4]. 不同等位基因不仅存在序列变异,也存在表达上的变异[4].全基因组水平上的表达分析结果显示,等位基因差异表达在人类(H omo sapiens )、小鼠(Mus musculus )、果蝇(D rosophila melano -gaster )和拟南芥(Arabidopsis thaliana )中是广泛存 在的[5—9],并且可能与生物的抗病和抗逆性及杂种优势形成有关.例如,不同等位基因对于非生物逆境的响应存在明显差异,其在抗旱过程中所起的作用可能有所不同[4].又如,在授粉早期的玉米杂合子胚中来自父本的部分等位基因就已经被激活,并且在授粉后15d 的杂合子胚中,来自两个亲本的许多等位基因存在表达差异,这可能与胚的杂种优势有关[10,11]. 关于小麦的等位基因序列和表达变异研究也有报道,其中对品质相关基因,如编码麦谷蛋白、醇溶蛋白、淀粉合成酶和多酚氧化酶基因的研究最为深入,但主要集中在基因组和蛋白质水平.迄今为止,在转录水平上对小麦等位基因表达的研究相对较少,这是因为普通小麦A ,B 和D 三个不同基因组上的部分同源基因存在很高的序列相似性.例如,Shitsukava 等 [12] 对小麦MADS -BOX 基因 1256

高效液相色谱法的分类及原理

高效液相色谱法地分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液固色谱法、液液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法. .液固色谱法（液固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上地吸附作用不同来进行分配地. ①液固色谱法地作用机制 吸附剂：一些多孔地固体颗粒物质，其表面常存在分散地吸附中心点. 流动相中地溶质分子（液相）被流动相带入色谱柱后，在随载液流动地过程中，发生如下交换反应： （液相）（吸附）<>（吸附）（液相） 其作用机制是溶质分子（液相）和溶剂分子（液相）对吸附剂活性表面地竞争吸附. 吸附反应地平衡常数为： 值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附地溶质分子很少，先流出色谱柱. 值较大：表示该组分分子地吸附能力较强，后流出色谱柱. 发生在吸附剂表面上地吸附解吸平衡，就是液固色谱分离地基础.资料个人收集整理，勿做商业用途 ②液固色谱法地吸附剂和流动相 常用地液固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等. 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间地作用力很弱，分配比较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间地作用力很强，分配比大，保留时间长.资料个人收集整理，勿做商业用途 对流动相地基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样地检测 常用地流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等. ③液固色谱法地应用 常用于分离极性不同地化合物、含有不同类型或不；数量官能团地有机化合物，以及有机化合物地不同地异构体；但液固色谱法不宜用于分离同系物，因为液固色谱对不同相对分子质量地同系物选择性不高.资料个人收集整理，勿做商业用途 .液液色谱法（液液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相. ①液液色谱法地作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小地组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大地组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离地目地.资料个人收集整理，勿做商业用途 液液色谱法与液液萃取法地基本原理相同，均服从分配定律：固液 值大地组分，保留时间长，后流出色谱柱. ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相. 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相.

仪器分析考试题及答案88662

仪器分析练习题及答案 第2章气相色谱分析 一．选择题 1.在气相色谱分析中, 用于定性分析的参数是 ( ) A 保留值 B 峰面积 C 分离度 D 半峰宽 2. 在气相色谱分析中, 用于定量分析的参数是 ( ) A 保留时间 B 保留体积 C 半峰宽 D 峰面积 3. 使用热导池检测器时, 应选用下列哪种气体作载气, 其效果最好？ ( ) A H2 B He C Ar D N2 4. 热导池检测器是一种 ( ) A 浓度型检测器 B 质量型检测器 C 只对含碳、氢的有机化合物有响应的检测器 D 只对含硫、磷化合物有响应的检测器 5. 使用氢火焰离子化检测器, 选用下列哪种气体作载气最合适？ ( ) A H2 B He C Ar D N2 6、色谱法分离混合物的可能性决定于试样混合物在固定相中（）的差别。 A. 沸点差， B. 温度差， C. 吸光度， D. 分配系数。 7、选择固定液时，一般根据（）原则。 A. 沸点高低， B. 熔点高低， C. 相似相溶， D. 化学稳定性。 8、相对保留值是指某组分2与某组分1的（）。 A. 调整保留值之比， B. 死时间之比， C. 保留时间之比， D. 保留体积之比。 9、气相色谱定量分析时（）要求进样量特别准确。 A.内标法； B.外标法； C.面积归一法。 10、理论塔板数反映了（）。 A.分离度； B. 分配系数； C．保留值； D．柱的效能。 11、下列气相色谱仪的检测器中，属于质量型检测器的是（） A．热导池和氢焰离子化检测器；B．火焰光度和氢焰离子化检测器； C．热导池和电子捕获检测器； D．火焰光度和电子捕获检测器。 12、在气-液色谱中，为了改变色谱柱的选择性，主要可进行如下哪种（些）操作？（） A. 改变固定相的种类 B. 改变载气的种类和流速 C. 改变色谱柱的柱温 D. （A）、（B）和（C） 13、进行色谱分析时，进样时间过长会导致半峰宽（）。 A. 没有变化， B. 变宽， C. 变窄， D. 不成线性 14、在气液色谱中，色谱柱的使用上限温度取决于（） A.样品中沸点最高组分的沸点， B.样品中各组分沸点的平均值。 C.固定液的沸点。 D.固定液的最高使用温度 15、分配系数与下列哪些因素有关（） A.与温度有关； B.与柱压有关； C.与气液相体积有关； D.与组分、固定液的热力学性质有关。

DHPLC变性高效液相色谱原理

DHPLC变性高效液相色谱原理 DHPLC变性高效液相色谱技术是近年来发展起来的一项新的分析技术，它是分离核苷酸片段及分析检测已知未知基因突变和SNP的最佳技术平台，其核心技术采用Transgenomic公司专利技术的DNA SepCartridge分离柱。DHPLC能够分析检测已知未知突变和SNP，技术关键是依靠这样专利技术的分离系统，在专利技术的DNA SepCartridge分离柱中的基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）交联聚合物微球体，固定相为碳-18烷烃链，PS-DVB微球体与碳-18烷烃链之间形成碳碳共价键共同组成柱填料，填料是电中性、疏水性的，不易与核酸发生反应。三乙基铵醋酸盐（TEAA）是一种离子对试剂，离子对试剂既是疏水性的又带正电荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时TEAA的疏水基团又与固定相碳-18链的疏水基团发生反应。这种离子对试剂是连接核酸和柱基质之间的桥梁，因此，它作为“桥分子”使DNA片段吸附在固定相上面。通过改变流动相中乙氰及离子对试剂的浓度实现DNA片段的分离。

WAVE? DHPLC分离系统的三种操作模式： WAVE?系统是一套经济、高效及多用途的仪器。标准WAVE系统提供可选择的冷却设备、双板自动进样器、柱箱、紫外检测器和分离柱组成。这套系统可在同一分析标准下实现三种模式的运行。将标准WAVE系统加工和升级可以进一步提升系统的可用性。 执行模式温度应用分离基础 非变性 50℃测量双螺旋DNA的大小（小于2000bp）依赖大小 PCR质量检测及纯化依赖序列定量分析

部分变性 52-75℃变性检测依赖大小 （平均范围）单核酸多态性检测依赖序列完全变性 75-80℃测量双螺旋DNA大小（小于2000bp）依赖大小 （平均范围） DNA分析（DNA SepR柱）依赖序列 寡核苷酸质量（DNA SepR柱和OLIGO SepR柱）和纯度分析（片段收集器） 大量纯化需要OLIGOSepPrep TM HC柱 非变性条件：依赖分子量的分离