有关PCR习题
1．以下哪种物质在PCR反应中不需要（）
A．Taq DNA聚合酶B．dNTPs C．Mg2+ D．RNA酶E．合适pH缓冲液
2．以下哪种酶可耐高温（）
A．Taq DNA聚合酶B．Hind ⅢC．T4连接酶D．RNA酶E．Klenow片段
3．PCR反应正确过程应为（）
A．退火→变性→延伸B．变性→退火→延伸C．退火→延伸→变性D．变性→延伸→退火E．延伸→变性→退火
4．PCR技术的本质是（）
A．核酸杂交技术B．核酸重组技术C．核酸扩增技术D．核酸变性技术E．核酸连接技术5．Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为（）
A．37℃B．50℃～55℃C．70℃～75℃D．80℃～85℃E．94℃～95℃
6．能在细胞内进行PCR扩增的PCR仪为（）
A．普通PCR仪B．梯度PCR仪C．原位PCR仪D．荧光PCR仪E．实时PCR仪
7．在下列哪种PCR仪扩增样品可以了解样品中DNA原始拷贝数（）
A．普通PCR仪B．梯度PCR仪C．原位PCR仪D．荧光实时PCR仪E．定性PCR仪
8．PCR基因扩增仪最关键的部分是（）
A．温度控制系统B．荧光检测系统C．软件系统D．热盖E．样品基座
9．“位置的边缘效应”是指（）
A．温度的准确性欠佳B．温度的均一性欠佳C．边缘升降温速度快D．边缘升降温速度慢
E．梯度模式和标准模式温度不一致
10．PCR扩增仪升降温速度快有很多优点，以下哪一项应除外（）
A．缩短反应时间B．提高工作效率C．消除位置的边缘效应D．缩短非特异性反应时间E．提高反应特异性
11、PCR技术扩增DNA,需要的条件是( )
①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA ⑥核糖体A、①②
③④B、②③④⑤C、①③④⑤D、①②③⑥
12、镁离子在DNA或RNA体外扩增反应的浓度一般为（）
A、L
B、L
C、
D、L
13、多重PCR需要的引物对为（）A、一对引物B、半对引物C、两对引物D、多对引物
14、PCR是在引物、模板和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，其特异性决定因素为（）
A、模板
B、引物
C、dNTP
D、镁离子
15、在PCR反应中，下列哪项可以引起非靶序列的扩增的扩增( )
A、TaqDNA聚合酶加量过多
B、引物加量过多
C、A、B都可
D、缓冲液中镁离子含量过高
16、PCR技术是一种DNA的扩增技术。在一定条件下，加入模板DNA、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP 可以实现DNA的扩增。据此判断不合理的是
A．dATP在DNA扩增中可以提供能量，同时作DNA合成的原料
B．dTTP完全水解后产物有胸腺嘧啶、磷酸、核糖
C．DNA扩增过程未加解旋酶，可以通过先适当加温的方法破坏氢键，使模板DNA解旋
D．CTP水解脱去两个磷酸基后是组成RNA的基本单位之一
17、多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是：（）
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
18、下列有关PCR技术的叙述，不正确的是：（）A．PCR技术经过变形、复性、延伸三个阶段B．PCR 技术可用于基因诊断，判断亲缘关系等
C．PCR技术需在体内进行D．PCR技术是利用碱基互补配对的原则19、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸460个）放入PCR仪中扩增4代，那么，在PCR仪中放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数至少应是
A．640 B．8100 C．600 D．8640
20、对禽流感的确诊，先用PCR技术将标本基因大量扩增，然后利用基因探针，测知待测标本与探针核酸的碱基异同。下图P表示禽流感病毒探针基因在凝胶的电泳标记位置，M、N、Q、W是四份送检样品在测定
后的电泳标记位置，哪份标本最有可能确诊为禽流感（）
A．M B．N C．Q D．W
21、某考古学家在西伯利亚泰加林地区的冰中，发现了一种冰冻的已灭绝的巨大动物的肌肉。他想了解该巨型动物的DNA与现今印度大象的DNA的相似性，于是做了如下检测工作，其中正确的操作步骤及顺序是①降低温度，检测处理后形成的杂合DNA双链区段②通过PCR技术扩增巨型动物和大象的DNA ③把巨型动物的DNA导入大象的细胞中④在一定的温度条件下，将巨型动物和大象的DNA 水浴共热 A.②④③ B.②④③① C.③④① D.②④①
22、PCR的发明人是
A. Mullis
B. 牛顿 D. James
23、退火温度一般比引物的熔解温度（Tm）低多少合适
A. 7℃
B. 10℃
C. 5℃
D. 2℃
E. 20℃
24、引物的最佳浓度为
A. μM
B. 1-2μM
C. 5-10μM
D. 100μM
E. 200μM
25、专门用于制备单链DNA的PCR技术是
A、对称PCR
B、反向PCR
C、RT－PCR
D、不对称PCR
E、嵌套PCR
26、PCR变性温度一般为
A．96℃ B. 85℃ C. 72℃ D. 55℃ E. 100℃
27、pre-mRNA 内含子的5'-末端一般为（）A、AU B、GU C、AG D、CG E、AC
28、在大肠杆菌的DNA损伤修复时，对于填补缺口可能最重要的酶是
A、DNA聚合酶Ⅰ
B、DNA聚合酶Ⅱ
C、DNA聚合酶Ⅲ
D、RNA聚合梅
E、以上都不是
29、可用于扩增未知序列的PCR方法是（）A、对称PCR B、反向PCR C、RT-PCR D、不对称PCR E、嵌套PCR
30、在聚合酶链反应（PCR）中最常用的DNA聚合酶是A．T4 DNA连接酶B．T7 DNA聚合酶C．Taq DNA聚合酶D．E. coli DNA聚合酶I E．E. coli DNA聚合酶II
31、下列关于PCR引物设计的说法错误的是（）
A．设计引物时应考虑使3’端引物和5’端引物具有相似的Tm值
B．每条引物自身不应有稳定的发夹结构
C．上下游引物之间不宜形成稳定的二聚体结构D．引物的5’和3’端必须和模板严格配对结合E．引物与非特异扩增区的序列无同源性
32、Taq DNA聚合酶可以不依赖模板在dsDNA的3’末端加上一个碱基为（）
A. G
B. A
C. T
D. C
E. I
33．PCR反应中，所设计引物的长度一般为（）
A．5～10核苷酸 B. 15～30核苷酸 C. <50个核苷酸 D.长度任意 E. 以上答案均不对34．引物设计时G＋C含量在引物中一般占（）
A. 20～40﹪
B. 30～60﹪
C. 45～55﹪
D.越高越好
E.含量随意
35．以下说法错误的是（）
A引物中的碱基组成应该尽可能的随机分布。
B 引物自身不应该存在互补序列
C 设计引物时应考虑使3‘端引物和5‘端引物具有相似的Tm值
D 引物的5‘和3’端必须和模板严格配对结合
E 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70﹪
36．下列说法正确的是（）
C. PCR反应常用的缓冲液为10－50mmol/L的Tris-HCl（室温 PH －）
D. 10mmol/L的KCl能促进引物的退火
E. 加入的BSA有利于破坏模板的二级结构
F.二甲基亚砜有利于保护TaqDNA酶的活性。
E. Mg2+能降低Taq DNA聚合酶的活性。
37. TaqDNA聚合酶活性需要以下哪种离子（ c ）
A．K+ B. Na+ C. Mg2+ D. Ca2+ E. Cl-
38．适用于DNA序列中单个碱基突变的检测的方法是：( d )
A．筑巢PCR B. 多重PCR C. 锚定PCR D. LCR
39．以下哪种PCR技术广泛应用于组织胚胎学和肿瘤学的研究（ a ）
A．原位PCR B．差异显示PCR C．不对称PCR D．反向PCR
40.已知一段设计好的引物的序列为GTGGATCCATGGCTCCTCTGAAGATTC,其Tm值为（）
A. 78
B. 80
C. 82
D. 84
E. 无法计算
具有较强的酸性，使用时应将pH调至反应中，四种dNTP必须按比例配制，以减少反应的错配率。的浓度过高会增加碱基的错配率
的浓度低，反应速度下降，但特异性提高
42. TaqDNA聚合酶可以不要模板在ds DNA的末端加上一个( )碱基.
A. dGTP
B. dCTP
C. dATP
D. dTTP
43. 有关PCR的描述哪个不对( )
A.是一种酶促反应
B.引物决定扩增的特异性
C.扩增的对象是DNA序列
D.扩增的对象是氨基酸序列
44. 催化PCR的酶是 ( )
聚合酶
聚合酶
DNA聚合酶
D.反转录酶
45. PCR产物具有特异性是因为( )
DNA酶保证了产物的特异性
B.合适的变性,退火,延伸温度
C.选择特异性的引物
D.引物的Tm值不同.
46．LCR的说法正确的是 ( )
A.体系中采用DNA聚合酶
B.须设计一对引物
C.反应需经过变性,复性,连接
D. LCR中,酶将dNTP加到引物的3-OH端
E. LCR具有高度敏感性
二、多项选择题
A. 合适的退火温度应低于引物Tm值5℃左右。
B. 引物与模板的退火温度一般在45－55℃之间
C. 在Tm值允许的范围内，选择偏低的退火温度可以提高PCR反应的特异性。
D. 退火时间至少需要一分钟。
2．进行PCR实验时以下措施有助于防止污染和结果的假阳性（）
B.隔离不同的操作区
C.分装试剂，减少重复取样所致的污染
D.严格实验操作
E.设立实验对照
3．适用于扩增3‘或5‘端未知序列的PCR技术是（）
A．反向PCR B. 锚定PCR C. 多重PCR D.不对称PCR
4．以下关于PCR技术应用说法正确的是（）
B.筑巢PCR和共享引物PCR有利于增强PCR反应的特异性，适用于模板含量极少的样品的检测
C.不对称PCR可以大量制备单链DNA，可用于DNA的序列测定
D .彩色PCR适用于基因诊断和自动化DNA序列测定
E .定量PCR可用于基因表达和调控的研究
F.差异显示PCR可用于筛选和克隆受发育，突变等各种因素影响下差异表达的基因
5. 关于引物设计说法正确的是（）
B.为保证PCR反应的特异性，所设计的引物长度一般>30个核苷酸
C.引物设计时G＋C含量在引物中一般为45～55﹪
D.按经验，引物自身存在的连续互补序列一般不超过3个碱基
E.两个引物之间不应存在互补序列，尤其避免3‘端的互补重叠
F.引物的3‘端可以游离而不影响PCR反应的进行
6. 以下关于PCR的说法正确的是（）
的模板可以是DNA也可以是RNA
的模板必须从组织细胞中分离出来
反应的特异性取决于引物和模板DNA的结合位点。
反应初期，目的DNA片断的增加呈指数扩增。
反应一般需要含102－105拷贝的模板
7．以下关于PCR反应条件错误的是（）
缓冲液中加入二甲基亚砜有利于破坏模板的二级结构，提高反应的特异性。
浓度过高会降低TaqDNA酶的活性，Mg浓度过低又会使酶催化非特异性扩增增强。
种dNTP应以等摩尔浓度配制，以减少错配误差。
E.引物浓度一般为L
8. PCR反应时应设立哪种对照（）
A.阴性对照
B.阳性对照
C.试剂对照
D.以上答案都正确
9. 逆转录反应体系包括（）
B. RNA模板，四种dNTP
C. RNA酶抑制剂
D.合适的缓冲液体系
E.逆转录酶
F.寡聚胸腺嘧啶核苷酸引物
10. 有关PCR的模板说法正确的是 ( )
A.模板可以是DNA也可以是RNA
B.大多数PCR反应中对DNA模板纯度要求不高
C.模板用量低
D.标本处理的基本要求是除去杂质
11. 以下有关RT-PCR反应的说法你认为正确的有( )
A. 反应体系一般有20μl
B.反应体系中有缓冲液, 四种dNTP, MgCl2, DTT, 牛血清白蛋白, Oligo(dT)引物RNA模板和逆转录酶
C.逆转录于42℃进行,随后即进行PCR
D. RT-PCR的最终反应过程依然是以DNA为模板的PCR反应
12. PCR的产物累积的特征是( )
B.反应初期,目的DNA片断呈指数扩增
C. PCR进行到一定时间出现反应中的停滞效应
D.到达平台期的的PCR循环数取决于反应体系中酶的耗竭程度
E. PCR平台期的出现多数不可避免
F.到达平台期时若扩增目的DNA片断不足,可继续加入模板,酶和缓冲液进行PCR反应
13. 有关Mg2+在PCR中的作用说法不正确的是( )
A. Taq DNA 酶的活性维持需要Mg2+
B. Taq DNA酶的活性与反应体系中的Mg2+总浓度有关
C. Mg2+过低,酶催化非特异性扩增增加
D. Mg2+过高会降低酶的活性
E.总量应低于dNTP的量, 常用L
14. PCR中使用的底物dNTP应该是( )
A.使用前应将pH值调至 dNTP浓度高可以加快反应速度,但却增加了出错率
C.降低反应速度可以提高反应特异性
D. PCR中, 4种 dNTP必须按一定比例配制
E. Mg2+会与dNTP结合,应注意二者浓度之间的关系
15. Taq DNA酶的特点是( )
A. 75-80℃时具有最高的聚合酶活性
B.活性的维持需要Mg2+的参与
C. Taq DNA酶和klenow片断一样具有校正功能
D. Taq DNA酶的忠实性很高
E.具有类似末端转移酶的活性
16. 有关引物的说法正确的是( )
A.引物浓度一般为引物与模板的的比至少为108:1
C.引物浓度过高会引起错配和非特异扩增,降低扩增效率
D.引物Tm值位于55-80℃较理想
17. PCR反应温度应该是( )
A. 为使DNA变性完全,变性温度越高,时间越长越好
B.按模板DNA的复杂程度来调整变性温度和变性时间
C.于反应管中加入1-2d 石蜡油防止反应液的蒸发
D.温度越高时间越长, dNTP破坏增加,对PCR反应产生不利影响
18.有关退火温度正确的是( )
A.引物与模板退火温度一般在45-55℃
B.退火温度过低,使非特异扩增增加
C.退火温度过高, PCR扩增含量下降
D.退火时间一般为1-2分钟
E. Tm值的允许范围内,应该选择较低的退火温度
19.延伸温度应有如下特点( )
A.一般为72℃
B. PCR延伸时间越长, 产物的得率越高
C. Taq DNA酶在延伸温度时有较高的酶活性
D. PCR延伸时间根据待扩增片断的长度而定
循环次数设定时应注意( )
B.应由最初靶分子浓度而定
C. 理论上20-25个循环后, PCR产物累积达最大值
D. PCR的循环次数一般为25-30次
E.循环次数过多时会引起停滞效应
样品制备时应注意( )
B.应有专门的区域制备模板
C.提取DNA样品和RNA样品时要带手套且经常更换
D.纯化样品对污染有极大的影响
E. 普通分子克隆工具不能用做样品的处理和靶序列
F.提取核酸所用的试剂要求新鲜配制或者适当储存未经使用的试剂.
22.操作中应该注意( )
A.使用的溶液应该没有核酸,核酸酶
B.试剂水都是高质新鲜蒸馏水
C.工具(枪头,试管) 都是一次性并且高压灭菌
D.应有专门的操作区
E.试剂应该分装保存
23. PCR反应总为阴性时应该( )
A.增加Taq DNA酶的浓度
B. 增加靶DNA的量
C.增加扩增循环或者降低退火温度
D.提纯样品
E.取10μl扩增液再行PCR
24. PCR反应出现非特异产物时,应该采取的措施是( )
A.增加退火温度
B.降低Taq DNA酶浓度
C. 减少退火及延伸时间
D.减少引物浓度
E.减少扩增循环次数
可以广泛应用于( )
A.遗传性疾病的基因诊断
B. 检测癌基因
C.检测病原微生物
D. 法医鉴定
E. DNA序列测定
二：填空题
1、PCR技术的发明人是。
2、PCR产物短期存放可在保存，长期储存应置于。
3、PCR的基本反应过程包括，，。
4、PCR引物设计的目的是在和间取得平衡。
5. PCR反应体系含有，，，。
6. 引物与模板的退火温度一般为 ，延伸温度一般为 。
7. PCR 循环次数一般设定为 ，过多的循环次数会导致 的出现。
8. 引物3‘端最佳碱基选择是 和 。
9. PCR 的反应体系一般选用 。
10. PCR 反应的缓冲液提供了PCR 反应 常用的为 。
11. PCR 的反应体系中，Mg2＋的浓度一般保持在 ,常用的是 。
12. TaqDNA 聚合酶具有 ，缺乏 因此无 。
13. 在变性过程中，为防止反应液的蒸发，可在反应管中加入
14.(8分)聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大
量DNA 的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、
足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮
反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。 （1）某个DNA 样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则经过PCR 仪五
次循环后，将产生 个DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是 个。
（2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是
。
（3）请指出PCR 技术与转录过程的三个不同之处：
① 。 ② 。 ③ 。
15．（7分）资料显示，近十年来，PCR 技术（DNA 聚合酶链式反应技术）成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA 半保留复制的特性，在试管中进行DNA 的人工复制（如下图），在很短的时间内，将DNA 扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答：
（1）加热至94℃的目的是使DNA 样品的 键断裂，这一过程在生物体细胞内是通过 酶的
循环重复
作用来完成的。通过分析得出新合成的DNA分子中，A=T，C=G，这个事实说明DNA分子的合成遵循。
（2）新合成的DNA分子与模板DNA分子完全相同的原因是
和。
（3）通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用15N标记的模板DNA分子（第一代）放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15N标记的DNA分子单链数占全部DNA总单链数的比例为。
（4）PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PCR扩增血液中的（）
A．白细胞DNA B．病毒蛋白质 C．血浆抗体 D．病毒核酸
16．(8分)下面甲图中DNA决定某一多肽链中的酪氨酸和丙氨酸过程示意图，乙图示样品 DNA经PCR技术(聚合酶链式反应)扩增，可以获取大量DNA克隆分子。分析回答：
(1)甲图中含有种核苷酸；丙氨酸的遗传密码子是。该图表示了DNA中遗传信息的
过程。
(2)有一种贫血症是血红蛋白分子的一条多肽链上，一个酪氨酸被一个苯丙氨酸所替代造成的。此种贫血症的根本原因是，即发生了改变。
(3)乙图的“PCR”与人体内的DNA复制相比有何特殊之处? 。
(4)现在要通过“PCR”得到甲图中DNA片段的1024个克隆片段，则至少要向试管中加入
个腺嘌呤脱氧核苷酸。
17、（8分）PCR技术是把某一DNA片段在体外酶的作用下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异的扩增任何要求的目的或DNA分子片段；电泳技术则是在外电场作用下，利用分子携带的净电荷不同，把待测分子的混合物放在一定的介质(如琼脂糖凝胶)中进行分离和分析的实验技术，利用它可分离氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等物质和作亲子法学鉴定。下图中1~4是电泳装置及相应电泳结果。
请回答：
（1）电泳与叶绿体色素分离采用的纸层析法比较，后者使用的介质是________。电泳过程中分子的迁移速率除与本身所带净电荷的多少有关外，你认为还受什么因素影响(至少列出一种)？___________。
（2）PCR 技术能把某一DNA 片段进行扩增，是依据什么原理？________________。
（3）图3是把含有21个氨基酸的多肽进行水解，得到的氨基酸混合物进行电泳的结果，故可推知该多肽是由________种氨基酸构成的。
（4）图4通过提取某小孩和其母亲，以及待测定四位男性的DNA ，分别由酶处理后，生成含有若干DNA 片段，并已进行扩增得到的混合物，然后进行电泳所得到的一组DNA 指纹图谱，请分析：谁是该小孩真正生物学上的父亲？为什么？
18、（7分）PCR 技术是一项在短时间内可将DNA 分子迅速扩增的方法。它的基本原理与细胞内DNA 分子的复制类似。下面是PCR 的反应体系及反应条件，请据此回答：
（1）请指出DNA 分子复制所需的条件是： 、 、 和 。与细胞核中DNA 分子
复
制相比， 95℃条件下变性30s 的目的是： 。反应体系中的缓冲液相当于细胞中
的 。
（2）如果有反应体系中加入模板DNA 分子100个，则经过30个循环后，DNA 分子的数量将达到 个。
19、（7分）在2004年12月26日发生的印度洋地震海啸灾难中，死亡人数已达到15万，为了帮助辨别遇难者身份，我国政府派出了DNA 鉴定专家组到泰国为遇难遗体做法医病理检验。下列是一组法医检验DNA 时常用到的生物技术或物质：
（1）PCR 技术是把某一DNA 片段在体外酶的作用下，合成许多相同片段的一种方法，利用它能迅速而特异的扩增任何要求的目的基因或DNA 分子片段；
（2）限制性内切酶能识别特定的DNA 序列并进行剪切，不同的限制性内切酶可以对不同的核酸序列PCR 反应体系：50ul 缓冲液 5ul 脱氧核苷酸 1ul (2.5mM) 引物 A 引物 B Mg 2+ 4ul (2.0mM) 反应条件： 温度 时间 预变性 94℃ 5min 变 性 95℃ 30sec 复 性 56-60℃ 30sec 延 伸 72℃ 30sec
进行剪切以选择目的基因或DNA片段；
（3）电泳技术则是在外电场作用下，利用分子携带电荷不同，把待测分子的混合物放在一定介质（如琼脂糖凝胶）中进行分离和分析的实验技术，利用它能分离氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等物质，也可用作亲子法学鉴定。
请阅读上述内容并回答下列问题：
（1）PCR技术能把某一DNA 片段进行扩增，是依据什么原理？；利用PCR技术扩增DNA片段时用到的“体外酶”通常是指什么酶？。
（2）电泳过程中分子的迁移率除与本身所带电荷的多少有关以外，你认为还受什么因素影响？（至少列出一种）。
（3）如果将含有2条多肽链共48个氨基酸的蛋白质进行彻底的水解，然后再将得到的氨基酸混合物进行电泳，结果如下图1所示。则可推知该蛋白质由种氨基酸构成，该蛋白质水解时需要的水分子数
（M 代表母亲，C代表儿子，
F1—F4 代表待测四位男性）
图1 图2 图3
（4）由于每个人的DNA条带（经电泳后）分布图是独一无二的，因此“DNA指纹法”可帮助进行亲子鉴定或帮助司法部门进行案件侦破。如果取某小孩和其母亲、以及另外四位待测男性的DNA，经合适的酶处理以后得到若干DNA片段，再经电泳以后得到“DNA指纹图谱”如上图2所示，请分析：四位男性中谁最可能是该小孩的生物学父亲？。
（5）现以3种不同的限制性内切酶对大小的线状DNA进行剪切后，用凝胶电泳分离各DNA片段，实验结果图3所示。请问：3种不同的限制性内切酶在此DNA片段上相应切点的位置是。（请从下列各项中选择）
三、简答题
1、简述PCR反应的基本步骤。
2、简述PCR模板的种类及制备方法。
3、简述PCR产物的积累规律。
4、简述PCR的基本反应。
5、简述PCR实验应注意的事项。
6、简述连接酶链反应的基本原理。
7、简述RNA体外扩增的特点。
四、论述题
1、试述PCR的基本原理及引物设计原则。
2、试述PCR技术的特点。
3、试述PCR反应条件的优化。
4、试述PCR的主要类型及其工作原理。
关于PCR技术及其应用实例和前景
PCR技术及其应用实例和前景 检验0905郭媛媛 PCR是我们研究分子生物学的重要方法和工具，随着医学科技 的不断发展，这种技术越来越被人们看重，越来越多的应用到 我们的科技研究之中，作为医学检验工作者，这种技术也是我们必须掌握的从这篇文章中让我们了解一下它在实践之中的前景。 摘要：PCR (ploymerse chain reaction)技术[1]，即聚合酶链反应技术，又称基因体外扩增技术或和核酸体外扩增技术，利用两种与相反链杂交并利用附着于目标DNA两端的寡核苷酸引物在高温(95°C)使目标DNA片断的DNA双链变性，分解为单链，在较低温度(37-63°C)与引物退火，然后变温到72°C左右。在耐高温DNA聚合物酶的作用下引物被沿样板DNA单链延伸合成互补链，然后有变性→退火→延伸反复进行。引物大大过量，dNTP过量，酶在高温中是较稳定的，这样经过几十个循环，目标DNA片断就按2的n次方递增，用此法可以从mRNA中，cDNA库中扩出目标基因。总之，生物体内核酸的复制是半保留复制，PCR技术就是在体外对此进行复制模拟。 关键词：PCR技术；DNA；应用；工程效益扩大 1 引言 人类利用微生物的实践具有悠久的历史，公元前，人类就已经利用天然的微生物（酶）生产奶酪和酒。进入工业革命时代，人们开始对天然微生物进行筛选和诱变，生产某些简单的代谢产物，氨基酸，维生素和抗生素。 20世纪60年代至今，随着人类虽微生物认识的加深，DNA重组技术的出现，发酵技术的提高：更多的微生物可产生各种各样的抗生素，应用于医学微生物学(Medical Microbiology)中；更多微生物被发现可产生促生物质，有利于人和动植物的生长，对农业科学(Agriculture)有着极重要的支持；还有些微生物的代谢产物是重要的化工原料，加速了化工产业(Chemical Industry)的完善；再有些微生物被广泛应用于法医鉴定(Forenic)、医学(Medical Science)、环境监测(Environment Supervise)分子克隆(Member Clone)、序列分析(Alignment Analysis)、考古研究(Archaeology Search)等重要学科，具有广泛的应用前景，
PCR技术论文
合肥学院 HEFEI UNIVERSITY 题目: PCR技术论文系别: 生物与环境工程系专业:_ 12生物工程2班学号: 1202012043 姓名: 乐一鹏 指导教师: 阚劲松 时间： 2014年11月27日
PCR技术论文 摘要：PCR技术又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，是基因扩增技术的一次重大革新。PCR技术可将极微量的靶DNA 特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。 关键词：PCR原理、PCR过程及应用、关于PCR技术要点 1、PCR技术的基本原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 PCR的过程类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA经加热至93℃左右维持一定时间，使含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，按5'到 3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2、PCR技术的反应体系与反应条件 （一）标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u
PCR技术的原理和方法
PCR技术的原理和方法 1.PCR定义 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 2.PCR技术的基本原理 即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 PCR基本原理示意图 假设扩增效率为“X”，循环数为“n”，则二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为：y=(1+X)n。扩增30个循环即n=30时，若X=100%，则y=230=1073741824(>109)；而若X=80%时，则y=1.830=45517159.6(>107)。由此可见，其扩增的倍数是巨大的，将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灶照射下（254nm）一般都可见到DNA的特异扩增区带。 3.PCR反应基本步骤 3.1 变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程（94℃，30s）。 3.2 退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子（55℃，30s）。如下图所示
PCR技术的种类及应用分解
PCR技术的发展及应用 平骏 14112822276摘要：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是1985年由美国PE- Cetus 公司的科学家Kary Banks Mullis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。经历了近30年的技术发展，现如今PCR技术在生命科学研究以及相关的很多领域都得到广泛的应用。本文主要对PCR的基本原理、反应组份作简要的介绍；同时也对在PCR基础上发展起来的相关技术作简要综述。 关键词：PCR技术；PCR原理；PCR新技术 对核酸的研究己有100多年的历史，20世纪70年代初人们就致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想，该设想在1985年被Mullis等人实现，他们发明了具有划时代意义的聚合酶链反应[6]。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内从试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠，被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了深远的影响[18]。发明人Kary Banks Mulis也因此荣获了1994年的诺贝尔化学奖。 1、PCR 技术的原理[1,2] PCR技术是模拟细胞内DNA的天然复制过程，DNA 聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3，- OH 末端，并以此为起始点，沿模板5，→3，方向延伸，合成一条新的DNA互补链。简言之，其基本原理包括3个基本反应过程：变性→退火→延伸。PCR 反应的基本成分包括：模板DNA( 待扩增DNA )、引物、4种脱氧核苷酸( dNTPs)、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。每一循环中所合成的新链，又都可作为下一循环中的模板。PCR 合成的特定的DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，每完成一次循环需2-4min，2-3h就能将目的基因扩增，从而达到迅速大量扩增的目的。 2、PCR技术的反应组份 2.1 模板DNA PCR反应的模板可以是单链DNA也可以是双链DNA，可以是基因组DNA 或cDNA，
PCR技术简述
PCR技术简述 北京大学医学部基础医学院 07级临床一班陈依然 90701114 一、摘要 早在高中时期，生物课教程中就已经出现了“PCR技术”的字样。但是由于当时知识深度与教学要求、目的所限，教师并未对“PCR技术”即行明确的讲解。这个疑问一直延伸到今天。 结合查阅的资料，本文对PCR技术进行了简要而比较全面地介绍，内容主要涉及PCR技术的发展历程、原理、主要步骤、反应特点、反应的关键因素——引物与DNA聚合酶、荧光实时定量技术以及PCR在医学与法医学领域的应用，并且将该项技术与用于DNA扩增的常规基因工程技术进行了比较。 基于以上内容，本文呈现了有关PCR技术的基本知识。 二、关键词 PCR技术基本知识原理应用与常规方法的比较 三、正文 3.1 PCR技术简介 多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是近十年来发展最快、应用最广的分子生物学技术。PCR是在细胞外（体外）快速扩增特定DNA序列的技术，故又称体外基因扩增技术或无细胞分子克隆技术（Cell-free molecular cloning）。 该项技术采用定向酶促扩增法，选择性地富集某一特异性DNA序列，将被认为不可能监测到的极微量靶DNA分子扩增到足以方便地进行监测和分析的数量级。PCR不但有高的监测能力，还简化了操作程序，省去了诸多繁琐的操作，被人们称为分子克隆技术中的一次重大革命，对基础研究、实际应用，推动现代分子生物学技术的发展，具有难以估量的作用。而且由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，该项技术的发明者Mullis也于1993年获得了诺贝尔化学奖。 3.2 PCR技术发展历程 PCR技术的最初设想是由美国Cetus公司的Kary Mullis博士于1983年提出的。 自1993年至今，该项技术一共经历了手动/机械手式水浴基因扩增、自动化控制型定性基因扩增、终点定量/半定量PCR、实时定量PCR四代产品。随着产品的发展，操作大幅简化，成本迅速降低，而这些都有赖于DNA聚合酶的改良和荧光定时定量PCR等技术的发明与应用。 目前的第四代产品，对PCR可以进行精确的定时定量控制，并采用了微电脑控制全部反应过程，大大简化了操作过程，节省了实验时间，降低了成本，极大促进了PCR 技术的实际应用与发展。迄今PCR技术在生物科研和临床应用中得到广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术之一。 3.3 PCR技术原理 DNA的半保留复制是生物遗传物质向后代传递的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两个DNA分子。在实验中发现，DNA分子在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 PCR是根据以上原理，以特定顺序DNA的两条链为模板，在一对引物的介导下，在
PCR技术综述
PCR技术综述 摘要：PCR（polymerasechainreaction）即聚合酶链式反应，是一种通过体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。本文主要针对PCR的概念，原理和方法，简要介绍常用的PCR相关技术及其原理，方法及应用。 关键词：PCR；原理；应用及展望 聚合酶链式反应（polymerasechainreaction），简称PCR，又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法，由变性、退火及延伸等反应构成一个周期，可循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有高特异性、高度灵敏性、高丰产量等特点，此方法在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域都被广泛应用。 1、PCR技术发展史 上个世纪60年代末，人们开始致力于基因体外分离技术的研究，但由于核酸含量较少，大大限制了DNA的体外操作。Khorana在1971年最早提出了核酸体外扩增的设想，DNA经变性之后与合适的引物杂交，再用DNA聚合酶延伸引物，不断重复该过程就可以克隆出tRNA基因。但是，由于当时的基因序列分析方法不是很成熟，热稳定性较强的DNA聚合酶也还没有发现，相关引物的合成处在手工合成阶段，所以这种想法没有什么实际意义。 1985年，美国科学家KaryMullis在高速路的启发下，经过两年努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供了合适的条件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶和合适的缓冲体系。自此，PCR技术得到了生命科学界的一致认可，KaryMullis也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。然而，最开始的PCR技术还很不成熟，在那个时候是一种操作复杂、成本高昂的实验室技术。直到Saiki等人从一种嗜热杆菌提取到一种耐热DNA聚合酶，才使得PCR的扩增效率得以提高，PCR技术也开始得到广泛应用，成为遗传与分子生物学分析的根本基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：从定性发展到定量；从原先只能扩增几个kb到目前已能扩增几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多。 2、PCR技术原理 基本PCR条件：1、DNA模板(Template)，2、引物(Primers)，3、DNA聚合酶(Polymearse)，4、合成的原料及水。 PCR的反应包括三个主要步骤，分别是：Denaturation、Annealing，andExtension。Denaturing即将DNA加热变性转为单链DNA作为复制的模板；而Annealing则是令引物于一定的温度下附着于模板DNA两端，最后在DNA聚合酶的作用下进行引物的延长(Extensionofprimers)及另一条链的合成。
PCR技术(包含引物设计)
聚合酶链式反应（PCR） 原理： DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的?半保留复制链?，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术分类（常用） （1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，
PCR技术概论
PCR技术概论 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR 几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR技术简史 PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA 聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。
PCR技术总结
PCR技术 一、故事：关于PCR技术的那些事 PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K. Mullis），他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。穆里斯的出身是生物化学家，1972在加州大学伯克利分校取得博士学位，专长有机合成。一早他就表现出桀骜不驯的性格，在那嬉皮的年代，吸食自制的迷幻药不算太稀奇，穆里斯也乐于此道。更让人难以想象的是，他在经历迷幻药之旅的过程中，居然想出了某个解释大爆炸宇宙学的理论，写了出来投稿到《自然》周刊，居然登了出来。 PCR点子的诞生，根据穆里斯自己的说法，那是在1983年春天的一个周五晚上，他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法，应该有人提出过，但搜索文献后却发现没有[1]。这次“顿悟”后来也成就了穆里斯本人也成就了分子生物学。 穆里斯的文章两度遭退稿后，有人建议投给《酶学方法》（Methods of Enzymology），主要是因为有人与该刊主编吴瑞相熟，较好沟通，同时PCR的性质也适合该强调方法学的刊物。于是，穆里斯的文章终于得到发表，只不过整整晚了一年，到1987年初才问世。这篇文章只有穆里斯及另一位技术员两人挂名。 二、解释：PCR技术名词 “聚合酶链反应”（polymerase chain reaction，PCR），是在
体外将微量目的DNA片段大量扩增的技术。 三、PCR技术原理[2][3]： 以待扩增的DNA分子为模板，反应体系中加入分别与待扩增序列两端互补的一对特异寡核苷酸片段作为引物，在耐热DNA聚合酶的作用下以dNTP为底物，按照半保留机制延伸合成与模板链互补的DNA。多次重复该过程，即可实现目的DNA片段的扩增。 四、PCR反应体系的基本成分： ●模板DNA ●特异引物 ●耐热性DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶） ●d NTP ●含有Mg2+的缓冲液 五、PCR反应步骤： （1）变性加热至94℃，模板DNA完全解开成为单链，引物内部和引物间的双链也被解开 （2）退火温度下降至适宜温度（通常较T m低5℃）使引物与模板DNA 结合 （3）延伸使温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA合成 以上3个步骤称为1个循环，新合成的DNA分子作为新一轮合成的模板，经多次反应循环（25-30次）后即可实现目的DNA片段的扩增。
pcr技术的基本原理
在科学研究中，每一项新技术的创立都会带来一系列新的研究成果问世，从而推动着各学科的发展。纵观形态研究领域，50年代电子显微镜引入形态学观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究；60-70年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将观察的水平由亚细胞结构推向了蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的定位，对医学生物学的发展无疑产生了深刻的影响。70年代，分子生物学技术在形态学中的广泛应用，随着原位杂交技术的出现，使组织细胞内特定的DNA或RNA 序列能够被定位，将蛋白质水平又提高到基因水平即核酸分子的观察和定位，从而使人类对许多生命现象在基因水平上的认识得以深化；80年代，分子生物学领域中一项具有强大生命力的技术PCR——多聚酶链反应技术问世了，很快地就被引入形态学观察的领域，使细胞内低拷贝或单拷贝的特定DNA或RNA得以进行定位及观察。这一技术的问世，必将带来更多的研究成果，使形态学的研究又向前迈出一大步。 基本原理 原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。 PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，经过模板的变性、退火和引物延伸三种循环，将引物引导下的特异性靶序列迅速地进行扩增，经过扩增的靶序列（一般能扩增106倍），很容易在凝胶电泳或Southern印记杂交中显示出来，因此，PCR技术具有灵敏度高，特异性强的优势，随着热循环自动化的提高与稳定也使得PCR技术的操作简便易行。但是，PCR技术是在液相中进行的，在扩增前，需将细胞破坏，从中提取核酸作为模板，因此很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系起来，同时，也很难判断含特异性靶序列的细胞类型。 原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结合起来，保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。 基本类型 根据在扩增反应中所用的三磷酸核苷原料或引物是否标记，原位PCR技术可分为直接法和间接法两大类，此外，还有反转录原位PCR技术等。 直接法原位PCR技术 直接法原位PCR技术是将扩增的产物直接携带标记分子，即使用标记的三磷酸腺苷或引物片断。当标本进行PCR扩增时，标记的分子就掺入到扩增的产物中，显示标记物，就能将特定的DNA或RNA在标本（原位）中显现出来。 常用的标记物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自显影的方法或用亲和组织化学及免疫组织化学的方法去显示标记物所在位置。 直接法原位PCR技术的优点是操作简便，流程短，省时。缺点是特异性较差，易出现假阳性，扩增效率也较低，特别是在石蜡切片上，上述缺点更为突出。因为在制片过程中，无论是固定，脱水还是包埋，都会导致DNA的损害，而受损的DNA可利用反应体系中的标记三磷酸核苷进行修复，这样标记物就会掺入到DNA的非靶序列中，造成假阳性。若用标记引物的方法进行直接法原位PCR，其扩增的效率比不标记更低。 间接法原位PCR技术 间接法原位PCR技术师现在细胞内进行特定DNA或RNA扩增，再用标记的探针进行原位杂交，明显提高了特异性，是目前应用最为广泛的原位PCR技术。 间接法原位PCR与直接法不同的是，反应体系与常规PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不带任何标记物。即实现先扩增的目的，然后用原位杂交技术去检测细胞内已扩增的特定的DNA产物，因此，实际上是将PCR技术和原位杂交技术结合起来的一种新技术，故又称之为PCR原位杂交(PCR in situ hybridization , PISH)。 间接法PCR技术的优点是特异性较高，扩增效率也较高。缺点是操作步骤较直接法繁琐。 原位反转录PCR技术。
PCR技术基本原理及相关知识
PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR反应体系的基本成分：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP、Mg2+的缓冲液。 PCR反应体系与反应条件 -------------------------------------------------------------------------------- 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
几种PCR技术的介绍
热启动PCR 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。 热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。 Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。此酶在常温下活性被封闭，要在94℃－95℃下加热数分钟才能够恢复酶活性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的Taq DNA聚合酶活性。 Touch-down PCR Touch-down PCR又称降落PCR.即选定一个温度范围，如50—35 ℃，每降1-2 ℃进行1-2个循环，然后在50度下进行15个循环。 Touch-down的原理 随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。 选择初始复性温度的原则 起始复性温度应该比引物的Tm值高出5-10度，然后每个循环递减1-2度 Touch-down PCR的应用范围 low copy of targeted DNA; high degree degeneracy (or less specific) of the first set of primers; RT-PCR using oligo-dT.