耐酒精酵母的筛选
摘要：从野外葡萄园土壤中采集土壤样品，在实验室中通过微生物培养，微生物的富集，菌种的分离、纯化，筛选出纯的酵母菌。将筛选出的纯的酵母菌分组分别进行培养，进行耐酒精能力的比较。培养到最佳时期的时候，分别测定各组酵母菌株培养基中酒精含量，筛选出耐酒精性能最好的菌株。该超强耐酒精能力的优良菌株的成功筛选为酵母菌能高效利用发酵培养液提供了菌种来源，同时也为发酵后的酒精分离降低了难度和成本。
关键词：微生物；耐酒精；酵母；筛选；性能测定
前言：随着化石能源的日趋匮乏及环境污染的加剧，开发一种绿色能源势在必行。乙醇作为一种生产工艺成熟、生产原料来源广的替代能源日益受到人们关注。尤其是燃料酒精作为清洁能源，原料资源可以再生，大大的刺激了酒精行业的发展。用微生物法生产酒精的历史由来已久，并且生产工艺早已成熟。目前乙醇的生产原料为玉米、小麦等粮食产品为主。尽管用粮食生产酒精成本昂贵，但由于用纤维素作原料生产酒精的方法还不成熟，工艺过程很不完善，所以怎样提高粮食生产酒精过程中原料的利用率，是目前酒精发酵过程研究的一个重要方向，也是降低发酵生产酒精的重要措施。因为酒精是酵母菌糖代谢产物，对酵母菌的发酵有一定抑制作用，当酒精成分达到10%左右时，酵母菌就停止繁殖，发酵过程也随之放慢。在酒精发酵过程中，由于一般酒精酵母的耐酒精能力不强（耐酒精度一般为10%），导致酵母菌不能充分利用发酵原料，造成了原料的浪费，同时由于发酵液中酒精含量低，使得酒精后期的分离纯化过程复杂，从而大大增加了
生产成本。因此，耐高酒精度的酒精酵母的筛选具有非常重要的意义。耐高酒精度的酒精酵母能够减缓产物的抑制作用，提升酒精酵母产酒精的潜力【1】。耐酒精酵母可以在发酵液中较高浓度的酒精中不会死亡，并且仍然具有利用培养液发酵酒精的能力，从而提高酒精原料的利用率。同时和一般酵母发酵相比，发酵产物中酒精的含量能达到18%左右，产物中原料和杂质的含量下降，产物中酒精的纯度增加，也使得酒精的分离提纯更加容易进行，从而使粮食生产酒精成本降低。因此高耐性酒精酵母这一领域的研究工作一直在深入的进行，并且有了可喜的成果【2】。耐酒精酵母的应用，使相同原料的酒精产量大大提高，从而使我国的酒精生产总量增加，改善我国酒精产品供应不足的状况，更好的为我国的国民经济服务。酒精成本的降低，使得酒精能源能够得以广泛使用，缓解能源的危机，降低化石燃料的使用，减少日益严重的环境污染，改善我国恶劣的环境状况。对我国经济的可持续发展有着深远的影响。在查阅了大量文献资料的前提下，本文拟从自然界分离筛选一株耐酒精产酒精能力强的酵母菌株，使其应用于工业酒精发酵，提高酒精发酵的产率和质量，降低酒精生产的成本。实验部分：
1材料与试验方法：
1.1材料：
1.1.1样品来源：野外葡萄园中的土壤样品。
1.1.2菌株来源：从葡萄园中土壤样品中分离酵母菌株。
1.1.3培养基：
1.1.3.1富集培养基：葡萄糖50 g,KH2PO4
2.5 g,Na2HPO4 0.5 g,(NH4)2SO4 1 g，尿素1 g,MgSO·47H2O 0.5 g，酵母膏0.5 g,FeSO4 0.1 g，孟加拉红（1%水溶液）
3.3 mL，水定容至1000 mL。若配制液体培养基，将其pH调至
4.5；若配制固体培养基，则加琼脂15 g，然后调pH至
5.5～6。在112℃下灭菌30 min【3】。
1.1.3.2分离培养基：YPD(葡萄糖30g、蛋白胨15g、酵母膏15g)培
养基【4】。
1.1.3.3初筛培养基：即TI'C显色培养基。上层培养基为TTC 0.5 g，葡萄糖5 g，琼脂15 g，水1000 mL，自然pH[7]；下层培养基为葡萄糖10 g，蛋白胨2 g，酵母膏1.5 g，KH2PO4 1 g,MgSO4·7H2O0.4 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH值5.5～5.7【4】。
复筛培养基：葡萄糖30％，酵母膏0．5％，蛋白胨0．5％，氯化铵0．15％，磷酸氢二钾0．15％，硫酸镁0．1％，氯化钙0．28％，0．06MPa灭菌15min【4】。
发酵培养基：玉米淀粉适度糖化后添加部分营养元素。
1.1.4实验仪器：高压灭菌锅；恒温培养箱；摇床；超净工作台；干热灭菌箱；全套接种工具；培养所用的玻璃器具。
1.1.5酶制剂：淀粉酶；糖化酶。
1.2试验方法：
1.2.1菌种的富集培养：
富集培养法可以创造一些条件只让所需微生物生长，在这些条件下，
所需的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远
超过其他微生物。所创造的最适条件包括选择最适的碳源、能源、温度、pH等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在培养基上长出单菌落【5】。
将配制好的富集培养基装入用干热灭菌箱灭菌后的三角瓶中，用高压灭菌锅进行彻底灭菌后冷却。将采集到的样品加入到富集培养基中，于最是的温度条件下，放在摇床上（将培养基放在摇床上培养的目的是为了是菌体与培养基充分接触，使培养的菌种充分利用培养基的成分，同时使培养基中的菌种分布均匀。）进行富集培养48小时，观察有无酵母菌细胞的存在，并且使培养基中酵母细胞增殖。同时移种重复富集培养多次，使所需分离的酵母菌在固体培养基中长出单菌落。
1.2.2菌种的分离和纯化：
1.2.2.1菌种得分离：
从富集培养基上挑取酵母单菌落，在超净工作台的无菌环境中，在分离培养基上划线，将菌种接种到分离培养基上。将分离培养基中添加适量的青霉素抑制细菌的生长，32℃培养48小时。所得的酵母菌纯度已经很高。然后进行酵母的纯化试验，得到纯种的酵母菌株。
1.2.2.2菌种得纯化：
在超净工作台上，从分离培养基上挑取单菌落，接种到初筛培养基，通过染色，镜鉴获得纯种（不含任何杂菌）酵母菌株。具体方法如下：个体形态观察：用美蓝染色法取对数生长期的菌体制片,在放大400倍及1000倍的显微镜下观察酵母形态,用测微尺测量酵母细胞的大小,并进行死活鉴别。液体培养特征观察：用三角瓶装PD液300 mL，
灭菌后，接种分离的酵母菌，于28℃培养并观察其特征。
菌落特征观察：将分离的酵母菌接种在PDA平板上，28℃保温培养48 h后观察菌落特征【5】。（酵母菌的菌落形态特征细胞个体大，湿润，表面光滑，多数不透明，黏稠，菌落颜色单调，多数呈乳白色，少数红色，个别黑色。酵母菌生长在固体培养基表面，容易用针挑起，菌落质地均匀，正、反面及中央与边缘的颜色一致。不产生假菌丝的酵母菌菌落更隆起，边缘十分圆整；形成大量假菌丝的酵母，菌落较平坦，表面和边缘粗糙。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1~5微米′5~20微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。酵母菌的细胞形态酵母菌的细胞形态酵母菌细胞结构的显微照片酵母菌的菌落。大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。酵母菌菌落特征是分类鉴定的重要依据。）
通过细胞形态观察，挑去初筛培养基中具有典型酵母形态的细胞，在无菌条件下，划线接种到复筛培养基中，经过24小时的培养增殖，从而得到纯种的酵母菌菌落。从而获得纯种的不含杂菌的酵母菌株，以便为后期筛选耐酒精酵母提供需要。
1.2.2耐酒精酵母的筛选
1.2.2.1耐酒精能力的试验
从复筛培养基中得到的分离纯化后的纯种酵母菌，在酵母菌株挑取对数期（对数期的菌种细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，细胞各成分平衡生长，生长速率恒定且最高，是发酵工业中用做种子的最佳材料。）时的单菌落，在无菌条件下，接种到灭菌后的发酵培养基上，分别接种十二组酵母菌中进行耐酒精能力实验。酵母菌中在发酵培养基上，吸收培养基的营养成分，首先进行菌种得繁殖。等到菌种繁殖到足够数量的时候开始利用发酵培养基中原料进行发酵产
生酒精。等到大部分菌种到稳定期（有害代谢产物积累，新增细胞数目与死亡细胞数目达到动态平衡，次级代谢产物大量积累，形成芽孢。此时期酵母细胞的发酵已基本停止，产生的酒精量达到最大值）的时候发酵停止，然后进行各个发酵培养基中酒精含量和酵母菌的存活率的测定。
1.2.2.2耐酒精能力的测定
1.2.2.2.1酒精度的测定
在各个培养基中各取100mL成熟发酵醪,加入100mL蒸馏水,置1000W 电炉上蒸馏出100mL液体,摇匀后用酒精计测定其酒度,然后查表校正为20℃酒精浓度【6】。然后比较不同组分培养液中酒精的含量。
耐酒精能力的比较
比较十二组试验中各组分中，培养基中酒精的含量，挑选出酒精含量最高的那组。酒精含量高的培养基，可以说明该酵母的产酒精能力比一般的酒精酵母高。
1.2.2.2.2酵母存活率的测定：
酵母细胞鉴定程序【7】。（[7]欧阳谅．微生物学实验法[M]．南昌：江西人民出版社，1980．）酵母菌细胞数与死亡率的测定【8】：采用Neubauer血球计数板法计数。[8]程丽娟.微生物学实验技术[M].天则出版社,1993
选择出酵母存活率最高的那组菌株。酵母存活率高，证明该酵母菌的耐酒精能力比一般酵母强。
1.2.2.3测定结果：
通过各个发酵培养基中酒精含量和酵母菌的存活率的测定。测定结果表明酒精含量最高的培养液和酵母成活率最高的培养液是同一培养液。
2结果与分析：
2.1实验结果：
2.1.1酵母菌中的分离纯化结果：
实验结果表明，通过酵母菌的富集培养，分离培养，初筛培养和复筛培养，可以将野生酵母菌经过菌种的分离纯化得到纯种的用于耐酒精实验所需的酵母菌株。
2.1.2耐酒精酵母菌筛选结果：
通过十二组发酵培养基中酵母菌的发酵实验，各个发酵培养基中酒精含量和酵母菌的存活率的测定，得到耐酒精能力远远高于一般酒精酵母的耐酒精酵母，筛选得到的这株耐酒精酵母的耐酒精含量可以达到18%。
根据上文的实验结果，表明酒精含量最高的培养液和酵母成活率最高的培养液是同一培养液。由于耐酒精能力强的和产酒精量高的菌株是同一菌株，证明本实验的方法是正确的，获得了理想的酵母菌株。
2. 2实验分析：
2.2.1正确实验思路和合理的实验步骤是整个实验过程的关键。整个实验过程最重要操作是无菌操作，避免杂菌的污染是实验成功的关键。无菌操作包括培养基的灭菌，实验器具的灭菌，菌种接种培养过程的无菌操作。同时培养基的选择也很重要，菌种得分离，纯化，耐高温筛选都需要各自不同的培养基，进行各自的操作。
2.2.2同时酵母菌的生长时期的选择和控制也是非常重要的【8】。迟缓期
酵母菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少。迟缓期长短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1～4小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。
对数期又称指数期(exponential phage)。此期生长曲线上活菌数直线上升。酵母菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期酵母菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感。是发酵工业中用做种子的最佳材料。
稳定期
该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、H2O2等）积累ph下降等不利因素的影响，酵母菌繁殖速度渐趋下降，相对酵母菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。
衰亡期
随着稳定期发展，酵母菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形。生理代谢活动趋于停滞。
2.2.3整个实验过程试验方法的选择也是至关重要的，参考大量有价
值的文献选择合理的试验方法是成功的关键。同时，酒精含量的检测，酵母存活率的检测方法选择要得当。
2.2.4本实验的独特之处是在筛选耐酒精酵母的方法上，不但检测了
酒精酵母的耐酒精能力，还检测了酵母的产酒精能力，得到及高产酒精又耐高浓度酒精的酵母菌株，从而证明了高产酒精和耐高浓度酒精的酵母是同一株。酵母菌有耐高浓度酒精能力的同时也具有高产酒精的能力。而其他的很多实验只是做了其中一方面的工作。
3.结论和讨论：
3.1结论：
综上所述：在自然界通过菌种分离纯化和耐酒精能力的的筛选可以得到纯种的耐酒精酵母。
3.2讨论：
3·1高浓度酒精发酵是人们近年来普遍关注的一个研究课题。这一
研究的技术关键在于获得高渗透压且酒精发酵速率快、对自身产生乙醇的耐受力强的酵母菌种,提高酵母菌的乙醇耐受力、解除高浓度乙醇的抑制作用也是人们的研究热点。研究结果表明:酵母菌对乙醇的耐受能力不仅仅是由于酵母细胞自身对不同水平的乙醇耐受的内在能力,而且与酵母原生质膜的脂类组成及功能、发酵营养状况、环境参数、碳水化合物基质补充方式等因素有密切关系。乙醇毒性的简要机制是:临界乙醇浓度导致质膜磷脂裂解,如果菌株质膜本身或发酵时具备相当营养及环境条件适宜等,酵母就对乙醇毒性有所适应和抵抗,特别是温度尤为明显。随着温度的提高,酵母质膜的磷脂量很快降低,以维持质膜的流动性和保护胞间活性。从本研究结果看,该菌株的最适发酵温度在32℃左右,试想如果通过高温驯化或进一步将该菌株与耐高温菌株进行原生质体融合,使之既耐高温、高产酒精又具有良好的絮凝特性,那么这样的菌株将会有更高的应用价值【9】。
3·2近年来,酒精高强度连续发酵技术研究也取得了许多中试结果,如细胞循环发酵、悬浮床或固定化细胞发酵与分离同步的发酵技术等,但这些成果未能在淀粉质原料生产酒精中广泛应用,除技术本身原因外,主要与我国特有的薯干原料酒精占主导有关。近年来,广西、沈阳先后研究开发了固定化酵母细胞酒精生产技术,并在部分厂家推广应用,但由于人们的认识问题等原因,因而推广面不大。以玉米为原料采用精料发酵,设备堵塞情况可大大减少,可实现高浓度发酵。由于在前期将玉米副产物进行了彻底分离,大大提高了玉米原料利用价值,同时克服了酒精液固液分离的难题,大大减少了污染物的排放,减轻了治污
工作量,提高了设备利用率和工人劳动生产率,节水、节电,同时有助于许多新技术的实施【9】。
3.3耐高温酵母筛选的意义
3.3.1本实验只进行了耐酒精酵母的筛选，在酒精工业生产重，耐高温酒精酵母的筛选也同样具有中的意义。超高温耐高酒精度乙醇酵母的选育，对燃料乙醇或酒精工业具有较大的实用价值。目前国内研究得较多的主要有沈睿的YH4耐高温酵母【l0】。国外的研究主要集中在东南亚、日本和巴西D~司。所筛选的这些酵母一般在38～4O℃还具有较高的酒精产率。筛选超高温耐高疆精度乙醇酵母菌株其意义主要体现在：①能够解决糖袍温度和发酵温度不协调的矛盾，实现真正意义上酶边l糖化边发酵，使糖化和发酵在同一设备中进行从而减少葡萄糖对纤维素酶的抑制作用，提壹绿维素酶的擅率，进而提高纤维素发酵生产燃料乙醇的得率；②高温发酵还能够提高发酵效率，降低发酵时的冷却成本；⑨高温发酵能够减少杂菌污染的机会；④耐高酒精度的乙醇酵母能够减缓产物的抑制作用，提升乙醇酵母产乙醇的潜力【ll】。
3.3.2酒精浓醪发酵有利于降低生产过程中的水耗和能耗，对于提高酒精生产效率，降低生产成本具有重要作用。但酒精浓醪发酵会引起发酵温度和酒精度升高，导致酵母菌的生长受到抑制和酒精发酵不彻底的现象。因此，耐高温高产酒精酵母菌株的选育和发酵工艺的改进是实现酒精浓醪发酵工业的关键。耐高温酒精酵母菌的育种方法主要有自然分离、高温驯化、诱变和原生质体融合4种。宜昌酵母基地从
收集到的耐高温酵母菌中筛选出耐高温、发酵性能良好的菌株，并将其制成活性干酵母，在生产上获得了较成功的应用，但在高温发酵时产酒精能力仍受到影响。在研究中发现耐温性好的酵母菌往往并非产酒精能力较强的酿酒酵母菌(Saccharomycescerev~iace)。因此，筛选耐高温且产酒精能力强的酵母菌株成为当前国内外酒精行业研究的热点。
3.4利用固态发酵工艺(SSF)生产酒精技术在国内外已受到广泛的重视。固态发酵生产酒精工艺具有投资少,酒糟处理能耗低,用水量少,可实现酒精清洁生产,同时在利用固态纤维素废物生产酒精方面有巨大的潜力【12】。目前固态发酵生产酒精工艺还有许多问题需要解决,其中淀粉利用率较低(约为80 %)是一个十分关键的问题。影响淀粉利用的因素很多,淀粉的糖化、淀粉的浓度、固态基质的传质传热等,而在发酵过程中,尤其在发酵后期酒醅的酸度较高,且含有一定数量的低分子脂肪酸对酵母的发酵形成一定的抑制作用,使酒精的产率降低,是造成淀粉利用率低的重要因素【13~14】。
酵母菌酒精发酵实验报告
实验方案 酵母菌酒精发酵的条件研究 学院（部）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生姓名：鑫 学号：11018150 班级：生物工程二班 指导教师：肖
一、实验目的 1、学会实验的设计和操作过程 2、找到酵母菌发酵时的最优条件 二、培养基和实验方法及材料的确定 1、玉米粉的糖化方法 玉米粉的糖化采用双酶法，其工艺流程如下 玉米粉→加水→液化→糖化→发酵→蒸馏→成品酒精 试验中，发酵培养按照三角瓶100ml培养。本次工做20组是要，共需发酵液20*100=2000ml。培养液按照100g玉米粉、300ml水。所以共需玉米粉700g。 液化：取１００ｇ玉米粉，加入３００ｍＬ的水，液化温度为９０℃，ｐＨ值为５．５，液化时间为３．５ｈ，液化酶的添加量为０．０３５ｇ／１００ ｇ玉米粉 糖化：糖化时的工艺条件为：糖化温度为５８℃，ｐＨ值为４．５，糖化时间为３．５ｈ，糖化酶的添加量为０．３ｇ／１００ｇ玉米粉。 2、活化培养基 本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基的配制，配方如下表一： 表一 3、扩大培养基 扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体的，所 以将其中的琼脂配料去掉。 4、发酵培养基
糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料（硫酸铵0.4%），pH5.5 灭菌 三、培养基的制备及酵母的活化 1、准备酵母母菌一支常温下存放一天，增加菌种的活力。在母菌存放期间制作各时期培养基 2、准备固体培养基（察氏培养基）50ml，做成8支试管斜面，扩大培养基800ml（做扩大培养时使用）。做成8个三角瓶，每瓶200ml。120℃灭菌30min。 3、发酵液的制备 （1）玉米粉的筛选 实验前准备粉碎后的玉米粉700g。 （2）玉米粉的液化 按照100g玉米粉、300ml水的配比对玉米粉进行液化，液化方案上文已经交代。在1000ml烧杯里，或者500ml烧杯分两次，水浴液化。 器材：烧杯500ml两个，玻璃棒一个，水浴锅一个，糖化酶0.225g 步骤：1、将糖化酶，玉米粉，水按照比例配置好在烧杯里。2、将配好的玉米液放于水浴锅中90℃液化3.5h。边液化边搅拌。 （3）玉米粉的糖化 将液化后的玉米液中按照0.3g/100ml加入液化液中。再在水浴锅中，58℃糖化3.5h。 （4）过滤 糖化后的糖化液有可能有没有彻底液化的玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过滤操作。 操作步骤： 最后与以上培养基一起进行灭菌处理。灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌。 （5）活化步骤 器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精。 步骤：1、将器材放于实验台上。对双手合桌面进行灭菌。对接种针进行灼烧灭菌。2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取
耐酒精酵母的筛选
摘要：从野外葡萄园土壤中采集土壤样品，在实验室中通过微生物培养，微生物的富集，菌种的分离、纯化，筛选出纯的酵母菌。将筛选出的纯的酵母菌分组分别进行培养，进行耐酒精能力的比较。培养到最佳时期的时候，分别测定各组酵母菌株培养基中酒精含量，筛选出耐酒精性能最好的菌株。该超强耐酒精能力的优良菌株的成功筛选为酵母菌能高效利用发酵培养液提供了菌种来源，同时也为发酵后的酒精分离降低了难度和成本。 关键词：微生物；耐酒精；酵母；筛选；性能测定 前言：随着化石能源的日趋匮乏及环境污染的加剧，开发一种绿色能源势在必行。乙醇作为一种生产工艺成熟、生产原料来源广的替代能源日益受到人们关注。尤其是燃料酒精作为清洁能源，原料资源可以再生，大大的刺激了酒精行业的发展。用微生物法生产酒精的历史由来已久，并且生产工艺早已成熟。目前乙醇的生产原料为玉米、小麦等粮食产品为主。尽管用粮食生产酒精成本昂贵，但由于用纤维素作原料生产酒精的方法还不成熟，工艺过程很不完善，所以怎样提高粮食生产酒精过程中原料的利用率，是目前酒精发酵过程研究的一个重要方向，也是降低发酵生产酒精的重要措施。因为酒精是酵母菌糖代谢产物，对酵母菌的发酵有一定抑制作用，当酒精成分达到10%左右时，酵母菌就停止繁殖，发酵过程也随之放慢。在酒精发酵过程中，由于一般酒精酵母的耐酒精能力不强（耐酒精度一般为10%），导致酵母菌不能充分利用发酵原料，造成了原料的浪费，同时由于发酵液中酒精含量低，使得酒精后期的分离纯化过程复杂，从而大大增加了
生产成本。因此，耐高酒精度的酒精酵母的筛选具有非常重要的意义。耐高酒精度的酒精酵母能够减缓产物的抑制作用，提升酒精酵母产酒精的潜力【1】。耐酒精酵母可以在发酵液中较高浓度的酒精中不会死亡，并且仍然具有利用培养液发酵酒精的能力，从而提高酒精原料的利用率。同时和一般酵母发酵相比，发酵产物中酒精的含量能达到18%左右，产物中原料和杂质的含量下降，产物中酒精的纯度增加，也使得酒精的分离提纯更加容易进行，从而使粮食生产酒精成本降低。因此高耐性酒精酵母这一领域的研究工作一直在深入的进行，并且有了可喜的成果【2】。耐酒精酵母的应用，使相同原料的酒精产量大大提高，从而使我国的酒精生产总量增加，改善我国酒精产品供应不足的状况，更好的为我国的国民经济服务。酒精成本的降低，使得酒精能源能够得以广泛使用，缓解能源的危机，降低化石燃料的使用，减少日益严重的环境污染，改善我国恶劣的环境状况。对我国经济的可持续发展有着深远的影响。在查阅了大量文献资料的前提下，本文拟从自然界分离筛选一株耐酒精产酒精能力强的酵母菌株，使其应用于工业酒精发酵，提高酒精发酵的产率和质量，降低酒精生产的成本。实验部分： 1材料与试验方法： 1.1材料： 1.1.1样品来源：野外葡萄园中的土壤样品。 1.1.2菌株来源：从葡萄园中土壤样品中分离酵母菌株。 1.1.3培养基：
耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究[开题报告]
毕业论文开题报告 生物工程 耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究 1 选题的背景和意义 石油作为国民经济发展的战略物资在经过人类近二百年的开采后，面临全球桔竭的局面。特别是近年来，随着经济的持续增长和石油需求迅速膨胀，我国已成为继美国之后的第二大能源消费国。针对我国人多地少、粮食紧缺和石油短缺的国情，依据不与人争粮、不与粮争地，能源原料多元化，实现持续发展的原则，开发非粮燃料乙醇生物能源，降低生产成本，提高转化效率，确保现代社会发展的需求，已成为国家新能源战略发展最紧迫的任务。传统酿酒酵母的酒精发酵最适温度不高，一般为25℃一30℃；耐酒性较差，耐酒精浓度在10％左右。一方面，在杂菌污染严重的情况下，生产上不仅要求无菌条件严格，操作难度较大，而且为了控制因发酵热所引起的温度上升，需要加入大量冷却水(甚至在部分气温较高地区，因发酵过程中过热，根本无法进行正常生产)，导致乙醇生产成本增加[1-2]；另一方面，酵母的耐酒精度较低，产物的抑制作用降低乙醇酵母的产乙醇潜力。因此，耐受性酒精高温酵母的选育研究已成为国内外酒精行业的研究热点[3-4]。 乙醇酵母对生活条件的变化有迅速的适应能力，并且随着外界环境的变化，其群体能迅速产生变种，这为耐酒精酵母的筛选提供了可能[1]。耐高温酵母不是微生物分类学上的名词，而是从生态方面表达此类酵母对温度的忍耐性与普通酵母的差异。筛选耐高温的乙醇酵母菌株，其生产上的优势主要体现在：①具有较高的发酵能力，即能快速并完全将糖分转化成乙醇，能够解决糖化温度和发酵温度不协调的矛盾，实现真正意义上的边糖化边发酵，从而减少葡萄糖对纤维素酶的抑制作用，提高纤维素酶的糖化率，进而提高纤维素发酵生产燃料乙醇的得率[2-3]；②繁殖速度快，即具有高的比生长速度，高温发酵还能够提高发酵效率，降低发酵时的冷却成本[4]；③具有高的耐酒精能力，即对本身代谢产物的稳定性高．因而可以进行浓醪发酵；④抗杂菌能力强，即对杂菌代谢产物的稳定性高．耐有机酸能力强；⑤对培养基的适应性强。耐温、耐盐和耐干物质浓度的性能强。 2 相关研究的最新成果及动态
酵母菌的培养与分离
微生物学大实验 实验指导 编者： 生物技术教研室 2007.3
目录 实验一酵母菌的培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2 实验二酵母菌的鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7 实验三酵母菌耐受能力的测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19 实验四酵母菌发酵工艺条件的优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22 实验五耐高温酵母菌株的诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24 实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27
耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究 实验一酵母菌的培养与分离 一、实验目的 学习培养和分离酵母菌的技术和方法 二、基本原理 大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5－6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。 利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。 三、实验主要内容和要求 （一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括： 1．马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。 2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。 3.酵母菌的分离,要求接种一次, 28-30℃，培养24小时，转接一次，28-30℃，培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。 4.用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。 四、实验的准备 1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基： 原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。 配制方法： （1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。 （2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分种。 （3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
耐高温酒精酵母的筛选
文章编号 1004 6410(2009)03 0026 04 耐高温酒精酵母的筛选 易 弋1a ,黎 娅1b ,容元平1a ,李 凯2 (1.广西工学院a.生物与化学工程系b.科技处,广西柳州 545006; 2.四川省中医药高等专科学校,四川绵阳 621000) 摘 要:从酒精厂废液、糖厂废糖蜜、土壤及淤泥等七种不同样品中,经富集、分离、纯化,筛选得到3株耐高温酵母菌T M 6、T M 10和T M 20.实验结果表明,3株菌都能在50 的高温下生长,但高温会明显影响酵母菌的发酵能力.30 下,T M 10的发酵酒精终浓度最高,达到了7.82%(v/v).而在40 下T M 20的发酵能力要高于T M 6和T M 10,且发酵酒精终浓度仅比30 时降低了约6%.关 键 词:耐高温;酒精发酵;酵母;筛选中图分类号:T S262.2 文献标识码:A 收稿日期:2009-06-05 基金项目:广西工学院博士基金项目(0818001),广西工学院科学基金项目(0840202)资助.作者简介:易弋(1979-),男,四川都江堰人,广西工学院生物与化学工程系副教授,博士. 0 引言 自20世纪70年代发生石油危机以来,能源短缺已成为我国乃至世界各国经济发展的主要障碍.发展可 再生资源以解决我国经济持续发展中的能源问题,已成为全社会的共识.燃料乙醇由于其可再生性,被认为是最有可能代替石油的液体燃料,市场潜力十分巨大. 目前工业化生产酒精的发酵温度一般在30~33 左右,在这种温度下发酵需要大量的冷却水.若能使发酵在高温下进行,不但可以减少冷却水的用量,节约生产成本,而且可以从根本上解决糖化与发酵不同步的问题,缩短发酵周期,提高发酵效率[1] .同时高温发酵能有效的抑制杂菌生长,减少醪液受污染的机会.但过高的温度会引起酵母细胞内脂肪酸、磷脂等成分的变化,甚至会导致蛋白质变性,这样一来就会影响细胞正常的生理活动,表现出高温对酵母细胞的毒性[2].因此,对于耐高温酒精酵母菌的选育问题一直是酒精酵母研究者的重要研究方向之一. 针对这一问题,本文拟从自然界中分离出有较强温度耐受性的酵母菌,并初步研究其发酵及相关性能,为下一步的选育工作打下基础. 1 材料与方法 1.1 培养基 酵母培养基:葡萄糖50g,酵母膏8.5g,NH 4Cl 1.0g,MgSO 4 7H 2O 0.6g ,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调pH =4.5,115 灭菌20m in.固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂. 发酵培养基:葡萄糖150g ,酵母膏5g,蛋白胨5g,NH 4Cl 1.0g,M gSO 4 7H 2O 0.6g,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调节pH= 4.5,115 灭菌20min. T TC 上层培养基[3] :葡萄糖0.5g,琼脂1.5g,加水至100mL,115 灭菌20min,待冷却至55 左右时,加入TTC(2,3,5!氯化三苯基四氮唑)0.05g. 第20卷 第3期 广西工学院学报 Vol 20 No 3 2009年9月 JO U RNAL OF G UA NG XI U N IV ERSIT Y OF T ECHN OL OGY Sep 2009
酒精生产常用的酵母菌实验指导
黑龙江生物科技职业学院实验报告 姓名：专业班级：学号：时间： 酒精生产常用的酵母菌 一、实验目的 1．学习酒精生产常用的酵母菌都有哪些，并了解其生长特性。 2．了解不同量酒精生产原料酵母菌的不同。 3．通过对菌株的观测了解，回答酒精生产用酵母菌的要求。 4．通过实验能掌握鉴定酵母菌细胞死活的方法。 5．会计算酵母细胞的增长速度及传代次数。 二、实验原理 我国淀粉质原料生产酒精中，所采用的酵母菌种有拉斯12号、拉斯2号、南阳1308、南阳1300、K字酵母等；用于生产糖蜜原料的酵母菌有中国科学院2610、川345、川102等，它们适宜于较高温度下的糖蜜发酵，具有繁殖快，发酵时间短等特性。通过对这些菌株的培养与显微镜观测，测定其死活，细胞增长速度及传代时间，绘制糖度、温度与酵母增长速度的关系图。 三、实验器材 1．材料：拉斯2号、南阳1308菌株，AADY酒精活性干酵母，糖化酶，曲霉菌，淀粉酶，美蓝试剂。2．仪器设备：温度计，灭菌锅，一次性手套，托盘，糖度计，恒温培养箱，显微镜，血球计数板，。 四、实验步骤 1、将拉斯2号、南阳1308菌株，AADY酒精活性干酵母活化，培养基先行配制及灭菌。用米曲汁培养基（米酒发酵剩余的大米糯米），AADY的复水活化采用清水，糖水和米曲汁醪液三种方法分别分组活化。 2、显微镜下观察各类菌株，并用美蓝液鉴定细胞死活。 采用0.1％的吕氏美兰液染色法。活的酵母细胞由于不停地进行着新陈代谢，细胞内氧化还原值颇小，还原力较强，当无毒的美兰染液进入细胞后，能立即还原脱色，不能被美兰液染上颜色；而死后或接近死亡的酵母细胞，不具有此还原能力，当加入美兰液后，就被美兰液染成兰色。进而达到鉴别的目的。操作方法是将被检查的酵母细胞溶液，用清洁、干燥的吸管吸取1—2ml，置于清洁、灭菌后的试管中，加入无菌水5—10倍稀释，再吸取0.1％吕氏美兰液1—2滴，加入试管中，然后充分混合均匀。用无菌吸管吸取1滴于消毒、清洁的载玻片上，盖上载玻片，静置20—30秒钟，再放在显微镜下观察，凡是被染成兰色的酵母细胞则是死亡或接近死亡的细胞，呈无色的就是活的酵母细胞。 3、不同浓度，不同温度培养不同菌株，一定时间后测定其细胞数，并计算其传代数。 五、实验结果 1
酵母发酵酒精的研究进展
酵母发酵酒精的研究进展 （生命科学与技术学院微生物专业） 前言 人类利用酵母菌的历史已有几千年了。值得提出来的是，早在我国宋代的酿酒著作中，中国人已经明确记载了从发酵旺盛的酿酒缸内液体表面撇取酵母菌（当然不是纯粹的酵母菌）的方法，并把它们称为“酵”，风干以后制成的“干酵”可以长期保存。这种制造干酵母的原始方法说明，早在800年前，中国人已经意识到酒精发酵是由“酵”，即某种能生长的物质引起的。这种推断直到19世纪巴斯德才证明是酵母菌。明代末年出版的词书中记载有“以酒母起面曰发酵”，“发酵，浮起者是也”等解释。这说明至少在那时，一引起细心观察自然现象和注意比较的学者，已经认识到发面和酿酒有某种相同的因素在起作用。当时在欧洲虽然已经发现了酵母菌，但在200年后才知道酵母菌的作用。今天我们把这类微生物称酵母菌，正是以此为根据的。 酵母菌能够把糖变成酒精，是因为它的细胞里有催化剂，这些存在于生物细胞的催化剂在科学上叫做酶。虽然现在知道所有的生物都是靠酶催化的化学反应来生活的，但最早发现的酶，就是酵母菌的酶。酵母菌中最早发现的酶，是把糖变成酒精的一群酶，当时自然数酒化酶。由于这种酶的作用，使糖分解成酒精和二氧化碳，这就是利用酵母菌酿酒和发面包的原理。使面团产生许多空隙的就是二氧化碳。酵母细胞大小为2.5-10μm×4.5-21μm, 在加盖的玉米琼脂上不产生假菌丝或有不典型的假菌丝, 营养细胞可直接变为子囊, 每囊有1-4个圆形光面的子囊孢子, 在麦芽汁25℃培养3d, 细胞为圆形、卵形、椭圆形和香肠形。其菌落在麦芽汁琼脂上为乳白色, 有光泽, 平坦, 边缘整齐。菌体维生素、蛋白质含量高, 既可食用又可提取细胞色素C、核酸、麦角固醇、谷胱甘肽、凝血质、辅酶A、三磷酸腺苷等。该菌种能发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖及蔗糖, 但不能发酵乳糖和蜜二糖, 不同化硝酸盐。 酵母菌的繁殖方式既可进行无性繁殖，如芽殖，又可进行有性生殖；酵母菌既可进行有氧呼吸，又可进行无氧呼吸，是一种兼性厌氧呼吸的真核微生物。单细胞真核生物酿酒酵母基因组为12,068kb，比单细胞的原核生物和古细菌大一个数量级。酿酒酵母基因组共有5887个ORF，这比原核生物和古细菌要多很多。酿酒酵母的基因密度为1个基因/2kb，密度小于原核生物流感嗜血杆菌和尿殖道支原体等。酿酒酵母是最小的真核基因组，裂殖酵母其次，其密度是1/2.3kb，简单多细胞生物线虫的基因密度为1/30kb。第二、酿酒酵母只有4%的编码基因有内含子，而裂殖酵母则有40%编码基因有内含子。 1、酵母的生长条件 1.1 无机盐
酒精酵母
一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种 四川理工学院 设计（论文）题目：一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种 1．毕业设计（论文）的主要内容及基本要求 [1]大曲中分离及纯化酵母菌。 [2]紫外线诱变，氯化锂诱变和紫外线与氯化锂复合诱变。 [3]分别对诱变菌的发酵性能和产气情况的测定。 2．指定查阅的主要参考文献及说明 [1]《酿造酒工艺学》（第二版）中国轻工业出版社顾国贤主编 [2]《微生物学》（第二版）高等教育出版社周德庆主编 [3]《微生物学实验指导》高等教育出版社黄秀梨主编 [4]《现代微生物遗传学》化学工业出版社陈三凤刘德虎编著 3．进度安排 设计（论文）各阶段名称起止日期 1 文献检索：收集资料、撰写开题报告2009.03.23--2009.03.29 2 文献、资料查阅整理，撰写文献综述2009.03.30--2009.04.05 3 拟订实验方案，提出实验条件及需求2009.04.06--2009.04.11 4 实验仪器及药品的准备2009.04.11--2009.05.12 5 实验实施，现象观察并做好数据记录2009.04.13--2009.05.20 6 分析实验结果，整理数据2009.05.21--2009.05.28 7 撰写论文、修改论文2009.05.29--2009.06.10 8 论文定稿、打印、准备及答辩2009.06.10--2009.06.17 注：本表在学生接受任务时下达 一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种
本文主要介绍了耐酒精酵母的诱变育种，通过诱变得到高发酵力和高耐酒精性能的酵母菌。本实验拟从大曲中分离及纯化得到具有发酵产酒精能力的酵母菌种,并以该菌作为出发菌株,首先分别通过紫外光诱变，氯化锂诱变和紫外光与氯化锂复合诱变，然后分别测试诱变后的酵母菌株的酒精发酵及耐酒精性能，从而筛选得到高发酵能力及高耐酒精度的酵母菌株。 关键词：酵母菌；耐酒精；紫外线；氯化锂；复合诱变 目录 摘要 .................................................... ..错误!未定义书签。ABSTRCT............. .........................................错误!未定义书签。目录 (Ⅲ) 前言 ...................................................... 错误!未定义书签。第一章实验仪器与材料........................................ 错误!未定义书签。 1.1 仪器与设备............................................. 错误!未定义书签。 1.2 材料与试剂............................................. 错误!未定义书签。 1.3 实验试剂的配制 (4) 1.4 培养基的配制 (5) 第二章实验内容与方案 (6) 2.1 大曲中酿酒酵母的分离 (6) 2.2 出发菌株的能力测定 (7) 2.3 紫外线诱变酵母菌 (8) 2.4 氯化锂诱变酵母菌 (10) 2.5 紫外线-氯化锂复合诱变酵母菌 (13) 第三章实验结果与讨论........................................ 错误!未定义书签。 3.1实验结果............................................... 错误!未定义书签。 3.2 实验讨论 (35) 第四章结论 (39) 第五章综述 (41) 参考文献 (44) 致谢 (46) 附录 (47)
小议高产酒精酵母菌的紫外线诱变选育
聂世现，王钰，黄文静，季必霞 0 引言 石油是世界经济与发展的基本能源之一，其储备有限。20世纪70年代世界范围发生石油危机，使利用可再生的资源（如高淀粉作物）发酵生产酒精作为生物能源的研究成为人们关注的焦点。生物能源与石油相比具有可再生、污染小、减少温室效应等优点，能部分或全部代替汽油。目前，燃料酒精的生产占世界酒精总产量的66%，并且还有进一步增加的趋势。发酵法是酒精生产的重要方法，发酵法生产酒精的关键是酵母菌株，酒精酵母的优劣不仅直接影响发酵率的高低，而且会影响酒精的产量和质量。我国酒精生产行业中普遍存在亟待解决的问题是发酵强度低,生产成本高,能耗大。因此，高产酒精酵母的选育是提高酒精产率，节约生产能源的关键。 为了开展非粮作物甘薯等转化酒精的研究，本论文探讨了酵母菌A4原生质体制备和再生的适宜条件，并用紫外线作诱变剂，对酵母菌原生质体进行诱变处理，旨在筛选出发酵力强、酒精产量高的优良酵母菌株，为下一步以高产淀粉品种甘薯为原材料生产酒精的研究工作奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 酵母菌（A4）为本实验室保藏菌种。 1.1.2 培养基 麦芽汁液体培养基：将麦芽汁（购于合肥市华润雪花啤酒厂）糖度调至12°Brix，过滤后121℃灭菌20min。 YPD培养基(g/L)： 液体培养基：酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20。 固体培养基：在YPD液体培养基中加入琼脂20，NaOH0.1。 原生质体再生培养基：在YPD固体培养基中分别添加KCl至0.7mol/L，山梨醇至0.8mol/L，甘露醇至0.8mol/L，17%的蔗糖。 以上培养基于115℃灭菌20min。 TTC上层培养基(g/L)：TTC（三苯基四氮唑盐酸盐）0.5，葡萄糖5，琼脂15。 TTC下层培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨2，酵母膏1.5，K2HPO41，MgSO4·7H2O4，琼脂20，pH5.5。 1.1.3 试剂 缓冲液：pH6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液。 预处理剂：0.1%β-巯基乙醇，其中含0.1mol/L的EDTA-Na2。 稳渗剂：KC1高渗缓冲液：缓冲液中添加KC1至0.7mol/L；山梨醇高渗缓冲液：缓冲液中添加山梨醇至0.8mol/L；甘露醇高渗缓冲液：缓冲液中添加甘露醇至0.8mol/L；蔗糖高渗缓冲液：缓冲液中加入17%的蔗糖。 酶液：分别将1%，1.5%，2%，2.5%的蜗牛酶和0.4%蜗牛酶+0.4%纤维素酶溶于高渗缓冲液中，微孔滤膜过滤除菌，制备成不同浓度的酶液。酶购于上海生工。 1.2 方法 1.2.1 出发菌株的原生质体制备与再生 1.2.1.1 出发菌株生长曲线的测定 挑取斜面菌株1～2环接种于50mLYPD液体培养基中，28℃，200r/min摇床培养24h后分别以1:100的量接种于装有10mLYPD液体培养基的大试管中，28℃，200r/min摇床培养，每隔2h取出一支试管，测定其OD600值，绘制其生长曲线。 1.2.1.2 出发菌株原生质体制备与再生 将活化好的菌种接种于盛有50mLYPD液体培养基的锥形瓶中，28℃，200r/min摇床培养，当其进入对数生长期时，取5mL菌液3500r/min离心5min，用磷酸-柠檬酸缓冲液洗2次，无菌加入0.1%β-巯基乙醇，28℃
酵母菌的分离筛选方法
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 1.1葡萄糖50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L KH2PO4 2.5g/L Na2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加 拉红 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用） ★1.2乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用 蔗糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱 布过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培 养用）（富集用） ★1.3麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素0.1g/L PH6.0-6.4 121℃ 20min （分离保存用）灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★1.4虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5.0g/L 葡萄糖10g/L KH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉红0.033g/L 氯霉素0.1g/L 琼 脂15g/L PH自然
（分离纯化用） ★1.5 豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g 黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 1.6察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾0.5g/L 硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁0.01g/L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。
高耐性酿酒酵母的杂交育种
２０ 酿酒科技２００６年第１０期（总第１４８期）?ｍＱｕＯＲ—Ｍ甜烈Ｇｓｃ皿ＮｃＥ＆．Ｉ．Ｅｃ础ｏＬｏＧＹ２００６Ｎｏ．１０ｃ］ｒ０１．１４８） 高耐性酿酒酵母的杂交育种 吴帅，陈叶福，沈楠，肖冬光 （天津科技大学生物工程学院，天津３００２２２） 摘要：利用不同特性的酿酒酵母ＡＹ一１５，Ｍ１进行生孢培养和孢子分离试验，得到１８５株产 酒、１５３株耐渗单倍体。其接合型，ａ型约占１／４，仅型占约１／２，其余为不确定株。经筛选试马骺得到 １３株产酒性能良好的单倍体和１９株耐渗性能良好的单倍体。利用酒精发酵试验进行复筛，得到 两株性能最优良的单倍体，作为杂交试验的亲本。杂交试验后，经耐渗、耐酒精杜氏管试验和发酵 性能测定，得到一株能够在高渗环境中仍然保持较高产酒精能力的酿酒酵母，在含盐５％的培养 基中发酵产酒精能力分别比ＡＹ一１５，Ｍ１提高１９．６％和１５．４％。 关键词：微生物；酿酒酵母；杂交；高耐性；酒精产率 中图分类号：ＴＳ２６１．１；ＴＳ２６２．２文献标识码：Ａ文章编号：１００１—９２８６（２００６）１０—００２０一０３ ＣｏｎｓｔｒＩｌｃｔｉｏｎｏｆ＆ｃｅ，Ｐｌ，豇ｌａＰ、）ｌ，ｉｔｈＧｏｏｄｏｓｍｏ—ｔｏｌｅｒａｎｃｅ 舳ｄＩＩｉｇｈＥｔｈ觚ｏｌ—ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎＣｈａｍｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ＷＵＳｈｕａｉ，Ｃ腿ＮＹｅ一如，Ｓ髓ＮＮ蛐趾ｄⅫ～０Ｄｏｎ争ｇＩｌ龃ｇ （ｃｏｕｅｇｃｏｆＢｉ咖ｇｉｍｅ血吕Ｔｉ砌ｉｎｕｎｉｖｅｒｓｉ哆ｏｆｓｃｉｅｎｃｅ衄ｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉ删ｉｎ３００２２２，ｃｈｉｌｌａ） Ａｂｓｔｍｃｔ：１８５ｌｌｉｇｈｅ也孤ｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｈ印ｌｏｉｄｓａｎｄ１５３ｇｏｏｄｏｓｍｏ—ｔｏｌｅｒａｎｔｈ印ｌｏｉｄｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｌｌｅｄｔｈｒｏｕ曲ｓｐｏｒｅｓｅｐａｒａ－ｔｉｏｎｔｅｓｔａｎｄｓｐｏｒｅｃｕｌｔⅢｅｏｆ＆ｃｅｒｅ移蠡ｉａｅＡＹ一１５飙ｄＭ１ｏｆ（１ｉｆｒｅｒｅｎｔｐｒｏｐｅｎｉｅｓ．ＡｍｏｎｇａＵｔｈｅｍａｔ血ｇ勺伊ｅｓ，ａ帅ｅａｃ—ｃｏｌＩｎｔｅｄｆｏｒａｂｏｕｔ１／４，仅ｔｙｐｅａｃｃｏｕｎｔｅｄｆｏｒａｂｏｕｔ１／２，ａｎｄｏ也ｅｒｓｗｅｒｅｕｎｃｅｎａｉｌｌｓ自隐ｉｎｓ．Ｂｙｍｅ嬲ｕｒｉＩｌｇ也ｅ ｅｎｄｕ舢ｃｅｏｆｙｅａＳｔｈａｐｌｏｉｄｓ，１３ｈｉｇｈｅｔｈ趾ｏｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｈ印ｌｏｉｄｓａｎｄ１９ｇｏｏｄｏｓｍｏ—ｔｏｌｅｒ４ｎｔｈ印ｌｏｉｄｓｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ａｆｔｅｒ血ｅ侥ｍｅｎｔａ—ｔｉｏｎ，觚ｏｈａｐｌｏｉｄｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ器ｍｅｐａｒｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．２３６ｄｉｐｌｏｉｄｓｔｒａｉ璐、Ⅳｅｒｅｃｏｎｓ仃ｕｃｔｅｄｂｙｃｒｏｓｓｉｎｇ也ｅ ｐａｒｅｎｔｓ．ＡｔｌａＳｔ，ｏⅡｅｓ缸ａｉｌｌｗ弱ｏｂｔａｉｎｅｄ也ｒｏｕｇｈｔｈｅｍｅａＳｕｒｅｍｅｎｔｏｆｍｅｉｒｏｓｍｏ—ｔ０１ｅ砌ｃｅｃａｐａｃｉｔ），ａｎｄｆｅｒｍｅｎｔｉｌｌｇ ｐｏｗｅｒ 锄ｄａｌｃｏｈｏｌ?ｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｅｓｔ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｍａｉｎｔａｉｎｈｉ曲ｅｔｌｌ蛆ｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃａｐａｃ蚵ｕｎｄｅｒｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃｅ妇ｎｍｅｎｔｓ．Ｉｔｓｅｔｌｌａｎｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔ）ｒｉｎｃｌｌ】ｔＩｌｒｅｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１５％ｓａｈｉｎｃｒｅ弱ｅｄｂｙ１９．６％ｔ１１ａｎＡＹ一１５ａｎｄｂｙ１５．４％也ａｎＭｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． ＫｅｙｗｏｒｄＳ：ｍｉｃｒｏｂｅ；ＳⅡｃｃ，Ⅻ．ｏ，ｎ弘ｅｓｃｅｒｅ秽括云∞；ｈｙｂｒｉｍｚｅ；ｏｓｍｏｔｏｌｅｍｃｅ；ｅｔｌｌ锄ｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 随着酒精发酵工业的发展，浓醪发酵技术获得普遍的成功和不断得到认可。浓醪发酵可使企业获得最大产率，提高企业生产能力，同时还可以相应地降低生产成本。目前，浓醪发酵的研究主要集中在高产菌株的选育和发酵工艺两个方面。前者的目的主要是提高菌株的耐性，包括耐渗性和耐酒精性能等。对于淀粉质原料。通常采用边糖化边发酵工艺，如废液不回用则不存在高渗问题。但为了节约生产用水和减少酒精废液的处理量，大多数工厂都采用部分废液回用工艺。而酒精废糟中含有大量对酵母菌的生长和发酵有抑制作用的物质．如无机盐等，随着回用次数的增加，发酵液的渗透压会因为这些物质的多次积累有所增高【”，也会影响酵母的生长和繁殖，这就需要菌株具有较好的耐渗性。另一方面，由于酒精浓醪发酵得到的酒精浓度较高，酵母菌的发酵会受到影响，以往的研究显示，乙醇浓度达８％时对酵母细胞有害，乙醇浓度达１１％左右时，酵母发酵完全受到抑制圆。为了使酵母能够在浓醪发酵中更好地利用可发酵性糖．有必要同时增强其耐渗性和耐酒精性能。 本试验采用杂交育种手段对酵母菌进行改造。１９５０年酵母菌接合系统的遗传控制原理已经得到详细阐述。到目前为止，杂交试验已经取得了不少成果，例如，日本的小田等人用酒精酵母和卡尔斯伯杂交获得的杂交株， 基金项目：天津市重点科技攻关资助项目（０６ＹＦＧｚＳＨ００５００）。 收稿日期：２００６—０７—１８ 作者简介：吴帅（１９７９一），女，山东人，博士研究生，研究方向：现代酿造技术。通讯作者：肖冬光，天津科技大学教授，博导。ｘｄｇ＠ｔｕ８ｔ．ｅｄｕ．ｃｎ．。 万方数据 万方数据
酵母菌酒精发酵实验报告
酵母菌酒精发酵实验报告 实验方案 酵母菌酒精发酵地条件研究 学院（部）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生姓名：鑫 学 班 指导 1 2 ｇ玉米粉 糖化：糖化时地工艺条件为：糖化温度为５８℃，ｐＨ值为４．５，糖化时间为３．５ｈ，糖化酶地添加量为０．３ｇ／１００ｇ玉米粉. 活化培养基 本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基地配制，配方如下表一：
表一 扩大培养基 扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体地，所以将其中地琼脂配料去掉. 1 2 3 （1 （2 按照 中90℃液化3.5h.边液化边搅拌. （3）玉米粉地糖化 将液化后地玉米液中按照0.3g/100ml加入液化液中.再在水浴锅中，58℃糖化3.5h. （4）过滤 糖化后地糖化液有可能有没有彻底液化地玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过 滤操作.
操作步骤： 最后与以上培养基一起进行灭菌处理.灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌. （5）活化步骤 器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精. 步骤：1、将器材放于实验台上.对双手合桌面进行灭菌.对接种针进行灼烧灭菌.2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取下试管棉塞.3、将灼烧后地接种针伸入母菌试管取粘 培养. ， 不同菌量下地发酵 器材：扩大菌种，移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球. 步骤：1、将实验器材放于实验台上.2、用移液管移取8%地扩大菌种到发酵液中.3、塞好棉塞，将发酵液存放于30℃条件下发酵2d.4、按照以上步骤，分别移取10%、12%、14%地扩大菌种到发酵液中，30℃培养2d，之后进行酒精检测. 不同醪液浓度下地发酵
酵母菌酒精发酵实验方案
酵母菌酒精发酵实验方案 实验方案 酵母菌酒精发酵地条件研究 学院（部）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生姓名： 学 班 指导 1 2 ｇ玉米粉 糖化：糖化时地工艺条件为：糖化温度为５８℃，ｐＨ值为４．５，糖化时间为３．５ｈ，糖化酶地添加量为０．３ｇ／１００ｇ玉米粉. 活化培养基 本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基地配制，配方如下表一：
表一 扩大培养基 扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体地，所以将其中地琼脂配料去掉. 1 2 3 （1 （2 按照 中90℃液化3.5h.边液化边搅拌. （3）玉米粉地糖化 将液化后地玉米液中按照0.3g/100ml加入液化液中.再在水浴锅中，58℃糖化3.5h. （4）过滤 糖化后地糖化液有可能有没有彻底液化地玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过 滤操作.
操作步骤： 最后与以上培养基一起进行灭菌处理.灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌. （5）活化步骤 器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精. 步骤：1、将器材放于实验台上.对双手合桌面进行灭菌.对接种针进行灼烧灭菌.2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取下试管棉塞.3、将灼烧后地接种针伸入母菌试管取粘 培养. ， 不同菌量下地发酵 器材：扩大菌种，移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球. 步骤：1、将实验器材放于实验台上.2、用移液管移取8%地扩大菌种到发酵液中.3、塞好棉塞，将发酵液存放于30℃条件下发酵2d.4、按照以上步骤，分别移取10%、12%、14%地扩大菌种到发酵液中，30℃培养2d，之后进行酒精检测. 不同醪液浓度下地发酵
影响酵母及酒精发酵的因素电子教材.
电子教材 4. 影响酵母及酒精发酵的因素 4.1温度温度是影响发酵的最重要因素之一。液态酵母活动的最适温度为20～30℃，20℃以上，繁殖速度随温度升高而加快，至30℃达最大值，34～35℃时，繁殖速度迅速下降，至40℃停止活动。一般情况下，发酵危险温度区为32～35℃，这一温度称发酵临界温度。 根据发酵温度的不同，可以将发酵分为高温发酵和低温发酵。30℃以上为高温发酵，其发酵时间短，但口味粗糙，杂醇、醋酸等含量高。20℃以下为低温发酵，其发酵时间长，但有利于酯类物质生成保留，果酒风味好。一般认为：红葡萄酒发酵最佳温度为26～30℃；白葡萄酒发酵最佳温度为18～20℃。 4.2酸度（pH）酵母菌在pH2～7范围内均可生长，pH4～6生长最好，发酵力最强。但一些细菌也生长良好，因此，生产中，一般控制在pH3.3～3.5之间，此时，细菌受到抑制，酵母活动良好。pH<3.0发酵受到抑制。 4.3氧气酵母是兼性厌氧微生物，在氧气充足时，主要繁殖酵母细胞，只产少量乙醇；在缺氧时，繁殖缓慢，产生大量酒精。因此，在果酒发酵初期，应适当供给氧气，以达到酵母繁殖所需，之后，应密闭发酵。对发酵停滞的葡萄酒经过通氧可恢复其发酵力；生产起泡葡萄酒时，二次发酵前轻微通氧，有利于发酵的进行。 4.4糖分糖浓度影响酵母的生长和发酵。糖度为1%～2%时，生长发酵速度最快，高于25%，出现发酵延滞。60%以上，发酵几乎停止。因此，生产中，生产高酒度果酒时，要采用分次加糖的方法，以保证发酵的顺利进行。 4.5乙醇乙醇是酵母的代谢产物,不同酵母对乙醇的耐力有很大的差异。多数酵母在乙醇浓度达到2%，就开始抑制发酵，尖端酵母在乙醇浓度达到5%就不能生长，葡萄酒酵母可忍受13%～15%的酒精，甚至16%～17%。所以，自然酿制生产的果酒不可能生产过高酒度的果酒，必须通过蒸馏或添加纯酒精生产高度果酒。 4.6 SO 2酒发酵中，添加SO 2 主要是为了抑制有害菌的生长，因为酵母对其 不敏感，是理想的抑菌剂。葡萄酒酵母可耐1g/L的SO 2。果汁含10mg/LSO 2 ，对 酵母无明显作用，但其他杂菌则被抑制。SO 2 含量达到50mg/L发酵仅延迟18～20h，但其他微生物则完全被杀死。