耐高温酒精酵母的筛选

文章编号 1004 6410(2009)03 0026 04

耐高温酒精酵母的筛选

易 弋1a ,黎 娅1b ,容元平1a ,李 凯2

(1.广西工学院a.生物与化学工程系b.科技处,广西柳州 545006;

2.四川省中医药高等专科学校,四川绵阳 621000)

摘 要:从酒精厂废液、糖厂废糖蜜、土壤及淤泥等七种不同样品中,经富集、分离、纯化,筛选得到3株耐高温酵母菌T M 6、T M 10和T M 20.实验结果表明,3株菌都能在50 的高温下生长,但高温会明显影响酵母菌的发酵能力.30 下,T M 10的发酵酒精终浓度最高,达到了7.82%(v/v).而在40 下T M 20的发酵能力要高于T M 6和T M 10,且发酵酒精终浓度仅比30 时降低了约6%.关 键 词:耐高温;酒精发酵;酵母;筛选中图分类号:T S262.2 文献标识码:A

收稿日期:2009-06-05

基金项目:广西工学院博士基金项目(0818001),广西工学院科学基金项目(0840202)资助.作者简介:易弋(1979-),男,四川都江堰人,广西工学院生物与化学工程系副教授,博士.

0 引言

自20世纪70年代发生石油危机以来,能源短缺已成为我国乃至世界各国经济发展的主要障碍.发展可

再生资源以解决我国经济持续发展中的能源问题,已成为全社会的共识.燃料乙醇由于其可再生性,被认为是最有可能代替石油的液体燃料,市场潜力十分巨大.

目前工业化生产酒精的发酵温度一般在30~33 左右,在这种温度下发酵需要大量的冷却水.若能使发酵在高温下进行,不但可以减少冷却水的用量,节约生产成本,而且可以从根本上解决糖化与发酵不同步的问题,缩短发酵周期,提高发酵效率[1]

.同时高温发酵能有效的抑制杂菌生长,减少醪液受污染的机会.但过高的温度会引起酵母细胞内脂肪酸、磷脂等成分的变化,甚至会导致蛋白质变性,这样一来就会影响细胞正常的生理活动,表现出高温对酵母细胞的毒性[2].因此,对于耐高温酒精酵母菌的选育问题一直是酒精酵母研究者的重要研究方向之一.

针对这一问题,本文拟从自然界中分离出有较强温度耐受性的酵母菌,并初步研究其发酵及相关性能,为下一步的选育工作打下基础.

1 材料与方法

1.1 培养基

酵母培养基:葡萄糖50g,酵母膏8.5g,NH 4Cl 1.0g,MgSO 4 7H 2O 0.6g ,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调pH =4.5,115 灭菌20m in.固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂.

发酵培养基:葡萄糖150g ,酵母膏5g,蛋白胨5g,NH 4Cl 1.0g,M gSO 4 7H 2O 0.6g,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调节pH= 4.5,115 灭菌20min.

T TC 上层培养基[3]

:葡萄糖0.5g,琼脂1.5g,加水至100mL,115 灭菌20min,待冷却至55 左右时,加入TTC(2,3,5!氯化三苯基四氮唑)0.05g.

第20卷 第3期 广西工学院学报 Vol 20 No 3

2009年9月 JO U RNAL OF G UA NG XI U N IV ERSIT Y OF T ECHN OL OGY Sep 2009

1.2 酵母菌分离和纯化

在以前的研究中,从柳州市7个不同地点(酒精厂废液,糖厂废糖蜜,果园土壤,农田土壤,湖水淤泥,2个白酒厂的发酵醪液)采集样品,经分离纯化得到了23株具有典型酵母菌特征的菌株,编号为TM1~23[4].

1.3 耐高温酒精酵母菌的筛选

将分离得到的23株酵母菌涂布于固体培养基上,于42 下培养.待长出菌落后,倒入一层TTC上层培养基,继续培养2~3h.结束后挑选7株长势好、红色较深的菌落备用.TTC可以和细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应,生成红色的甲月赞,由此可判断酵母细胞中呼吸酶活力的大小,即酵母产酒精能力的高低[5]. 将挑选出的酵母菌接种至液体培养基,分别于42 、44 、46 、48 、50 、52 下培养,根据其生长情况选出3株耐高温特性较强的菌株进行下一步实验.

1.4 部分发酵特性的测定

初始糖浓度对各菌株的影响:制备葡萄糖含量分别为20%、30%、40%、50%、55%、60%的液体培养基,接入筛选的酵母菌,28 摇床培养,通过测定OD560比较其生长情况,从而判断菌株对渗透压的耐受性.

pH值对各菌株的影响:制备pH2 0,pH2 5,pH3 0,pH3 5,pH4 0和pH4 5的液体培养基,接入筛选的酵母菌,培养及检测方法同上.

酒精对各菌株的影响:制备含不同酒精浓度分别为3%、5%、7%、9%、11%、13%(v/v)的液体培养基,接入筛选出的酵母菌,培养及检测方法同上.

1 5 酒精发酵能力的测定

于500mL的三角瓶中加入200mL发酵培养基,按10%的比例接入活化后的酵母菌种,分别于30 和40 下静置发酵,每4h测定一次CO2失重,CO2失重小于0 1g时认为发酵结束.发酵结束后测定发酵醪液酒精浓度、残糖和总酸,测定方法见参考文献[6].

2 实验结果

2 1 耐高温酵母菌的筛选

通过在42 下培养及T TC筛选,从23株酵母菌中选出了7株有一定高温耐受性,且酒精发酵能力较强的酵母菌,其编号及形态特征见表1.

表中所列7株菌均具有典型的酵母菌形态,而且经TT C筛选,7株菌都具有较好的酒精发酵性能.为了进一步比较这几株菌的耐高温特性,我们将7株菌分别置于不同高温下培养,实验结果见表2.

表1 耐高温酵母菌的初筛

菌株编号 菌落形态 菌体形态

T M1菌落大,圆形,边缘锯齿形,高凸起,不透明,表面粗糙,不闪光,乳白色圆形/椭圆,出芽生殖

T M6菌落大,圆形,边缘整齐,高凸起,不透明,表面光滑,闪光,灰白色圆形,出芽生殖

T M10菌落中等,圆形,边缘有齿,高凸起,较透明,表面光滑,闪光,灰白色圆形/椭圆,出芽生殖,芽成串T M15菌落大,圆形,边缘整齐,低凸起,不透明,表面光滑,闪光,乳白色圆形/椭圆,出芽生殖

T M16菌落大,圆形,边缘不齐,低凸起,较透明,表面光滑,闪光,乳白色椭圆,略长,出芽生殖

T M20菌落中等,圆形,边缘整齐,高凸起,不透明,表面光滑,闪光,乳白色椭圆,出芽生殖

T M22菌落大,圆形,边缘整齐,低凸起,不透明,表面光滑,闪光,灰白色椭圆,出芽生殖

表2 耐高温酵母菌的复筛

菌株

温度/

42444648 50 5254

T M1++++++++---T M6++++++++++++++++-T M10+++++++++++++++-T M15++++++++---T M16++++++++++---T M20+++++++++++++--T M22++++++++---- 注:?+#表示酵母菌生长情况,?+#越多,表示生长越好,下同.27

第3期 易 弋等:耐高温酒精酵母的筛选

酵母菌的正常生长温度在30 左右,当温度超过35 时,其生长和发酵能力大大减弱[7].目前所筛选的耐高温酒精酵母一般在38~40 还有较高的酒精产率,如沈睿等人[8]筛选的耐高温酵母菌YH4.该菌的最适生长温度为35~38 ,最高生长温度为47 .从图中可以看出7株菌都能在46 下生长,说明它们均有一定的高温耐受性.TM6、TM10和T M20的耐高温能力要明显强于其他4株,其中TM6、TM10的耐高温能力最强,能在52 下生长;T M20次之,能在50 下生长.因此,选择这3株菌进行了后续的实验.

2 2 部分发酵特性的测定

通过筛选,得到了3株具有较强耐高温特性酵母菌.鉴于酵母菌的渗透压耐受性能、耐酸能力以及酒精耐受性在实际生产中是至关重要的,我们测定了3株菌在这几方面的能力,结果见表3、表4和表5.

表3 初始糖浓度对各菌株生长的影响

菌株

葡萄糖含量/%

203040505560

TM6++++++++++++-TM10+++++++++++--TM20+++++++++++--

表4 pH对各菌株生长的影响

菌株

培养基初始pH值

4 54 03 53 02 52 0 TM6+++++++++++--TM10+++++++++++++++-TM20++++++++++++++-

2 2 1 初始糖浓度对各菌株影响

培养基中的糖浓度对酵母菌生长的影响非常大,糖浓度较低会使酵母菌因营养不足而生长缓慢,糖浓度过高又会因渗透压的增大而抑制酵母菌的增殖.提高初始糖浓度可以提高发酵醪的酒精含量,因此生产用的酵母菌都需要有一定的渗透压的耐受能力.从表3中可以看出当初糖浓度达到40%时,3株菌的生长均受到了明显的抑制.糖浓度达到50%时,生长变得缓慢.相对而言T M6对糖渗透压的耐受性要略高于TM10和T M20,它能在55%的初始糖浓度下缓慢生长.

2 2 2 培养基pH值对各菌株生长的影响

在酵母菌酒精发酵的实际生产当中,发酵醪液的pH值非常重要,因为较低的pH值可以抑制杂菌的生长,从而提高发酵的效率.酵母菌正常的生长pH在4 5~5 5之间,而如今某些糖蜜酒精厂为了防止发酵过程中杂菌的污染,已将发酵醪液的pH调低至3 2~3 4,这就要求生产菌有非常好的耐酸特性.从表4中可以看出pH4 0以上,3株菌的生长情况都非常良好.当pH降至3 5时,TM6受到了较严重的抑制,它最低生长的pH为3 0.而TM10和TM20的耐酸能力略强于TM6,能在pH2 5的培养基上生长.

2 2

3 酒精对各菌株生长的影响

在发酵过程中,酵母自身产生的酒精达到一定浓度时,会对酵母本身产生毒性,影响其生长、细胞发育,以及酒精发酵的能力[9],进一步提高酒精浓度,酵母的发酵便会停止.因此,酵母菌的酒精耐受能力对于能否大幅度的提高酒精发酵终浓度至关重要,是评价酒精酵母菌种好坏的重要指标.

从表5可以看出,酒精对酵母菌生长的影响是非常明显的.当酒精浓度提高到5%时,3株菌的生长都受到了明显的抑制.TM10和TM20的酒精耐受性略强于TM6,在含酒精9%的培养基中表现出了微弱的生长.

2 3 酒精发酵能力的测定

测定了三株菌的部分发酵特性后,按1 5所述的方法比较了各株菌的酒精发酵能力,实验结果如表6所示.

表5 酒精对各菌株生长的影响

菌株

培养基酒精浓度/%,v/v 35791113

TM6+++++++---TM10+++++++++--TM20++++++++++--

表6 发酵结果

菌株

酒精浓度/%,v/v残糖/g L-1总酸发酵时间/h

30 40 30 40 30 40 30 40 TM66 825 870 380 265 234 854856 TM107 836 340 250 204 515 034452 TM207 226 810 300 345 024 774852

从表6中可以看出不管在30 还是在40 下,3株菌对糖的利用率都较高,残糖的含量均低于0 4g/ L.从发酵时间来看,高温下的发酵时间比常温下略长,TM10的发酵速度最快,常温下在44h内就完成了发28广西工学院学报 第20卷

酵.常温下TM 10的发酵酒精终浓度最高,达到了7 82%,发酵效率约为84 1%,是一株极具潜力的酒精酵母菌.虽然3株菌在40 下的发酵能力均明显逊于30 ,但值得注意的是TM 20在40 下的发酵酒精终浓度只比30 降低了约6%,是3株菌中降低幅度最小的.这说明TM 20体内与酒精合成相关的酶受高温的影响不大,是一株值得进一步研究的耐高温酒精酵母菌.

3 结论

经菌种富集、分离、纯化,从自然界中筛选到了3株具有较强高温耐受性的酵母菌TM 6、T M10和T M20.3株菌均能在50 的高温下生长,在耐渗透压、耐酸、耐酒精以及发酵能力方面各有优缺点.同前期的实验结果相比较,发现本次实验筛选出的酵母菌发酵能力均优于之前筛选出的菌株[4].经分析认为本次实验由于在筛选过程中加入了TT C 筛选,因此在初筛的时候就将发酵能力弱的菌株淘汰掉了,这说明TTC 的确是一种筛选酒精高产酵母菌的有效方法,值得推广和研究.

虽然TM 20在高温下的生长情况不如TM 6和TM 10,而且常温下TM10的发酵能力也远高于TM 20,但TM20在高温下的发酵能力要明显优于T M6和T M10.此外TM 20在30 和40 下的发酵能力仅相差6%,这说明TM20的发酵能力受温度的影响不大,是一株有潜力的耐高温酒精酵母菌.在后续实验中,希望通过诱变、驯化等方法进一步提高其酒精发酵的能力.参 考 文 献:

[1]王瑞明,关凤梅,马霞,等.固态发酵高产酒精酵母菌株的选育[J].酿酒科技,2002(1):20 21.

[2]王灏,王航,孟春,等.基因组改组技术选育耐高温、耐高乙醇酿酒酵母菌株的研究[J].微生物学通报,2007,34(4):

705 708.

[3]毛志群,张伟,檀建新,等.高产酒精酵母的筛选及鉴定[J].食品与发酵工业,2003,29(3):50 53.[4]易弋,伍时华.酒精耐受性酵母菌的筛选[J].广西工学院学报,2008,19(3):42 46.[5]王梅,张彭湃,帅桂兰,等.T T C 在黄酒酵母选育中的应用[J].酿酒,2001,28(5):62 64.[6]王福荣.酿酒分析与检测[M ].北京:化学工业出版社,2005.

[7]蒋亚平,蔡金芝,杨宝玉,等.耐高温酵母W VHY8的生物学特性及应用[J].微生物学通报,1992,19(6):328 331.[8]沈睿,诸葛健.固态发酵用耐高温酿酒酵母YH4的筛选及其特性研究[J].食品与发酵工业,1991,4(4):8 15.[9]Pina C,Couto J A ,Hogg T.Inferring ethanol tolerance of Saccharomyces and non Saccharomyces yeasts by progressive inacti

vation[J].Biotechnol Lett.,2004,26(19):1521 1527.

Study on screening of thermotolerant yeast strains

YI Yi 1a ,LI Ya 1b ,RONG Yuan ping 1a ,LI Kai 2(1a.Biological &Chemical Engineering Department,

1b.Science and Technology Department,Guangx i University of Technology,Liuzhou 545006,China;

2.Sichuan College of Traditional Chinese Medicine,M ianyang 621000,China)

Abstract:T hree thermotolerant yeast strains,T M6,TM 10and TM 20,w ere isolated from nature.T he results showed that the three strains can survive at 50 and fermentation would be restrained obviously at high tem perature.T he alcohol ferment strength of T M6w as better than the others at 30 and the alcohol concentration reached 7 82%(v/v).But the ferment strength of T M20was higher than TM 6and T M10at 40 .The alco hol concentration w as just reduced about 6%compared with the concentration at 30 .Key words:thermotolerant;alcohol fermentation;yeast;screening

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第3期 易 弋等:耐高温酒精酵母的筛选

耐酒精酵母的筛选

摘要：从野外葡萄园土壤中采集土壤样品，在实验室中通过微生物培养，微生物的富集，菌种的分离、纯化，筛选出纯的酵母菌。将筛选出的纯的酵母菌分组分别进行培养，进行耐酒精能力的比较。培养到最佳时期的时候，分别测定各组酵母菌株培养基中酒精含量，筛选出耐酒精性能最好的菌株。该超强耐酒精能力的优良菌株的成功筛选为酵母菌能高效利用发酵培养液提供了菌种来源，同时也为发酵后的酒精分离降低了难度和成本。 关键词：微生物；耐酒精；酵母；筛选；性能测定 前言：随着化石能源的日趋匮乏及环境污染的加剧，开发一种绿色能源势在必行。乙醇作为一种生产工艺成熟、生产原料来源广的替代能源日益受到人们关注。尤其是燃料酒精作为清洁能源，原料资源可以再生，大大的刺激了酒精行业的发展。用微生物法生产酒精的历史由来已久，并且生产工艺早已成熟。目前乙醇的生产原料为玉米、小麦等粮食产品为主。尽管用粮食生产酒精成本昂贵，但由于用纤维素作原料生产酒精的方法还不成熟，工艺过程很不完善，所以怎样提高粮食生产酒精过程中原料的利用率，是目前酒精发酵过程研究的一个重要方向，也是降低发酵生产酒精的重要措施。因为酒精是酵母菌糖代谢产物，对酵母菌的发酵有一定抑制作用，当酒精成分达到10%左右时，酵母菌就停止繁殖，发酵过程也随之放慢。在酒精发酵过程中，由于一般酒精酵母的耐酒精能力不强（耐酒精度一般为10%），导致酵母菌不能充分利用发酵原料，造成了原料的浪费，同时由于发酵液中酒精含量低，使得酒精后期的分离纯化过程复杂，从而大大增加了

生产成本。因此，耐高酒精度的酒精酵母的筛选具有非常重要的意义。耐高酒精度的酒精酵母能够减缓产物的抑制作用，提升酒精酵母产酒精的潜力【1】。耐酒精酵母可以在发酵液中较高浓度的酒精中不会死亡，并且仍然具有利用培养液发酵酒精的能力，从而提高酒精原料的利用率。同时和一般酵母发酵相比，发酵产物中酒精的含量能达到18%左右，产物中原料和杂质的含量下降，产物中酒精的纯度增加，也使得酒精的分离提纯更加容易进行，从而使粮食生产酒精成本降低。因此高耐性酒精酵母这一领域的研究工作一直在深入的进行，并且有了可喜的成果【2】。耐酒精酵母的应用，使相同原料的酒精产量大大提高，从而使我国的酒精生产总量增加，改善我国酒精产品供应不足的状况，更好的为我国的国民经济服务。酒精成本的降低，使得酒精能源能够得以广泛使用，缓解能源的危机，降低化石燃料的使用，减少日益严重的环境污染，改善我国恶劣的环境状况。对我国经济的可持续发展有着深远的影响。在查阅了大量文献资料的前提下，本文拟从自然界分离筛选一株耐酒精产酒精能力强的酵母菌株，使其应用于工业酒精发酵，提高酒精发酵的产率和质量，降低酒精生产的成本。实验部分： 1材料与试验方法： 1.1材料： 1.1.1样品来源：野外葡萄园中的土壤样品。 1.1.2菌株来源：从葡萄园中土壤样品中分离酵母菌株。 1.1.3培养基：

酵母菌酒精发酵实验报告

实验方案 酵母菌酒精发酵的条件研究 学院（部）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生姓名：鑫 学号：11018150 班级：生物工程二班 指导教师：肖

一、实验目的 1、学会实验的设计和操作过程 2、找到酵母菌发酵时的最优条件 二、培养基和实验方法及材料的确定 1、玉米粉的糖化方法 玉米粉的糖化采用双酶法，其工艺流程如下 玉米粉→加水→液化→糖化→发酵→蒸馏→成品酒精 试验中，发酵培养按照三角瓶100ml培养。本次工做20组是要，共需发酵液20*100=2000ml。培养液按照100g玉米粉、300ml水。所以共需玉米粉700g。 液化：取１００ｇ玉米粉，加入３００ｍＬ的水，液化温度为９０℃，ｐＨ值为５．５，液化时间为３．５ｈ，液化酶的添加量为０．０３５ｇ／１００ ｇ玉米粉 糖化：糖化时的工艺条件为：糖化温度为５８℃，ｐＨ值为４．５，糖化时间为３．５ｈ，糖化酶的添加量为０．３ｇ／１００ｇ玉米粉。 2、活化培养基 本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基的配制，配方如下表一： 表一 3、扩大培养基 扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体的，所 以将其中的琼脂配料去掉。 4、发酵培养基

糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料（硫酸铵0.4%），pH5.5 灭菌 三、培养基的制备及酵母的活化 1、准备酵母母菌一支常温下存放一天，增加菌种的活力。在母菌存放期间制作各时期培养基 2、准备固体培养基（察氏培养基）50ml，做成8支试管斜面，扩大培养基800ml（做扩大培养时使用）。做成8个三角瓶，每瓶200ml。120℃灭菌30min。 3、发酵液的制备 （1）玉米粉的筛选 实验前准备粉碎后的玉米粉700g。 （2）玉米粉的液化 按照100g玉米粉、300ml水的配比对玉米粉进行液化，液化方案上文已经交代。在1000ml烧杯里，或者500ml烧杯分两次，水浴液化。 器材：烧杯500ml两个，玻璃棒一个，水浴锅一个，糖化酶0.225g 步骤：1、将糖化酶，玉米粉，水按照比例配置好在烧杯里。2、将配好的玉米液放于水浴锅中90℃液化3.5h。边液化边搅拌。 （3）玉米粉的糖化 将液化后的玉米液中按照0.3g/100ml加入液化液中。再在水浴锅中，58℃糖化3.5h。 （4）过滤 糖化后的糖化液有可能有没有彻底液化的玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过滤操作。 操作步骤： 最后与以上培养基一起进行灭菌处理。灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌。 （5）活化步骤 器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精。 步骤：1、将器材放于实验台上。对双手合桌面进行灭菌。对接种针进行灼烧灭菌。2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取

影响啤酒酵母发酵的异常因素及其防治

影响啤酒酵母发酵的异常因素及其防治 酵母是啤酒发酵的灵魂，酵母质量的优劣直接关系到啤酒质量的好坏。产品质量是企业的生命，是企业长期发展的基石。在啤酒的生产过程中，酵母的性能和管理在啤酒生产中占着举足轻重的作用。做好酵母管理，提高酵母质量，酿造高质量的啤酒并保持产品稳定是我们所追求的目标。 酵母性能很大程度上影响着啤酒酿造工艺的控制，对啤酒品质起着非常重要的作用。保持接种酵母有旺盛的发酵力是保证啤酒质量稳定的前提，生产酵母一旦发生退化或发酵表现异常，就会影响啤酒酿造工艺的控制和啤酒质量的稳定。 鉴于啤酒酵母对啤酒质量有如此的重要性，如何防止酵母退化，如何预防和控制发酵异常，是我们啤酒厂应时刻关注的问题，应把酵母扩培、酵母管理给予足够的重视。 一、酵母发酵异常的原因 由于环境因素的影响，往往造成酵母细胞机能的衰退。如麦汁营养不良等因素，造成酵母退化突变，造成发酵异常，也会造成酵母细胞的死亡，导致酵母自容量的增加。酵母的变异会造成各种性能的转变。以下从酵母菌种、麦汁营养成分、发酵过程控制三方面谈谈原因。 ㈠酵母菌种 1.凝聚性受遗传基因和细胞膜的结构影响，跟酵母的类型有关。是一种酵母细胞本身生理机能的衰退。 2.菌种保存条件不好，如培养基干燥，将引起酵母菌种的退化。 3.保种温度升高，也将引起酵母菌种退化。温度越高，高温时间越长，菌种退化越严重。 4.保菌不当，营养丰富致使酵母长得过分肥大，易衰退。 5.有些酵母代数升高，凝聚性较强。 6.留种酵母急着用于扩培，造成代谢慢，易衰老。 7.汉生罐留种量多，新酵母少，酵母易衰老。 ㈡麦汁营养成分 1.麦汁过滤布合理，蛋白质，多酚(或树脂)复合物、酒花中的多酚(单宁)等高分子会大量进入发酵罐，造成酵母吸附成团。 2.麦汁营养组成不合理，导致代谢慢，酵母易衰老，突变机会多。 3.麦汁中的凝固物去除不好。麦汁中带正电荷的蛋白质、类脂、葡聚糖小颗粒的物质与带负电荷的酵母互相作用形成紧密的凝聚物，酵母易早衰。混浊麦汁中含有大量的脂肪酸或沉淀物会吸附在酵母表面，造成酵母呼吸代谢困难。造成降糖迟缓或产生大量高级醇。 ㈢发酵过程控制

耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究[开题报告]

毕业论文开题报告 生物工程 耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究 1 选题的背景和意义 石油作为国民经济发展的战略物资在经过人类近二百年的开采后，面临全球桔竭的局面。特别是近年来，随着经济的持续增长和石油需求迅速膨胀，我国已成为继美国之后的第二大能源消费国。针对我国人多地少、粮食紧缺和石油短缺的国情，依据不与人争粮、不与粮争地，能源原料多元化，实现持续发展的原则，开发非粮燃料乙醇生物能源，降低生产成本，提高转化效率，确保现代社会发展的需求，已成为国家新能源战略发展最紧迫的任务。传统酿酒酵母的酒精发酵最适温度不高，一般为25℃一30℃；耐酒性较差，耐酒精浓度在10％左右。一方面，在杂菌污染严重的情况下，生产上不仅要求无菌条件严格，操作难度较大，而且为了控制因发酵热所引起的温度上升，需要加入大量冷却水(甚至在部分气温较高地区，因发酵过程中过热，根本无法进行正常生产)，导致乙醇生产成本增加[1-2]；另一方面，酵母的耐酒精度较低，产物的抑制作用降低乙醇酵母的产乙醇潜力。因此，耐受性酒精高温酵母的选育研究已成为国内外酒精行业的研究热点[3-4]。 乙醇酵母对生活条件的变化有迅速的适应能力，并且随着外界环境的变化，其群体能迅速产生变种，这为耐酒精酵母的筛选提供了可能[1]。耐高温酵母不是微生物分类学上的名词，而是从生态方面表达此类酵母对温度的忍耐性与普通酵母的差异。筛选耐高温的乙醇酵母菌株，其生产上的优势主要体现在：①具有较高的发酵能力，即能快速并完全将糖分转化成乙醇，能够解决糖化温度和发酵温度不协调的矛盾，实现真正意义上的边糖化边发酵，从而减少葡萄糖对纤维素酶的抑制作用，提高纤维素酶的糖化率，进而提高纤维素发酵生产燃料乙醇的得率[2-3]；②繁殖速度快，即具有高的比生长速度，高温发酵还能够提高发酵效率，降低发酵时的冷却成本[4]；③具有高的耐酒精能力，即对本身代谢产物的稳定性高．因而可以进行浓醪发酵；④抗杂菌能力强，即对杂菌代谢产物的稳定性高．耐有机酸能力强；⑤对培养基的适应性强。耐温、耐盐和耐干物质浓度的性能强。 2 相关研究的最新成果及动态

啤酒发酵酵母扩培学习资料

啤酒发酵酵母扩培学习资料 啤酒厂获得接种酵母的方式有三种方式，其优缺点见图2.1： 这三种方式是：购买酵母泥；购买纯种酵母；自己保存和培养纯种酵母。 图2.1 啤酒获得酵母的方式和其优缺点 第一节纯种酵母的培养 一、培养啤酒纯种酵母工艺原理 酵母是一种兼性微生物，这就是说，细胞的新陈代谢和繁殖即可以在有氧的状态下也可以在无氧的状态下进行。 啤酒酵母菌的的繁殖过程分为四个阶段（见图2.7）： 1．迟缓期：在此期间，虽有营养物质存在，但酵母基本不繁殖； 2．对数生长期：此期间酵母繁殖最为迅速； 3．稳定期：此时，代谢产物CO2和酒精的积累使酵母繁殖逐渐变慢，活菌数最高； 4．衰亡期：营养物质耗尽和有毒代谢产物大量积累，酵母菌死亡率增加，活菌数减少。 酵母培养中，最重要的阶段是对数生长期，此时的营养、氧气供给及其他条件如：酵母细胞浓度和温度都必须达到最佳。酵母由于不断地消耗氧气，必须连续通入足够的无菌空气。因为氧气缺乏时，其中一部分酵母会进行发酵，从而产生CO2和酒精，而不是产生新细胞，这样生成的有活力的细胞数就减少了。 二、啤酒纯种酵母的分离培养 啤酒酵母的分离培养就是利用特殊的分离技术，将优良强壮的单细胞酵母从原菌中分离出来，加以扩大培养，供生产使用。分离培养的方法很多，工厂常用的是平板分离法或划

线分离法。 获得原菌的方法： （1）从实验室保存的原菌种中分离，原菌种必须先经过几次培养活化的再行分离； （2）从生产中的酵母泥或主发酵液中分离。 1．平板分离培养法（又称稀释分离法，见图2.2） 这种方法简单易行，适合于工厂现场使用。 先将盛有麦汁的琼脂试管培养基放在热水中融化，冷却至42～45℃，再将准备分离培养的酵母原菌用白金针移植到已融化的培养基内。如分离培养发酵液的酵母，则先使之静置，倾出上部清液，留少量发酵液，混合均匀后接种。如分离培养酵母泥，需加少量无无菌水或麦汁，稀释后再接种。 将分离培养的酵母移植于融化的培养基内后，充分振荡，使混合均匀，用白金针从该试管挑少许移植到第2支试管中，随即将第1支试管中的培养基倾注在已灭菌的培养皿中，均匀分布在培养皿底面，使之凝固。用同样方法再从第2支试管移植到第3支，而后第4支试管内，分别将取样后的培养基倾注在培养皿内，如图所示。然后，将培养皿置25～27℃保温箱中培养2～3天，每天检查菌落生长情况，剔除形态上有改变的菌落，选择菌落形态正常、细胞大小均匀的菌落进行培养。必要时应进行2～3次重复分离。 图2.2 平板分离培养法 2．划线分离培养法 此法和平板分离法的根据是相似的，各有优点。划线法简单，速度较快；平板法在平板上分离的菌落单一均匀，获得纯种的机率略高。 用接种针挑取适当稀释的菌液，直接在已灭菌的平面皿培养基上划线（图2.3），在第3或第4划线区可能得到单一菌落。然后将所需要的菌落移植到斜面培养基上，以待进一步检查。这个方法一般用于分离纯化生产上已有的菌种。 图2.3 划线分离培养法 1,2,3,4-分别表示第1,2,3,4次划线区

耐高温酒精酵母的筛选

文章编号 1004 6410(2009)03 0026 04 耐高温酒精酵母的筛选 易 弋1a ,黎 娅1b ,容元平1a ,李 凯2 (1.广西工学院a.生物与化学工程系b.科技处,广西柳州 545006; 2.四川省中医药高等专科学校,四川绵阳 621000) 摘 要:从酒精厂废液、糖厂废糖蜜、土壤及淤泥等七种不同样品中,经富集、分离、纯化,筛选得到3株耐高温酵母菌T M 6、T M 10和T M 20.实验结果表明,3株菌都能在50 的高温下生长,但高温会明显影响酵母菌的发酵能力.30 下,T M 10的发酵酒精终浓度最高,达到了7.82%(v/v).而在40 下T M 20的发酵能力要高于T M 6和T M 10,且发酵酒精终浓度仅比30 时降低了约6%.关 键 词:耐高温;酒精发酵;酵母;筛选中图分类号:T S262.2 文献标识码:A 收稿日期:2009-06-05 基金项目:广西工学院博士基金项目(0818001),广西工学院科学基金项目(0840202)资助.作者简介:易弋(1979-),男,四川都江堰人,广西工学院生物与化学工程系副教授,博士. 0 引言 自20世纪70年代发生石油危机以来,能源短缺已成为我国乃至世界各国经济发展的主要障碍.发展可 再生资源以解决我国经济持续发展中的能源问题,已成为全社会的共识.燃料乙醇由于其可再生性,被认为是最有可能代替石油的液体燃料,市场潜力十分巨大. 目前工业化生产酒精的发酵温度一般在30~33 左右,在这种温度下发酵需要大量的冷却水.若能使发酵在高温下进行,不但可以减少冷却水的用量,节约生产成本,而且可以从根本上解决糖化与发酵不同步的问题,缩短发酵周期,提高发酵效率[1] .同时高温发酵能有效的抑制杂菌生长,减少醪液受污染的机会.但过高的温度会引起酵母细胞内脂肪酸、磷脂等成分的变化,甚至会导致蛋白质变性,这样一来就会影响细胞正常的生理活动,表现出高温对酵母细胞的毒性[2].因此,对于耐高温酒精酵母菌的选育问题一直是酒精酵母研究者的重要研究方向之一. 针对这一问题,本文拟从自然界中分离出有较强温度耐受性的酵母菌,并初步研究其发酵及相关性能,为下一步的选育工作打下基础. 1 材料与方法 1.1 培养基 酵母培养基:葡萄糖50g,酵母膏8.5g,NH 4Cl 1.0g,MgSO 4 7H 2O 0.6g ,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调pH =4.5,115 灭菌20m in.固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂. 发酵培养基:葡萄糖150g ,酵母膏5g,蛋白胨5g,NH 4Cl 1.0g,M gSO 4 7H 2O 0.6g,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调节pH= 4.5,115 灭菌20min. T TC 上层培养基[3] :葡萄糖0.5g,琼脂1.5g,加水至100mL,115 灭菌20min,待冷却至55 左右时,加入TTC(2,3,5!氯化三苯基四氮唑)0.05g. 第20卷 第3期 广西工学院学报 Vol 20 No 3 2009年9月 JO U RNAL OF G UA NG XI U N IV ERSIT Y OF T ECHN OL OGY Sep 2009

酵母菌的培养与分离

微生物学大实验 实验指导 编者： 生物技术教研室 2007.3

目录 实验一酵母菌的培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2 实验二酵母菌的鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7 实验三酵母菌耐受能力的测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19 实验四酵母菌发酵工艺条件的优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22 实验五耐高温酵母菌株的诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24 实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27

耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究 实验一酵母菌的培养与分离 一、实验目的 学习培养和分离酵母菌的技术和方法 二、基本原理 大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5－6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。 利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。 三、实验主要内容和要求 （一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括： 1．马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。 2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。 3.酵母菌的分离,要求接种一次, 28-30℃，培养24小时，转接一次，28-30℃，培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。 4.用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。 四、实验的准备 1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基： 原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。 配制方法： （1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。 （2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分种。 （3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

果酒制作的实验报告

果酒制作的实验报告集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）

果酒制作的实验报告 一、实验材料：新鲜西瓜半个，新鲜的酵母，水果刀，榨汁机，矿泉水瓶，纱布 二、原理： 果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧型微生物。 ①在有氧的条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，反应式为： C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O；②在无氧条件下，酵母菌进行酒精发酵，反应式为：C6H12O6→2CO2+2C2H5OH。 温度是酵母菌生长和发酵的重要条件，20℃左右最适合酵母菌繁殖。酒精发酵时一般将温度控制在18~25℃。在缺氧，呈酸性的溶液中，酵母液能大量生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。 三、实验步骤： 1、清洗消毒实验用具，先用温水反复冲洗几次,再用体积分数为75%的酒精擦拭消毒，晾干待用； 2、将西瓜表面洗净，在消过毒的环境下将西瓜切成块； 3、将切好的西瓜放入榨汁机中，榨汁。 4、用纱布将西瓜汁过滤除去渣滓，装入事先清洗消毒过的矿泉水瓶，再加入适量酵母菌，密封瓶口。装入的西瓜汁不宜超过瓶子体积的2/3； 5、将瓶子放在温度适宜的地方进行发酵； 6、定期观察果酒的颜色，是否出现气泡等情况的变化，并记录下来；果酒的瓶每天定时排放气体，以免产生的气体过多将瓶涨破；

7、大约10天左右，即可品尝果酒，从色泽，酒味，果香味等各方面进行评价与讨论。 四、实验记录与结果 1、将西瓜汁静置一天后，发现矿泉水瓶膨胀，瓶内产生气泡。 2、放气时，大量气体逸出，带有果香味与酵母菌发酵的味道。 3、7天以后瓶内气体产量逐渐减少，放气频率下降。有酒味。 4、10天后，果酒基本酿好，有浓郁果味与酒味。 五、实验注意事项总结 1、榨汁机、发酵瓶、纱布等实验用具应清洗干净；每次排气时只需拧松瓶盖或出气口，不要完全揭开瓶盖或出气口。 2、应当将温度控制在18~25℃范围内。因为温度对酵母菌的繁殖有很大的影响。温度低于10℃，酵母菌发育很缓慢。随着温度的升高，繁殖速度加快，20℃时为最佳繁殖温度，此时酵母菌生殖速度快，生活力强。超过35℃，酵母菌生长受到抑制，繁殖速度迅速下降，到40℃酵母菌停止出芽，开始出现死亡。如果想要获得高酒精浓度的发酵液，减少酒精的消耗，必须控制好发酵温度。 3、在发酵过程中，要注意防止发酵液被对果酒有害的微生物污染，以至果酒变质。如充气和排气时不要完全拧松和拧紧排气口。

酵母的筛选 (1)

．葡萄果表酵母的分离: 葡萄的采集：葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此在采收葡萄时，将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。2. 菌种分离步骤：将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。随机选取并称量约10g成熟葡萄，放入盛有90ml 无菌水的三角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养30min后静置，制成菌悬液，吸取50μl 放入YEPD固体培养基，三个重复，以无菌刮铲刮匀，25℃培养24～48h。观察菌落的大小及生长状况。然后将静置后的菌悬液进行梯度稀释（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L 的氯霉素。观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。 自然发酵过程中酵母菌的分离: 将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。称量约100g 新鲜成熟度好的各品种葡萄，手工破碎，放入无菌的500ml 三角瓶，接着分别按30ug/ml添加链霉素，置于28℃培养，每隔24h 取发酵液1ml，加入9 ml无菌水中，然后进行梯度稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取样时期分别为：I，葡萄浆果破碎压榨后（添加SO2）；II，发酵旺盛期，葡萄汁含糖量下降20%时；III，发酵后期，葡萄汁含糖量下降70%时；IV，发酵结束前，残糖10%以下时。取0.1ml 稀释后各菌液放入固体培养基，涂布均匀（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，28℃条件下使其自然发酵24～48h，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。观察每一个菌落，编号并作详细描述。如：菌落颜色、表面结构、边缘、颜色等，进行分析和初步的归类。 酿酒酵母筛选及其鉴定一筛选 1 酿酒酵母的无性繁殖方式筛选对液体培养基培养48h的酵母菌株，在16×40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株。 2 WL琼脂培养基筛选酿酒酵母WL琼脂培养基(%质量分数)：酵母浸粉0.5，胰蛋白胨0.5，葡萄糖5，琼脂2，磷酸二氢钾0.055，氯化钾0.0425，氯化钙0.0125，氯化铁0.00025，硫酸镁0.0125，硫酸锰0.00025，溴甲酚绿0.0022，pH 6.5，121℃灭菌20 min；将分离出来的酵母菌株，接种液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基，27℃培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色（浅黄色）至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株。 3 赖氨酸培养基筛选赖氨酸培养基成分（L-1）：D-葡萄糖10g，L-组氨酸1mg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg，对－氨基苯甲酸200μg，生物素20μg，叶酸2μg，肌醇10mg，烟酸400μg，泛酸2mg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素200μg，盐酸硫胺素400μg，硼酸500μg，结晶氯化铜40μg，碘化钾100μg，结晶氯化铁200μg，结晶硫酸锰400μg，结晶钼酸钠200μg，结晶硫酸锌400μg，磷酸二氢钾850mg，磷酸氢二钾150mg，结

酵母扩大培养过程关键控制点

酵母扩大培养过程关键控制点 金星集团信阳啤酒有限公司黄华龙465100 啤酒工厂从单细胞分离得到一个酵母细胞，经过鉴定确认、生产试验，得到优良菌株，然后经过若干次扩大培养，最后制备成107～108个细胞/ml后供发酵用，酵母扩大培养关键在于：第一，选择优良的单一细胞出芽菌株；第二，在整个扩大培养中保证酵母菌种的强壮、无污染。近代由于发酵规模越来越大，对接种酵母要求越来越严。各工厂扩大培养方式和顺序大致相同，而扩陪的结果得到种酵母的纯度、强壮情况、污染情况却差异很大，其原因在于是否有一个科学、无菌的扩培技术管理。 一、出芽菌株的选择 作为扩大培养的出芽菌株，，无论是实验室保藏菌株还是生产现场（主酵或酵母泥）分离得到的菌株。一般均需进行单细胞分离，并通过一系列生理特性和生产性能测定，包括酿酒口味鉴评后，确认是工厂生产需要的优良纯种后才允许投入生产扩大培养。此单细胞分离和菌株鉴定，需要在有丰富微生物理论和实践经验的技术人员指导下进行。 二、扩陪过程的无菌操作 扩大培养应严格建立在纯种的基础上，扩大培养过程的无菌技术是扩陪成败的关键。它包括：培养器皿、设备的无菌，移种操作的无菌，培养过程中通风调节温度的无菌。在汉生罐以后从麦汁进罐至移种结束，必须保证汉生罐处于正压状态，这是杜绝吸入有菌空气的先

决条件。 三、优良的培养基 麦汁是啤酒厂最方便的酵母培养基，但绝对不是“凡可以用来酿造啤酒的麦汁均是优良的培养基”。许多工厂，常常从大生产麦汁中分割作为任何一级扩陪培养基，由于麦汁组成太差，会造成扩大培养失败。无论是哪级扩陪，培养基均需要有特殊要求的麦芽汁。 实验室（从试管至大锥形瓶）培养用麦汁，一般应有实验室自己制备，可按以下方式制备成10°P全麦芽麦汁用于试管活化及菌种保藏。 1.麦汁制备: 1)称取优级麦芽约200g，除去铁屑、石粒等坚硬杂质，采用EBC 粉碎。 2)调EBC粉碎机的磨间距，使细粉颗粒直径为0.2㎜。 3)料水比例：1：3～3.5 4)称取细粉适量（准确至0.1g），于已知重量的糖化杯（500～ 600ml专用金属杯中），加入46℃水200ml,在不断搅拌下于 45℃水浴中保温30min。 5)把温度数显表调至70℃，设定。使醪液以1℃/min的速度升 温，在25min内升至70℃，此时于杯内加入70℃水100ml（加 水时注意冲洗杯壁和搅拌棒）。 6)醪液在70℃下保温1hr，在保温10min时开始碘检，用玻璃 棒取一滴麦汁，置于白瓷滴板上，冷却后加一滴碘溶液，混

酒精酵母

一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种 四川理工学院 设计（论文）题目：一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种 1．毕业设计（论文）的主要内容及基本要求 [1]大曲中分离及纯化酵母菌。 [2]紫外线诱变，氯化锂诱变和紫外线与氯化锂复合诱变。 [3]分别对诱变菌的发酵性能和产气情况的测定。 2．指定查阅的主要参考文献及说明 [1]《酿造酒工艺学》（第二版）中国轻工业出版社顾国贤主编 [2]《微生物学》（第二版）高等教育出版社周德庆主编 [3]《微生物学实验指导》高等教育出版社黄秀梨主编 [4]《现代微生物遗传学》化学工业出版社陈三凤刘德虎编著 3．进度安排 设计（论文）各阶段名称起止日期 1 文献检索：收集资料、撰写开题报告2009.03.23--2009.03.29 2 文献、资料查阅整理，撰写文献综述2009.03.30--2009.04.05 3 拟订实验方案，提出实验条件及需求2009.04.06--2009.04.11 4 实验仪器及药品的准备2009.04.11--2009.05.12 5 实验实施，现象观察并做好数据记录2009.04.13--2009.05.20 6 分析实验结果，整理数据2009.05.21--2009.05.28 7 撰写论文、修改论文2009.05.29--2009.06.10 8 论文定稿、打印、准备及答辩2009.06.10--2009.06.17 注：本表在学生接受任务时下达 一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种

本文主要介绍了耐酒精酵母的诱变育种，通过诱变得到高发酵力和高耐酒精性能的酵母菌。本实验拟从大曲中分离及纯化得到具有发酵产酒精能力的酵母菌种,并以该菌作为出发菌株,首先分别通过紫外光诱变，氯化锂诱变和紫外光与氯化锂复合诱变，然后分别测试诱变后的酵母菌株的酒精发酵及耐酒精性能，从而筛选得到高发酵能力及高耐酒精度的酵母菌株。 关键词：酵母菌；耐酒精；紫外线；氯化锂；复合诱变 目录 摘要 .................................................... ..错误!未定义书签。ABSTRCT............. .........................................错误!未定义书签。目录 (Ⅲ) 前言 ...................................................... 错误!未定义书签。第一章实验仪器与材料........................................ 错误!未定义书签。 1.1 仪器与设备............................................. 错误!未定义书签。 1.2 材料与试剂............................................. 错误!未定义书签。 1.3 实验试剂的配制 (4) 1.4 培养基的配制 (5) 第二章实验内容与方案 (6) 2.1 大曲中酿酒酵母的分离 (6) 2.2 出发菌株的能力测定 (7) 2.3 紫外线诱变酵母菌 (8) 2.4 氯化锂诱变酵母菌 (10) 2.5 紫外线-氯化锂复合诱变酵母菌 (13) 第三章实验结果与讨论........................................ 错误!未定义书签。 3.1实验结果............................................... 错误!未定义书签。 3.2 实验讨论 (35) 第四章结论 (39) 第五章综述 (41) 参考文献 (44) 致谢 (46) 附录 (47)

酵母菌的分离筛选方法

酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 1.1葡萄糖50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L KH2PO4 2.5g/L Na2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加 拉红 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用） ★1.2乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用 蔗糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱 布过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培 养用）（富集用） ★1.3麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素0.1g/L PH6.0-6.4 121℃ 20min （分离保存用）灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★1.4虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5.0g/L 葡萄糖10g/L KH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉红0.033g/L 氯霉素0.1g/L 琼 脂15g/L PH自然

（分离纯化用） ★1.5 豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g 黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 1.6察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾0.5g/L 硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁0.01g/L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。

小议高产酒精酵母菌的紫外线诱变选育

聂世现，王钰，黄文静，季必霞 0 引言 石油是世界经济与发展的基本能源之一，其储备有限。20世纪70年代世界范围发生石油危机，使利用可再生的资源（如高淀粉作物）发酵生产酒精作为生物能源的研究成为人们关注的焦点。生物能源与石油相比具有可再生、污染小、减少温室效应等优点，能部分或全部代替汽油。目前，燃料酒精的生产占世界酒精总产量的66%，并且还有进一步增加的趋势。发酵法是酒精生产的重要方法，发酵法生产酒精的关键是酵母菌株，酒精酵母的优劣不仅直接影响发酵率的高低，而且会影响酒精的产量和质量。我国酒精生产行业中普遍存在亟待解决的问题是发酵强度低,生产成本高,能耗大。因此，高产酒精酵母的选育是提高酒精产率，节约生产能源的关键。 为了开展非粮作物甘薯等转化酒精的研究，本论文探讨了酵母菌A4原生质体制备和再生的适宜条件，并用紫外线作诱变剂，对酵母菌原生质体进行诱变处理，旨在筛选出发酵力强、酒精产量高的优良酵母菌株，为下一步以高产淀粉品种甘薯为原材料生产酒精的研究工作奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 酵母菌（A4）为本实验室保藏菌种。 1.1.2 培养基 麦芽汁液体培养基：将麦芽汁（购于合肥市华润雪花啤酒厂）糖度调至12°Brix，过滤后121℃灭菌20min。 YPD培养基(g/L)： 液体培养基：酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20。 固体培养基：在YPD液体培养基中加入琼脂20，NaOH0.1。 原生质体再生培养基：在YPD固体培养基中分别添加KCl至0.7mol/L，山梨醇至0.8mol/L，甘露醇至0.8mol/L，17%的蔗糖。 以上培养基于115℃灭菌20min。 TTC上层培养基(g/L)：TTC（三苯基四氮唑盐酸盐）0.5，葡萄糖5，琼脂15。 TTC下层培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨2，酵母膏1.5，K2HPO41，MgSO4·7H2O4，琼脂20，pH5.5。 1.1.3 试剂 缓冲液：pH6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液。 预处理剂：0.1%β-巯基乙醇，其中含0.1mol/L的EDTA-Na2。 稳渗剂：KC1高渗缓冲液：缓冲液中添加KC1至0.7mol/L；山梨醇高渗缓冲液：缓冲液中添加山梨醇至0.8mol/L；甘露醇高渗缓冲液：缓冲液中添加甘露醇至0.8mol/L；蔗糖高渗缓冲液：缓冲液中加入17%的蔗糖。 酶液：分别将1%，1.5%，2%，2.5%的蜗牛酶和0.4%蜗牛酶+0.4%纤维素酶溶于高渗缓冲液中，微孔滤膜过滤除菌，制备成不同浓度的酶液。酶购于上海生工。 1.2 方法 1.2.1 出发菌株的原生质体制备与再生 1.2.1.1 出发菌株生长曲线的测定 挑取斜面菌株1～2环接种于50mLYPD液体培养基中，28℃，200r/min摇床培养24h后分别以1:100的量接种于装有10mLYPD液体培养基的大试管中，28℃，200r/min摇床培养，每隔2h取出一支试管，测定其OD600值，绘制其生长曲线。 1.2.1.2 出发菌株原生质体制备与再生 将活化好的菌种接种于盛有50mLYPD液体培养基的锥形瓶中，28℃，200r/min摇床培养，当其进入对数生长期时，取5mL菌液3500r/min离心5min，用磷酸-柠檬酸缓冲液洗2次，无菌加入0.1%β-巯基乙醇，28℃

酵母发酵酒精的研究进展

酵母发酵酒精的研究进展 （生命科学与技术学院微生物专业） 前言 人类利用酵母菌的历史已有几千年了。值得提出来的是，早在我国宋代的酿酒著作中，中国人已经明确记载了从发酵旺盛的酿酒缸内液体表面撇取酵母菌（当然不是纯粹的酵母菌）的方法，并把它们称为“酵”，风干以后制成的“干酵”可以长期保存。这种制造干酵母的原始方法说明，早在800年前，中国人已经意识到酒精发酵是由“酵”，即某种能生长的物质引起的。这种推断直到19世纪巴斯德才证明是酵母菌。明代末年出版的词书中记载有“以酒母起面曰发酵”，“发酵，浮起者是也”等解释。这说明至少在那时，一引起细心观察自然现象和注意比较的学者，已经认识到发面和酿酒有某种相同的因素在起作用。当时在欧洲虽然已经发现了酵母菌，但在200年后才知道酵母菌的作用。今天我们把这类微生物称酵母菌，正是以此为根据的。 酵母菌能够把糖变成酒精，是因为它的细胞里有催化剂，这些存在于生物细胞的催化剂在科学上叫做酶。虽然现在知道所有的生物都是靠酶催化的化学反应来生活的，但最早发现的酶，就是酵母菌的酶。酵母菌中最早发现的酶，是把糖变成酒精的一群酶，当时自然数酒化酶。由于这种酶的作用，使糖分解成酒精和二氧化碳，这就是利用酵母菌酿酒和发面包的原理。使面团产生许多空隙的就是二氧化碳。酵母细胞大小为2.5-10μm×4.5-21μm, 在加盖的玉米琼脂上不产生假菌丝或有不典型的假菌丝, 营养细胞可直接变为子囊, 每囊有1-4个圆形光面的子囊孢子, 在麦芽汁25℃培养3d, 细胞为圆形、卵形、椭圆形和香肠形。其菌落在麦芽汁琼脂上为乳白色, 有光泽, 平坦, 边缘整齐。菌体维生素、蛋白质含量高, 既可食用又可提取细胞色素C、核酸、麦角固醇、谷胱甘肽、凝血质、辅酶A、三磷酸腺苷等。该菌种能发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖及蔗糖, 但不能发酵乳糖和蜜二糖, 不同化硝酸盐。 酵母菌的繁殖方式既可进行无性繁殖，如芽殖，又可进行有性生殖；酵母菌既可进行有氧呼吸，又可进行无氧呼吸，是一种兼性厌氧呼吸的真核微生物。单细胞真核生物酿酒酵母基因组为12,068kb，比单细胞的原核生物和古细菌大一个数量级。酿酒酵母基因组共有5887个ORF，这比原核生物和古细菌要多很多。酿酒酵母的基因密度为1个基因/2kb，密度小于原核生物流感嗜血杆菌和尿殖道支原体等。酿酒酵母是最小的真核基因组，裂殖酵母其次，其密度是1/2.3kb，简单多细胞生物线虫的基因密度为1/30kb。第二、酿酒酵母只有4%的编码基因有内含子，而裂殖酵母则有40%编码基因有内含子。 1、酵母的生长条件 1.1 无机盐

果酒酵母发酵及菌种保藏

果酒酵母发酵及菌种保藏 选取1-2 种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。 1. 实验目的和内容 1）掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。 2）用选育果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程。 3）了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。 4）学习几种常用菌种保藏方法：斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏方法、沙土管保藏方法、冷冻干燥保藏方法。 2. 实验原理 果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。可用以下反应式来说明： 果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。 果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。 微生物具有容易变异的特性，因此经过分离纯化选育的酿酒酵母要经历长期的保存必须要用实验方法对其保藏，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物 代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。保藏方法大致可分为以下几种： 1）传代培养保藏法 又称斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6 C 冰箱内保存。 2）液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3）载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4）寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须 在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5）冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20至-30C, -50至-80C）、干冰酒精快速冻结（约-70C）和液氮（-196C）等保藏法。

啤酒酵母 的介绍

导言： 啤酒酵母是啤酒生产的灵魂，啤酒酵母的种类和质量的不同将影响啤酒的发酵和成品啤酒的质量。本章主要介绍啤酒酵母、啤酒发酵机理、啤酒发酵技术等内容。啤酒酵母部分主要包括啤酒酵母的分类、结构和组成，啤酒酵母的新陈代谢、特性，酵母的选育与扩大培养，啤酒酵母质量的鉴别方法。重点是酵母的扩大培养和啤酒酵母质量的鉴别；啤酒发酵机理主要涉及发酵过程中主要物质的转化、代谢主产物（乙醇）的合成途径和副产物（高级醇、双乙酰、酯类、醛类、有机酸、含硫化合物等）的合成与有关控制理论，要求重点掌握啤酒发酵过程中糖类和含氮物质是如何转化的？代谢主要副产物高级醇、双乙酰等是如何形成的？对啤酒质量有何影响？如何控制其产生量？啤酒发酵技术主要包括传统发酵技术、现代发酵技术（以圆柱锥形发酵罐发酵法为主）和其他发酵技术。重点学习锥形罐发酵技术及其相关知识。 第一节啤酒酵母 一、酵母的分类、结构和组成 （一）啤酒酵母的分类 在微生物分类学上，通常将微生物分为门、纲、目、科、属、种，种以下有变种、型、品系等。啤酒酵母属于真菌门，子囊菌纲，原子囊菌亚纲、内孢霉目，内孢霉科，酵母亚科，酵母属，啤酒酵母种。酵母采用双名法命名，前一个是属名，后一个是种名，后面还跟有首次描述这个种的科学家名字。根据啤酒酵母的发酵（棉子糖发酵）类型和凝聚性的不同可分为上面酵母与下面酵母、凝聚性酵母与粉状酵母。 凝聚性酵母与粉状酵母：发酵时容易相互凝聚而沉淀的酵母称为凝聚性酵母。一般发酵期间，酵母由于带相同电荷不会相互凝聚，发酵快结束时pH降至4.3～4.7接近酵母细胞的等电点，使酵母细胞相互凝聚而沉淀。使用凝聚性酵母，啤酒澄清快，但发酵度较低。酵母的凝聚性既受基因的控制，又与环境条件有关且凝聚作用是可逆的；粉状酵母在发酵期间始终悬浮于发酵液中，不易沉淀，酵母回收困难，啤酒难以澄清，但发酵度高。 （二）啤酒酵母的结构 通过显微镜观察啤酒酵母的细胞，可以看到有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、内质网膜、线粒体、颗粒等。 （三）酵母细胞的组成