耐高温、高浓度酒精酵母的选育与耐受性能初步鉴定
耐酒精酵母的筛选
摘要：从野外葡萄园土壤中采集土壤样品，在实验室中通过微生物培养，微生物的富集，菌种的分离、纯化，筛选出纯的酵母菌。将筛选出的纯的酵母菌分组分别进行培养，进行耐酒精能力的比较。培养到最佳时期的时候，分别测定各组酵母菌株培养基中酒精含量，筛选出耐酒精性能最好的菌株。该超强耐酒精能力的优良菌株的成功筛选为酵母菌能高效利用发酵培养液提供了菌种来源，同时也为发酵后的酒精分离降低了难度和成本。 关键词：微生物；耐酒精；酵母；筛选；性能测定 前言：随着化石能源的日趋匮乏及环境污染的加剧，开发一种绿色能源势在必行。乙醇作为一种生产工艺成熟、生产原料来源广的替代能源日益受到人们关注。尤其是燃料酒精作为清洁能源，原料资源可以再生，大大的刺激了酒精行业的发展。用微生物法生产酒精的历史由来已久，并且生产工艺早已成熟。目前乙醇的生产原料为玉米、小麦等粮食产品为主。尽管用粮食生产酒精成本昂贵，但由于用纤维素作原料生产酒精的方法还不成熟，工艺过程很不完善，所以怎样提高粮食生产酒精过程中原料的利用率，是目前酒精发酵过程研究的一个重要方向，也是降低发酵生产酒精的重要措施。因为酒精是酵母菌糖代谢产物，对酵母菌的发酵有一定抑制作用，当酒精成分达到10%左右时，酵母菌就停止繁殖，发酵过程也随之放慢。在酒精发酵过程中，由于一般酒精酵母的耐酒精能力不强（耐酒精度一般为10%），导致酵母菌不能充分利用发酵原料，造成了原料的浪费，同时由于发酵液中酒精含量低，使得酒精后期的分离纯化过程复杂，从而大大增加了
生产成本。因此，耐高酒精度的酒精酵母的筛选具有非常重要的意义。耐高酒精度的酒精酵母能够减缓产物的抑制作用，提升酒精酵母产酒精的潜力【1】。耐酒精酵母可以在发酵液中较高浓度的酒精中不会死亡，并且仍然具有利用培养液发酵酒精的能力，从而提高酒精原料的利用率。同时和一般酵母发酵相比，发酵产物中酒精的含量能达到18%左右，产物中原料和杂质的含量下降，产物中酒精的纯度增加，也使得酒精的分离提纯更加容易进行，从而使粮食生产酒精成本降低。因此高耐性酒精酵母这一领域的研究工作一直在深入的进行，并且有了可喜的成果【2】。耐酒精酵母的应用，使相同原料的酒精产量大大提高，从而使我国的酒精生产总量增加，改善我国酒精产品供应不足的状况，更好的为我国的国民经济服务。酒精成本的降低，使得酒精能源能够得以广泛使用，缓解能源的危机，降低化石燃料的使用，减少日益严重的环境污染，改善我国恶劣的环境状况。对我国经济的可持续发展有着深远的影响。在查阅了大量文献资料的前提下，本文拟从自然界分离筛选一株耐酒精产酒精能力强的酵母菌株，使其应用于工业酒精发酵，提高酒精发酵的产率和质量，降低酒精生产的成本。实验部分： 1材料与试验方法： 1.1材料： 1.1.1样品来源：野外葡萄园中的土壤样品。 1.1.2菌株来源：从葡萄园中土壤样品中分离酵母菌株。 1.1.3培养基：
酵母菌酒精发酵实验报告
实验方案 酵母菌酒精发酵的条件研究 学院（部）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生姓名：鑫 学号：11018150 班级：生物工程二班 指导教师：肖
一、实验目的 1、学会实验的设计和操作过程 2、找到酵母菌发酵时的最优条件 二、培养基和实验方法及材料的确定 1、玉米粉的糖化方法 玉米粉的糖化采用双酶法，其工艺流程如下 玉米粉→加水→液化→糖化→发酵→蒸馏→成品酒精 试验中，发酵培养按照三角瓶100ml培养。本次工做20组是要，共需发酵液20*100=2000ml。培养液按照100g玉米粉、300ml水。所以共需玉米粉700g。 液化：取１００ｇ玉米粉，加入３００ｍＬ的水，液化温度为９０℃，ｐＨ值为５．５，液化时间为３．５ｈ，液化酶的添加量为０．０３５ｇ／１００ ｇ玉米粉 糖化：糖化时的工艺条件为：糖化温度为５８℃，ｐＨ值为４．５，糖化时间为３．５ｈ，糖化酶的添加量为０．３ｇ／１００ｇ玉米粉。 2、活化培养基 本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基的配制，配方如下表一： 表一 3、扩大培养基 扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体的，所 以将其中的琼脂配料去掉。 4、发酵培养基
糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料（硫酸铵0.4%），pH5.5 灭菌 三、培养基的制备及酵母的活化 1、准备酵母母菌一支常温下存放一天，增加菌种的活力。在母菌存放期间制作各时期培养基 2、准备固体培养基（察氏培养基）50ml，做成8支试管斜面，扩大培养基800ml（做扩大培养时使用）。做成8个三角瓶，每瓶200ml。120℃灭菌30min。 3、发酵液的制备 （1）玉米粉的筛选 实验前准备粉碎后的玉米粉700g。 （2）玉米粉的液化 按照100g玉米粉、300ml水的配比对玉米粉进行液化，液化方案上文已经交代。在1000ml烧杯里，或者500ml烧杯分两次，水浴液化。 器材：烧杯500ml两个，玻璃棒一个，水浴锅一个，糖化酶0.225g 步骤：1、将糖化酶，玉米粉，水按照比例配置好在烧杯里。2、将配好的玉米液放于水浴锅中90℃液化3.5h。边液化边搅拌。 （3）玉米粉的糖化 将液化后的玉米液中按照0.3g/100ml加入液化液中。再在水浴锅中，58℃糖化3.5h。 （4）过滤 糖化后的糖化液有可能有没有彻底液化的玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过滤操作。 操作步骤： 最后与以上培养基一起进行灭菌处理。灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌。 （5）活化步骤 器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精。 步骤：1、将器材放于实验台上。对双手合桌面进行灭菌。对接种针进行灼烧灭菌。2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取
生物化学实验报告-酵母RNA的提取与鉴定
实验五酵母RNA的提取与鉴定 一、实验目的 1.掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。 2.了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。 二、实验原理 1.酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于2%。 2.RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。 3.用碱液提取的RNA有不同程度的降解 三、实验仪器 1.离心机 2.水浴锅 3.电炉 4.烧杯 5.量筒 四、实验试剂 1.干酵母粉 2.0.2%氢氧化钠溶液：2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 3.乙酸 4.95%乙醇 5.无水乙醚
6.10%硫酸 7.氨水 9.5%硝酸银溶液：5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。 1.苔黑酚-三氯化铁溶液： 将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl 3.6H2O。 临用时配制。 五、实验步骤 1.RNA的提取： （1）称取2g干酵母粉于100ml烧杯中，加入 0.2%氢氧化钠溶液10ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌（如沸水浴过程中溶液蒸干可再加5~10ml氢氧化钠）。然后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（pH 试纸检验），离心10-15分钟（4000r.p.m）。 （2）取上清液，加入2倍体积的95%乙醇，边加边搅，加毕，静止，待完全沉淀，过滤。 （3）滤渣先用95%乙醇洗2次，每次约5毫升，再用无水乙醚洗2次，每次也约5ml。 （4）洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可鉴定。 2.鉴定： （1）取上述RNA约 0.5g，加10%硫酸5ml,加热至沸1—2分钟，将RNA水解。
3种酵母样真菌鉴定方法的比较
1 进修生 收稿日期:2001-04-103种酵母样真菌鉴定方法的比较农生洲 韦柳宏1 陈松峰 (广西壮族自治区人民医院检验科 南宁 530021) 为综合评价目前我国实验室常规手工发酵鉴定法(常规法)、生物梅里埃A T B Fug us卡鉴定法(仪器法)和近年国内开始应用的科玛嘉(CHRo M ag ar)酵母样真菌显色培养基鉴定法(显色法)等3种酵母样真菌鉴定方法的优劣。我们同时用这3种方法对实验室保存的122株酵母样真菌标准菌株进行了鉴定比较,报道如下。 1 材料与方法 1.1 菌株来源:122株实验菌为实验室历年保存的标准菌株,其中白假丝酵母菌53株,热带假丝酵母菌31株,光滑球假丝酵母菌18株,近平滑假丝酵母菌11株,克柔氏假丝酵母菌3株,季也蒙假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌各2株,粘红假丝酵母菌、酿酒假丝酵母菌各1株。 1.2 试剂:沙氏培养基和各种手工用发酵管均购自杭州天和微生物试剂公司;Fug us卡及其配套仪器A T B Ex pressio n 为法国生物梅里埃公司产品;显色培养基则购自郑州搏赛科技有限责任公司。 1.3 鉴定方法:常规法鉴定按卫生部医政司颁发的《全国临床检验操作规程》进行;Fug us卡法按配套的操作手册取菌制成悬液,加样后置37℃培养24h后上机鉴定;显色法则取F ugus卡法剩余的悬液直接接种于显色培养基制成的平板上,置37℃培养,每隔24h观察一次结果,据菌落颜色进行判定;翠绿色为白假丝酵母菌,兰灰色为热带假丝酵母菌,紫红色边缘模糊有微毛为克柔氏假丝酵母菌菌,整个菌落湿润且紫红色为光滑球假丝酵母菌,白色为其它假丝酵母菌。 2 结 果 2.1 培养鉴定耗时:常规法和仪器法需预先用沙氏培养基培养出真菌,平均耗时大约72h,再加上鉴定耗时又分别平均约需72h和24h,常规法培养鉴定总共平均约需6d,仪器法约需4d;显色法集培养与鉴定于一体,耗时平均约需4 d。 2.2 鉴定结果:122株酵母样真菌的鉴定中,三法对53株白假丝酵母菌鉴定全部正确。其它69株菌中,常规法有11株无法鉴定到种,占总株数9.0%(11/122)。此外有5株热带假丝酵母菌鉴定错误,3株错定为光滑球假丝酵母菌,2株错定为近平滑假丝酵母菌。有3株光滑球假丝酵母菌鉴定错误,1株误定为热带假丝酵母菌,2株误定为近平滑假丝酵母菌。有2株近平滑假丝酵母菌鉴定错误,1株误为热带假丝酵母菌,1株误为光滑球假丝酵母菌。除无法鉴定到种的11株菌后,鉴定错误率仍有9.0%(10/111);显色法对白假丝酵母菌等该法能鉴定的6种酵母样真菌鉴定准确率达100%,其它菌株却无法鉴定到种,占总株数4.1%(5/122); F ugus卡法全部菌株均可鉴定到种,且准确率达100%。详见表1。 表1 122株酵母菌样真菌3种方法鉴定结果比较(株) 菌名菌株数常规法显色法仪器法 白假丝酵母菌 53 53 53 53 热带假丝酵母菌31273131 光滑球假丝酵母菌18171818 近平滑假丝酵母菌11111111 克柔氏假丝酵母菌3133 粘红假丝酵母菌1111 季也蒙假丝酵母菌2102 葡萄牙假丝酵母菌2002 酿酒假丝酵母菌1001 2.3 成本核算:常规法鉴定每一株菌平均约需10元,仪器法平均约需50元,显色法平均约需15元。 3 讨 论 当前酵母样真菌引起的临床感染正呈逐步增加之势,临床医师急需实验室准确快速地检出病原体以协助诊治[1]。纵观本试验结果,加上预先真菌培养时间常规法鉴定耗时总共需要至少6d左右,且操作繁琐,生化结果判定较困难,即使是标准菌株,结果仍极易出错。而如F ugus卡等仪器测试卡法,虽然鉴定耗时较短,操作也简便,鉴定结果准确率又高且可配套进行体外药敏试验,但因仪器和试卡均为进口产品,价格昂贵,只适合在有大量标本的大型综合性医院应用。从本研究可看出,显色法培养加鉴定耗时平均仅需48h,与应用仪器法耗时基本相等,且培养基制备方便,价格适中,结果判定简便快速准确,虽然有一部分菌株无法鉴定到种,但已能鉴定出目前临床感染95%以上的3～4种酵母样真菌感染[2],故不失为一种替代常规法在中小医院普及开展的酵母样真菌检验方法。 参 考 文 献 1 周贵民,谢 灵.国内酵母菌感染和实验室诊断的现状及建议.中华医学检验杂志,1996,19(5):301-303. 2Pfaller M A,Housto n A,Co ffman S.A pplicatio n of CHR OM ag ar Ca ndida for r apid scr eening o f clinical specimens for Candida A lbicans,Candida tro picalis, Candida K rusei,and Candida(T or ulopsis)glabrata.J Clin M icr o bilo l,1996,34(1):58-61. ? 764?广西医科大学学报 JOURNA L OF GU ANGXI M EDICAL UNIVERSIT Y 2002Oct;19(5)
耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究[开题报告]
毕业论文开题报告 生物工程 耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究 1 选题的背景和意义 石油作为国民经济发展的战略物资在经过人类近二百年的开采后，面临全球桔竭的局面。特别是近年来，随着经济的持续增长和石油需求迅速膨胀，我国已成为继美国之后的第二大能源消费国。针对我国人多地少、粮食紧缺和石油短缺的国情，依据不与人争粮、不与粮争地，能源原料多元化，实现持续发展的原则，开发非粮燃料乙醇生物能源，降低生产成本，提高转化效率，确保现代社会发展的需求，已成为国家新能源战略发展最紧迫的任务。传统酿酒酵母的酒精发酵最适温度不高，一般为25℃一30℃；耐酒性较差，耐酒精浓度在10％左右。一方面，在杂菌污染严重的情况下，生产上不仅要求无菌条件严格，操作难度较大，而且为了控制因发酵热所引起的温度上升，需要加入大量冷却水(甚至在部分气温较高地区，因发酵过程中过热，根本无法进行正常生产)，导致乙醇生产成本增加[1-2]；另一方面，酵母的耐酒精度较低，产物的抑制作用降低乙醇酵母的产乙醇潜力。因此，耐受性酒精高温酵母的选育研究已成为国内外酒精行业的研究热点[3-4]。 乙醇酵母对生活条件的变化有迅速的适应能力，并且随着外界环境的变化，其群体能迅速产生变种，这为耐酒精酵母的筛选提供了可能[1]。耐高温酵母不是微生物分类学上的名词，而是从生态方面表达此类酵母对温度的忍耐性与普通酵母的差异。筛选耐高温的乙醇酵母菌株，其生产上的优势主要体现在：①具有较高的发酵能力，即能快速并完全将糖分转化成乙醇，能够解决糖化温度和发酵温度不协调的矛盾，实现真正意义上的边糖化边发酵，从而减少葡萄糖对纤维素酶的抑制作用，提高纤维素酶的糖化率，进而提高纤维素发酵生产燃料乙醇的得率[2-3]；②繁殖速度快，即具有高的比生长速度，高温发酵还能够提高发酵效率，降低发酵时的冷却成本[4]；③具有高的耐酒精能力，即对本身代谢产物的稳定性高．因而可以进行浓醪发酵；④抗杂菌能力强，即对杂菌代谢产物的稳定性高．耐有机酸能力强；⑤对培养基的适应性强。耐温、耐盐和耐干物质浓度的性能强。 2 相关研究的最新成果及动态
食品中霉菌和酵母分布检测和鉴定-福建疾病预防控制中心
食品中霉菌和酵母分布、检测和鉴定 福建省疾病预防控制中心马群飞 1. 霉菌和酵母的基本特性 霉菌和酵母这种称谓仅是为了方便起见，将小型真菌有真正菌丝的称为霉菌，没有菌丝的称酵母，并没有分类学上的依据。相对于低等的细菌来说，霉菌和酵母生长缓慢，竞争能力较弱，故霉菌和酵母常在不利于细菌生长繁殖的环境中形成优势菌群。由于霉菌和酵母的细胞较大，新陈代谢能力强，故10２～10４个酵母即可引起一克食物的变质，而细菌则需要100倍于此数的细胞。 通常霉菌和酵母适合在高碳低氮有机物如植物性物质上生存。适合的pH 3～8，有些霉菌可以在pH2，酵母在pH 1.5时生活。水活度要求0.99～0.61，霉菌0.85时最适宜，某些嗜渗酵母和霉菌常引起糖果类食品的变质。一般的霉菌的生长温度为20～30℃，部分霉菌可以在不低于－7℃的温度下生长。酵母一般在0～45℃时生长。耐热能力较差，酵母细胞55～56℃几分钟就被杀死。少数霉菌的孢子（如丝衣霉）则可在90℃中耐受 几分钟。霉菌和酵母很多可以耐受防腐剂。如乳酸、醋酸、CO ２和SO ２ 等。有些酵母酯酶 活性高并能合成B族维生素。 2. 食品中酵母的常见类群 在食品中能分离出各种酵母菌，但它们很可能没有什么意义，因为其中多数来源于外界的偶然污染。仅有非常有限的几个酵母属可使经过加工并正常生产工艺包装的食品腐败。比如抗SO ２ 熏蒸的酵母，就是饮料、葡萄酒变质的常见因素。耐受保鲜剂的毕赤酵母，高度嗜氧，可以形成泡菜和酱油的表面膜。 当然，如果不按照标准的生产程序进行食品生产，那么许多外界污染的酵母都将在食品中大量繁殖，这种情况下，就谈不上优势菌群问题了，也不必进行酵母的分类鉴定。处理方法只有一个，恢复正常的生产程序。 2.1 乳制品：鲜奶易因细菌污染而腐败，酵母菌不是重要问题。当鲜奶被加工成奶油、乳酪、酸奶等制品后，由于细菌被抑制，酵母可相应地成为优势菌。它们使奶油、乳酪产生怪味和气体，使黄油产生有味物质，并可使酸奶和酸乳酪腐败。在实验室中，汉逊德巴利酵母、布提利假丝酵母、多孢丝孢酵母和红酵母均能导致固体和液体乳酪的腐败。 2.2 肉类与肉制品：通常情况下，这类制品适于细菌的生长，酵母不是引起变质的主要原因。某些德巴利酵母可使冷冻的猪、牛肉香肠和午餐肉表面出现令人不愉快的粘滑感觉。
耐高温酒精酵母的筛选
文章编号 1004 6410(2009)03 0026 04 耐高温酒精酵母的筛选 易 弋1a ,黎 娅1b ,容元平1a ,李 凯2 (1.广西工学院a.生物与化学工程系b.科技处,广西柳州 545006; 2.四川省中医药高等专科学校,四川绵阳 621000) 摘 要:从酒精厂废液、糖厂废糖蜜、土壤及淤泥等七种不同样品中,经富集、分离、纯化,筛选得到3株耐高温酵母菌T M 6、T M 10和T M 20.实验结果表明,3株菌都能在50 的高温下生长,但高温会明显影响酵母菌的发酵能力.30 下,T M 10的发酵酒精终浓度最高,达到了7.82%(v/v).而在40 下T M 20的发酵能力要高于T M 6和T M 10,且发酵酒精终浓度仅比30 时降低了约6%.关 键 词:耐高温;酒精发酵;酵母;筛选中图分类号:T S262.2 文献标识码:A 收稿日期:2009-06-05 基金项目:广西工学院博士基金项目(0818001),广西工学院科学基金项目(0840202)资助.作者简介:易弋(1979-),男,四川都江堰人,广西工学院生物与化学工程系副教授,博士. 0 引言 自20世纪70年代发生石油危机以来,能源短缺已成为我国乃至世界各国经济发展的主要障碍.发展可 再生资源以解决我国经济持续发展中的能源问题,已成为全社会的共识.燃料乙醇由于其可再生性,被认为是最有可能代替石油的液体燃料,市场潜力十分巨大. 目前工业化生产酒精的发酵温度一般在30~33 左右,在这种温度下发酵需要大量的冷却水.若能使发酵在高温下进行,不但可以减少冷却水的用量,节约生产成本,而且可以从根本上解决糖化与发酵不同步的问题,缩短发酵周期,提高发酵效率[1] .同时高温发酵能有效的抑制杂菌生长,减少醪液受污染的机会.但过高的温度会引起酵母细胞内脂肪酸、磷脂等成分的变化,甚至会导致蛋白质变性,这样一来就会影响细胞正常的生理活动,表现出高温对酵母细胞的毒性[2].因此,对于耐高温酒精酵母菌的选育问题一直是酒精酵母研究者的重要研究方向之一. 针对这一问题,本文拟从自然界中分离出有较强温度耐受性的酵母菌,并初步研究其发酵及相关性能,为下一步的选育工作打下基础. 1 材料与方法 1.1 培养基 酵母培养基:葡萄糖50g,酵母膏8.5g,NH 4Cl 1.0g,MgSO 4 7H 2O 0.6g ,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调pH =4.5,115 灭菌20m in.固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂. 发酵培养基:葡萄糖150g ,酵母膏5g,蛋白胨5g,NH 4Cl 1.0g,M gSO 4 7H 2O 0.6g,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调节pH= 4.5,115 灭菌20min. T TC 上层培养基[3] :葡萄糖0.5g,琼脂1.5g,加水至100mL,115 灭菌20min,待冷却至55 左右时,加入TTC(2,3,5!氯化三苯基四氮唑)0.05g. 第20卷 第3期 广西工学院学报 Vol 20 No 3 2009年9月 JO U RNAL OF G UA NG XI U N IV ERSIT Y OF T ECHN OL OGY Sep 2009
酵母菌的死活细胞鉴定
酵母菌的死活细胞鉴别与镜检计数 一、实验目的 1.掌握鉴别酵母菌细胞死活的染色方法。 2.了解血球计数板的构造，掌握利用它进行酵母菌计数的方法。 二、实验步骤 1.酵母菌血球计数板镜检计数 1)取一块盖玻片，加盖在血球计数板中央计数室上方。 2)用滴管吸取菌悬液滴于盖玻片的边缘，通过毛细作用渗入计数室，注意不能有 气泡产生，然后放置于载物台，静止5min，使细胞全部沉降到其表面。 3)高倍镜镜检，数对角线上5个中方格中细胞的总数，再计算出菌悬液浓度。为 了减少误差，应注意对样品适当稀释，以每个小方格中平均4~6个细胞为佳； 另外，也可对同一样品重复计数，取其平均值。 附:计数板的结构及测定原理 利用血球技术板镜检技术是一种常用的计数方法。血球计数板是一块比普通载玻片厚的特质玻片，其上有四条凹槽，构成三个平台，中间比较宽，其中央又被一短横槽隔成两半，每半边各有一个计数区，其上有9个大方格，只有中央的一个大方格为计数室供计数用。这一大方格的长宽各为1mm。加盖盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的距离为0.1mm，因此计数室的容积为0.1mm3。 目前血球计数板常用的是25格×16格型，其计数室被分成25个中格，其中每个中格又分为16个小格，故计数室共有400 小格。 计数时，首先把适当浓度的菌悬液注入计数室，然后在显微镜下计数，一般数对角线上5个中方格（共80个小方格）中细胞总数再根据下式求得菌悬液的浓度 细胞个数=5000A×B 式中A---5个中方格中细胞总数 B---菌悬液的稀释倍数 三、实验结果
个数:30 37 11 25 21 24 17 27 28 25
酵母的筛选 (1)
．葡萄果表酵母的分离: 葡萄的采集：葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此在采收葡萄时，将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。2. 菌种分离步骤：将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。随机选取并称量约10g成熟葡萄，放入盛有90ml 无菌水的三角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养30min后静置，制成菌悬液，吸取50μl 放入YEPD固体培养基，三个重复，以无菌刮铲刮匀，25℃培养24～48h。观察菌落的大小及生长状况。然后将静置后的菌悬液进行梯度稀释（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L 的氯霉素。观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。 自然发酵过程中酵母菌的分离: 将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。称量约100g 新鲜成熟度好的各品种葡萄，手工破碎，放入无菌的500ml 三角瓶，接着分别按30ug/ml添加链霉素，置于28℃培养，每隔24h 取发酵液1ml，加入9 ml无菌水中，然后进行梯度稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取样时期分别为：I，葡萄浆果破碎压榨后（添加SO2）；II，发酵旺盛期，葡萄汁含糖量下降20%时；III，发酵后期，葡萄汁含糖量下降70%时；IV，发酵结束前，残糖10%以下时。取0.1ml 稀释后各菌液放入固体培养基，涂布均匀（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，28℃条件下使其自然发酵24～48h，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。观察每一个菌落，编号并作详细描述。如：菌落颜色、表面结构、边缘、颜色等，进行分析和初步的归类。 酿酒酵母筛选及其鉴定一筛选 1 酿酒酵母的无性繁殖方式筛选对液体培养基培养48h的酵母菌株，在16×40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株。 2 WL琼脂培养基筛选酿酒酵母WL琼脂培养基(%质量分数)：酵母浸粉0.5，胰蛋白胨0.5，葡萄糖5，琼脂2，磷酸二氢钾0.055，氯化钾0.0425，氯化钙0.0125，氯化铁0.00025，硫酸镁0.0125，硫酸锰0.00025，溴甲酚绿0.0022，pH 6.5，121℃灭菌20 min；将分离出来的酵母菌株，接种液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基，27℃培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色（浅黄色）至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株。 3 赖氨酸培养基筛选赖氨酸培养基成分（L-1）：D-葡萄糖10g，L-组氨酸1mg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg，对－氨基苯甲酸200μg，生物素20μg，叶酸2μg，肌醇10mg，烟酸400μg，泛酸2mg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素200μg，盐酸硫胺素400μg，硼酸500μg，结晶氯化铜40μg，碘化钾100μg，结晶氯化铁200μg，结晶硫酸锰400μg，结晶钼酸钠200μg，结晶硫酸锌400μg，磷酸二氢钾850mg，磷酸氢二钾150mg，结
酵母菌死活鉴定和显微镜检测
实验二酵母菌的死活鉴定和显微镜计数 一、实验目的 学习血球计数板使用的原理与方法，学习区别死活酵母的方法。 二、原理 测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微直接计数和平板计数法。 镜检计数法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，菌体较大的酵母或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌采用彼得罗夫?霍泽细菌计数板，两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察，而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。 血球计数板的构造 血球计数板是一块特制厚玻片。玻片上由四道槽构成三个平台，中间的平台分成两半，其上各刻一个相同而有一定面积的小方格网。方格的刻度有两种规格。一种是25×16，称为希里格式血球计数板，分为25大格，每大格又分为16小格；另一种是16×25，称为麦氏血球计数板，分16大格，每大格分为25小格。总数都是400小格（如图所示）。 每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3，使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每毫升（或每克样品）中微生物细菌的数量。
三、实验材料 1、菌种：酵母菌 2、仪器：显微镜、血球计数板 3、材料：盖玻片、吸水纸、滴管 4、染料：美蓝染液 四、实验步骤和内容 1、视待测菌液浓度，加无菌水做适当稀释，以每小格菌数5-10个为宜，准确计算稀释 倍数。 2、取清洁干燥的血球计数板，加盖玻片盖住网格和两边的槽。 3、将待测菌液充分摇匀后，用无菌吸管吸少许，由盖玻片边缘或槽内加入计数板来回推压盖玻片，使其紧贴在计数板上，计数室内不能有气泡。静置5-10分钟。 4、在低倍镜下找到小方格网后更换高倍镜观察计数，上下调动细螺旋，以便看到小室内不同深度的菌体。位于分格线上的菌体，只数两条边上的，其余两边不计数。如数上线就不数下线，数左边线就不数右边线。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因为观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。凡酵母菌芽体达到母细胞一半时，即可作为两个菌体计算。 5、计数时若使用刻度为25×16（大格）的计数板，则数四角的4个大格（即100小格）内的菌数。如用刻度为16×25（大格）的计数板，除数四角的4个大格外，还需数中央1个大格的菌数（即80小格）。 6、每个样品重复计数2-3次，取其平均值，按下式计算样品中的菌数。 刻度为25×16（大格）的计数板：
酵母发酵酒精的研究进展
酵母发酵酒精的研究进展 （生命科学与技术学院微生物专业） 前言 人类利用酵母菌的历史已有几千年了。值得提出来的是，早在我国宋代的酿酒著作中，中国人已经明确记载了从发酵旺盛的酿酒缸内液体表面撇取酵母菌（当然不是纯粹的酵母菌）的方法，并把它们称为“酵”，风干以后制成的“干酵”可以长期保存。这种制造干酵母的原始方法说明，早在800年前，中国人已经意识到酒精发酵是由“酵”，即某种能生长的物质引起的。这种推断直到19世纪巴斯德才证明是酵母菌。明代末年出版的词书中记载有“以酒母起面曰发酵”，“发酵，浮起者是也”等解释。这说明至少在那时，一引起细心观察自然现象和注意比较的学者，已经认识到发面和酿酒有某种相同的因素在起作用。当时在欧洲虽然已经发现了酵母菌，但在200年后才知道酵母菌的作用。今天我们把这类微生物称酵母菌，正是以此为根据的。 酵母菌能够把糖变成酒精，是因为它的细胞里有催化剂，这些存在于生物细胞的催化剂在科学上叫做酶。虽然现在知道所有的生物都是靠酶催化的化学反应来生活的，但最早发现的酶，就是酵母菌的酶。酵母菌中最早发现的酶，是把糖变成酒精的一群酶，当时自然数酒化酶。由于这种酶的作用，使糖分解成酒精和二氧化碳，这就是利用酵母菌酿酒和发面包的原理。使面团产生许多空隙的就是二氧化碳。酵母细胞大小为2.5-10μm×4.5-21μm, 在加盖的玉米琼脂上不产生假菌丝或有不典型的假菌丝, 营养细胞可直接变为子囊, 每囊有1-4个圆形光面的子囊孢子, 在麦芽汁25℃培养3d, 细胞为圆形、卵形、椭圆形和香肠形。其菌落在麦芽汁琼脂上为乳白色, 有光泽, 平坦, 边缘整齐。菌体维生素、蛋白质含量高, 既可食用又可提取细胞色素C、核酸、麦角固醇、谷胱甘肽、凝血质、辅酶A、三磷酸腺苷等。该菌种能发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖及蔗糖, 但不能发酵乳糖和蜜二糖, 不同化硝酸盐。 酵母菌的繁殖方式既可进行无性繁殖，如芽殖，又可进行有性生殖；酵母菌既可进行有氧呼吸，又可进行无氧呼吸，是一种兼性厌氧呼吸的真核微生物。单细胞真核生物酿酒酵母基因组为12,068kb，比单细胞的原核生物和古细菌大一个数量级。酿酒酵母基因组共有5887个ORF，这比原核生物和古细菌要多很多。酿酒酵母的基因密度为1个基因/2kb，密度小于原核生物流感嗜血杆菌和尿殖道支原体等。酿酒酵母是最小的真核基因组，裂殖酵母其次，其密度是1/2.3kb，简单多细胞生物线虫的基因密度为1/30kb。第二、酿酒酵母只有4%的编码基因有内含子，而裂殖酵母则有40%编码基因有内含子。 1、酵母的生长条件 1.1 无机盐
酒精酵母
一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种 四川理工学院 设计（论文）题目：一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种 1．毕业设计（论文）的主要内容及基本要求 [1]大曲中分离及纯化酵母菌。 [2]紫外线诱变，氯化锂诱变和紫外线与氯化锂复合诱变。 [3]分别对诱变菌的发酵性能和产气情况的测定。 2．指定查阅的主要参考文献及说明 [1]《酿造酒工艺学》（第二版）中国轻工业出版社顾国贤主编 [2]《微生物学》（第二版）高等教育出版社周德庆主编 [3]《微生物学实验指导》高等教育出版社黄秀梨主编 [4]《现代微生物遗传学》化学工业出版社陈三凤刘德虎编著 3．进度安排 设计（论文）各阶段名称起止日期 1 文献检索：收集资料、撰写开题报告2009.03.23--2009.03.29 2 文献、资料查阅整理，撰写文献综述2009.03.30--2009.04.05 3 拟订实验方案，提出实验条件及需求2009.04.06--2009.04.11 4 实验仪器及药品的准备2009.04.11--2009.05.12 5 实验实施，现象观察并做好数据记录2009.04.13--2009.05.20 6 分析实验结果，整理数据2009.05.21--2009.05.28 7 撰写论文、修改论文2009.05.29--2009.06.10 8 论文定稿、打印、准备及答辩2009.06.10--2009.06.17 注：本表在学生接受任务时下达 一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种
本文主要介绍了耐酒精酵母的诱变育种，通过诱变得到高发酵力和高耐酒精性能的酵母菌。本实验拟从大曲中分离及纯化得到具有发酵产酒精能力的酵母菌种,并以该菌作为出发菌株,首先分别通过紫外光诱变，氯化锂诱变和紫外光与氯化锂复合诱变，然后分别测试诱变后的酵母菌株的酒精发酵及耐酒精性能，从而筛选得到高发酵能力及高耐酒精度的酵母菌株。 关键词：酵母菌；耐酒精；紫外线；氯化锂；复合诱变 目录 摘要 .................................................... ..错误!未定义书签。ABSTRCT............. .........................................错误!未定义书签。目录 (Ⅲ) 前言 ...................................................... 错误!未定义书签。第一章实验仪器与材料........................................ 错误!未定义书签。 1.1 仪器与设备............................................. 错误!未定义书签。 1.2 材料与试剂............................................. 错误!未定义书签。 1.3 实验试剂的配制 (4) 1.4 培养基的配制 (5) 第二章实验内容与方案 (6) 2.1 大曲中酿酒酵母的分离 (6) 2.2 出发菌株的能力测定 (7) 2.3 紫外线诱变酵母菌 (8) 2.4 氯化锂诱变酵母菌 (10) 2.5 紫外线-氯化锂复合诱变酵母菌 (13) 第三章实验结果与讨论........................................ 错误!未定义书签。 3.1实验结果............................................... 错误!未定义书签。 3.2 实验讨论 (35) 第四章结论 (39) 第五章综述 (41) 参考文献 (44) 致谢 (46) 附录 (47)
酵母菌分类方法研究张金龙
酵母菌分类方法研究 学生姓名：张金龙 系别：农学系 专业班级：生物技术2班 学号： 0701024228 指导老师：卢显芝 2010年6月
摘要：酵母菌是一个复杂的类群,其分类系统经数代酵母菌分类学家的努力正日趋完善,分类学方法也随着科学技术的进步而不断深化, 尤其是近年来发展起来的分子分类学方法给整个生物系统学和进化研究方法注入了活力,也使酵母菌的系统发育研究更接近于生物起源的本质。 关键词：酵母菌分类方法化学分子生物学技术 酵母菌是一类单细胞的真核微生物的通俗名称，并非是系统分类单元。酵母菌属于真菌，是具有核膜与核仁分化的较高等的微生物，细胞内有线粒体等较复已杂的细胞结构。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子（子囊孢子和担孢子）的能力，可将酵母菌分成3类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌。在真菌分类系统中分别属于子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类。[1]与其他微生物相比，尤其是细菌和丝状真菌，酵母菌的种数很少，但是其分布范围却很广泛。酵母菌大多数为腐生，生活在含糖量较高和偏酸性的环境中，如水果、蔬菜、花蜜及植物叶子上，尤其是果园、葡萄园和菜园的土壤中较多。 由于酵母菌拥有丰富的酶系统和蛋白质，对高糖环境、高碳环境、高渗透压环境等具有较强适应性，可以为其他生物体提供营养物质，可以代谢重金属或者降解某些难降解的物质，维持生态环境的稳定。[2]因此分类研究作为其他各方面研究的基础，研究手段不断改进，分类系统不断更新。 其中大致有三种分类方法：传统分类方法、化学分类方法、分子生物学分类方法。 1 传统分类方法 传统分类学方法是酵母菌分类学方法的基础 ,包括形态学特征和生理生化特征。形态学特征包括宏观特征(菌落特征)、微观特征(细胞形态、无性繁殖方式、有性生殖方式、孢子类型、假菌丝的形成)等；生理生化特征包括对糖发酵和碳、氮源化合物同化的能力 ,对外源维生素的依赖性和不同温度下的生长能力等生理学特性。经典分类学方法在酵母菌分类学中占有重要地位 ,当前权威的酵母鉴定系统就是在此基础上建立并发展起来的。 然而,它存在的局限性也是不容忽视的。酵母菌形态学特征可能随着培养基的改变而发生变化,因此必须采用标准化方法;有些种类或结构不同的碳水化合物具有相同的代谢途径 ,它们所反映的遗传基础是有限的;有些双糖、寡糖和多糖代
酵母菌的分离筛选方法
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 1.1葡萄糖50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L KH2PO4 2.5g/L Na2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加 拉红 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用） ★1.2乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用 蔗糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱 布过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培 养用）（富集用） ★1.3麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素0.1g/L PH6.0-6.4 121℃ 20min （分离保存用）灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★1.4虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5.0g/L 葡萄糖10g/L KH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉红0.033g/L 氯霉素0.1g/L 琼 脂15g/L PH自然
（分离纯化用） ★1.5 豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g 黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 1.6察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾0.5g/L 硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁0.01g/L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。
小议高产酒精酵母菌的紫外线诱变选育
聂世现，王钰，黄文静，季必霞 0 引言 石油是世界经济与发展的基本能源之一，其储备有限。20世纪70年代世界范围发生石油危机，使利用可再生的资源（如高淀粉作物）发酵生产酒精作为生物能源的研究成为人们关注的焦点。生物能源与石油相比具有可再生、污染小、减少温室效应等优点，能部分或全部代替汽油。目前，燃料酒精的生产占世界酒精总产量的66%，并且还有进一步增加的趋势。发酵法是酒精生产的重要方法，发酵法生产酒精的关键是酵母菌株，酒精酵母的优劣不仅直接影响发酵率的高低，而且会影响酒精的产量和质量。我国酒精生产行业中普遍存在亟待解决的问题是发酵强度低,生产成本高,能耗大。因此，高产酒精酵母的选育是提高酒精产率，节约生产能源的关键。 为了开展非粮作物甘薯等转化酒精的研究，本论文探讨了酵母菌A4原生质体制备和再生的适宜条件，并用紫外线作诱变剂，对酵母菌原生质体进行诱变处理，旨在筛选出发酵力强、酒精产量高的优良酵母菌株，为下一步以高产淀粉品种甘薯为原材料生产酒精的研究工作奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 酵母菌（A4）为本实验室保藏菌种。 1.1.2 培养基 麦芽汁液体培养基：将麦芽汁（购于合肥市华润雪花啤酒厂）糖度调至12°Brix，过滤后121℃灭菌20min。 YPD培养基(g/L)： 液体培养基：酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20。 固体培养基：在YPD液体培养基中加入琼脂20，NaOH0.1。 原生质体再生培养基：在YPD固体培养基中分别添加KCl至0.7mol/L，山梨醇至0.8mol/L，甘露醇至0.8mol/L，17%的蔗糖。 以上培养基于115℃灭菌20min。 TTC上层培养基(g/L)：TTC（三苯基四氮唑盐酸盐）0.5，葡萄糖5，琼脂15。 TTC下层培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨2，酵母膏1.5，K2HPO41，MgSO4·7H2O4，琼脂20，pH5.5。 1.1.3 试剂 缓冲液：pH6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液。 预处理剂：0.1%β-巯基乙醇，其中含0.1mol/L的EDTA-Na2。 稳渗剂：KC1高渗缓冲液：缓冲液中添加KC1至0.7mol/L；山梨醇高渗缓冲液：缓冲液中添加山梨醇至0.8mol/L；甘露醇高渗缓冲液：缓冲液中添加甘露醇至0.8mol/L；蔗糖高渗缓冲液：缓冲液中加入17%的蔗糖。 酶液：分别将1%，1.5%，2%，2.5%的蜗牛酶和0.4%蜗牛酶+0.4%纤维素酶溶于高渗缓冲液中，微孔滤膜过滤除菌，制备成不同浓度的酶液。酶购于上海生工。 1.2 方法 1.2.1 出发菌株的原生质体制备与再生 1.2.1.1 出发菌株生长曲线的测定 挑取斜面菌株1～2环接种于50mLYPD液体培养基中，28℃，200r/min摇床培养24h后分别以1:100的量接种于装有10mLYPD液体培养基的大试管中，28℃，200r/min摇床培养，每隔2h取出一支试管，测定其OD600值，绘制其生长曲线。 1.2.1.2 出发菌株原生质体制备与再生 将活化好的菌种接种于盛有50mLYPD液体培养基的锥形瓶中，28℃，200r/min摇床培养，当其进入对数生长期时，取5mL菌液3500r/min离心5min，用磷酸-柠檬酸缓冲液洗2次，无菌加入0.1%β-巯基乙醇，28℃