基因敲除MDA-MB-231细胞系,乳腺癌研发福音
MDA-MB-231细胞系是从一名51岁的白种女性转移性乳腺癌的胸腔积液建立的人乳腺细胞系。该上皮细胞系是医学研究实验室中使用最广泛的乳腺癌细胞系之一，特别是涉及CRISPR/Cas9基因敲除的那些。
由于缺乏ER和PR表达以及HER2扩增，该细胞系最初被归类为“基础”乳腺癌细胞系。然而，由于它表现出claudin-3和claudinin-4的下调，Ki-67增殖标记物的低表达，与上皮-间质转化有关的标记物的富集，因此现在被认为属于claudin-低分子亚型。以及与乳腺癌干细胞（CSC）相关的特征的表达，例如CD44 + CD24- /低表型。这就是为什么许多研究一直专注于基因编辑
MDA-MB-231细胞系的原因。
应用：
1. CRISPR / Cas9诱变使靶向MDA-MB-231细胞的推定癌症依赖性无效。癌细胞需要表达某些基因的表达，这些基因编码肿瘤生长所必需的蛋白质。沉默这些基因的表达或阻断蛋白质的活性可以触发细胞死亡和持久的肿瘤消退。因此，识别和表征癌症依赖性是临床前癌症研究的关键目标。MELK被认为是多种癌症类型的癌症依赖性和推定药物靶标，其中之一是MDA-MB-231细胞系。MELK在乳腺癌细胞中过表达，与患者预后不良有关。此外，据报道，使用RNAi 敲低MDA-MB-231细胞中的MELK可阻止癌细胞增殖并触发细胞周期停滞或有丝分裂灾难。
研究人员设计了针对MELK的七个指导RNA（gRNA），并将每个指导RNA 克隆到一个表达GFP的载体中，并将该指南转导到了三个表达Cas9细胞系中：三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231据报道会上瘾。MELK表达。对过表达的MDA-MB-231细胞中MELK蛋白水平的蛋白质印迹分析证实，CRISPR系统可有效消除MELK表达。
2.β1整合素对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖和细胞信号传导的不同影响
为了探索β1整合素的功能意义，研究人员通过基于CRISPR/Cas9的方法建立了β1-KOMDA-MB-231细胞。进行蛋白质的印迹和FACS分析以确认
MDA-MB-231细胞系中β1的有效敲除。令人惊讶地，β1的表达对细胞增殖表现出相反的作用。这些效应取决于细胞密度，当在稀疏条件下培养细胞时，它们显示出细胞增殖的上调，而在稠密条件下，则表明细胞生长的下调。与野生型细胞相比，KO MDA-MB-231细胞中ERK的磷酸化水平在稀疏培养条件下始终被抑制，而在致密培养条件下始终被上调。KO MDA-MB-231细胞中EGFR的磷酸化水平增加。相比之下，MDA-MB-231 KO细胞中AKT的磷酸化水平降低。在MDA-MB-231敲除细胞中，集落和肿瘤形成的能力均被显着抑制，这表明β1在肿瘤发生的细胞存活信号转导中起重要作用。在Res细胞中拯救了KO细胞
中的这些异常表型。综上所述，这些结果清楚地表明了β1在癌细胞中的独特作用：抑制细胞生长和促进细胞存活，这可能有所启发。
3.敲低BCL2L12导致MDA-MB-231乳腺癌细胞中的顺铂耐药
发现基因BCL2L12在正常乳腺组织中高表达，并且与乳腺癌患者的良好预后相关。研究人员报道，在MDA-MB-231乳腺癌细胞中，顺铂处理后，BCL2L12的mRNA水平及其转录变异体BCL2L12A可能被上调。BCL2L12和BCL2L12A 的组合大大抑制了顺铂诱导的细胞凋亡。相反，每种蛋白质的异位表达促进顺铂
诱导的细胞凋亡。这些结果表明，BCL2L12和BCL2L12A的表达降低或缺失可能有助于乳腺癌患者的顺铂耐药性。此外，我们发现顺铂诱导的β-catenin的下调在BCL2L12-和BCL2L12A敲除的MDA-MB-231细胞中被部分抑制，这表明这两种蛋白的敲低可能稳定顺铂诱导的细胞凋亡中的β-catenin。简而言之，我们提出BCL2L12和BCL2L12A可能在顺铂诱导的MDA-MB-231乳腺癌细胞凋亡中起重要作用。
基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成人糖基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产
生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生产生产生EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。
根据科研需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。
方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。
方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。
方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。
Reference:
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2 CHO ko cell line
CHO-敲除细胞系 简介： CHO细胞又称中国仓鼠卵巢细胞，是一种来源于中国仓鼠卵巢的上皮细胞系。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞以其独特的特性，已成为制备治疗性重组蛋白的主要工具。这种细胞系通常用于生物学和医学研究。同时，它也是最广泛使用的哺乳动物宿主在工业生产治疗蛋白方面。 应用程序： 基因打靶法构建基因敲除CHO细胞系 由于CHO细胞系是治疗性抗体产生的主要宿主，构建高效的CHO细胞系具有重要意义。在构建CHO细胞系中，常用的转染方法有两种，一种是随机整合法，另一种是基因靶向法。前者导致抗体产生率的变化，通常会影响转基因表达水平。 然而，在基因打靶方法中，外源基因被插入特定的染色体区域。这种方法是基于利用针对宿主细胞特定基因组区域的序列进行同源重组。研究人员利用CRISPR/Cas9系统作为基因靶向方法，通过引导RNA和Cas9诱导双链断裂，提高同源重组效率。因此，CRISPR/Cas9载体系统可以有效地将外源基因插入CHO细胞系中。 利用谷氨酰胺合成酶基因敲除细胞提高CHO细胞系的产生效率 尽管中国仓鼠卵巢（CHO）细胞以其独特的特性，已经成为制造治疗性重组蛋白的主要工具，但如何有效地鉴定这些稀有的CHO细胞系是CHO细胞系产生的主要挑战之一，在大量低产和低产无性系中的高产无性系。目前，有两种主要的CHO表达系统被广泛应用，基于二氢叶酸还原酶（DHFR）的甲氨蝶呤（MTX）选择和基于谷氨酰胺合成酶（GS）的甲硫氨酸硫氧胺（MSX）选择。 为了研究内源性GS表达对选择效率的潜在影响，采用锌指核酸酶（ZFN）技术，以内源性CHO-GS基因为靶点，构建了GS基因敲除CHOK1SV细胞株。双等位基因修饰CHO-GS基因的高效性（～2%）支持了ZFN技术的独特优势，特别是在CHO 细胞中。通过对所有GS基因敲除细胞系谷氨酰胺依赖性生长的观察，证实了GS 酶功能的破坏。 谷氨酰胺合成酶介导的CHO细胞单克隆抗体筛选
乳腺癌相关基因多态性研究
乳腺癌相关基因多态性研究 乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，伴随着生活方式等因素的变化，我国妇女乳腺癌发病率 出现明显上升趋势，每年中国乳腺癌新发病人数和死亡人数分别占全世界的12.2%和9.6%[1], 对女性健康构成严重威胁。乳腺癌是一种复杂疾病，其发生的本质是由于原癌基因的激活和 抑癌基因的失活，促使细胞的过度增殖和/或异常程序死亡，而这一过程的前提就是一系列基因损失所致基因突变。伴随人类基因组计划完成及基因组学的迅猛发展，人们对乳腺癌易感 基因有了更多的认识, 乳腺癌的发生发展与不同易感基因的异常活动密切相关[2]。因此，研 究和了解乳腺癌遗传规律并采取相应的干预措施，对降低乳腺癌的发病率具有重要意义。 对个体肿瘤易感性产生影响的基因主要有两大类[3]：其中一类为癌基因或抑癌基因，这类基因直接参与肿瘤形成；还有一类是肿瘤易感基因，可以导致癌基因或抑癌基因发生突变，或 作用于肿瘤相关的代谢通路而导致肿瘤发生。易感基因影响肿瘤易感性的主要形式就是单核 苷酸多态性。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）是指基因组水平上由单 个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP是遗传易感性的重要遗传学基础。 乳腺癌遗传生物学标志的两种表现形式有：（1）外显率较高的突变基因，比如 BRCA1/BRCA2的突变；（2）外显率较低的多态性基因，这些基因在人群中突变率超过1%， 是一些与散发性乳腺癌发病率关系密切的基因，这些基因的多态性可以改变蛋白质的表达水 平和功能，进一步产生相应的肿瘤易感性。抑癌基因与乳腺癌发生学关系的国内外研究较多，关于代谢酶基因、DNA损伤修复基因、细胞因子与乳腺癌患病风险之间的关系目前还有待进 行大量样本研究去填补空白。 1.代谢酶多态性与乳腺癌 细胞色素最初发现于昆虫翅膀的肌肉中，因它有颜色，所以叫细胞色素。目前已发现有多种 细胞色素，如a，as，b，b。，c，cl， p-450等。细胞色素氧化酶P450（CYP450）是一类超 家族基因编码的同工酶, 参与了内源性化合物和外源性化合物生物转化。比如它可以把无活性的前致癌物激活转变为亲电子化合物，使得亲电子化合物可以攻击细胞内的生物大分子，并 且与DNA或蛋白质形成加合物，最后导致癌基因和抑癌基因的改变，引发癌变。目前发现与乳腺癌易感性有关的CYP450有CYP1A1、CYP1B1、CYP17和CYP19等。 到目前为止，国内外发表关于代谢酶多态性与乳腺癌相关性的研究较少，有部分关于 CYP1A1与乳腺癌易感性的研究，但结论尚不能肯定两者相关性，需要增加不同种族和不同地域的对照研究。CYP1B1是目前CYP1B家族成员，作为一种肝外酶，CYP1B1广泛存在于肺、 乳腺、前列腺组织中。CYP1B1能够介导17-雌二醇的C4羟化， 4-羟化雌激素作为致癌物在 动物实验中已经被证实。鉴于雌激素与乳腺癌发生之间紧密联系，研究雌激素的合成与代谢 过程中基因多态性与乳腺癌之间的关系就显得十分有意义。CYP17是参与雌激素合成代谢的 关键酶，CYP19编码芳香化酶是催化雄激素转化为雌激素的限速酶，两者与乳腺癌发病易感 性的关系的研究正成为癌发生学中的研究热点。另外尚有已知与其他肿瘤易感性相关的CYPP450，包括CYP2D6、CYP2E1、CYP2119等基因多态性与乳腺癌易感性关系的研究仍需要 大量样本研究进行论证。 2.细胞因子多态性与乳腺癌 细胞因子是一种由多种活细胞产生的、能调解细胞分化增殖和诱导细胞发挥功能的小分子蛋 白质，同时它又是机体内细胞之间相互作用的重要介质，通过结合细胞表面相应受体发挥作用。目前已经发现200余种人类细胞因子，通常分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、 集落刺激因子、生长因子和趋化性细胞因子等多种类型。细胞因子基因中非转录区域的一些 单核苷酸多态性可能影响了一个细胞因子差异性的产生。 2.1白细胞介素类
乳腺癌细胞
形态生长方式类型培养条件 人乳腺癌细胞MCF7 上皮样贴壁生长常规该细胞是从一名69岁的白人女性 乳腺癌患者的胸腔积液中分离建立的。该细胞保留了多个分化乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成隆突结构( domes );该细胞表达WNT7B 癌基因；TNF- a可以抑制MCF-7细胞的生长；抗雌激素处理能调节细胞胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)的分泌。ER(+),PR(+),Her-2(-) 人乳腺癌细胞MDA-MB-231 上皮样贴壁生长三阴MDA-MB-231是从一名 51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-a受体和WNT7B癌基因。属于高转移性恶性乳腺癌细胞系，易成瘤，且常用 于肿瘤转移研究 人乳腺导管癌细胞MDA-MB-435S 上皮样贴壁生长三阴，转移性乳腺导管腺 癌MDA-MB-435S 是一种纺锤形的细胞，1976年由其亲本(MDA-MB-435)中筛选得到。MDA-MB-435是从一名31岁的转移性乳腺导管腺癌女性患者胸水中分离得到的。但近来证明MDA-MB-435细胞被M14黑色素瘤细胞污染。 人乳腺癌细胞MDA-MB-453 上皮样；多角形贴壁生长三阴，转移性乳腺癌 该细胞系由Cailleau R在1976年从一名48岁的患有转移性乳腺癌的白人女性的心包渗出液中分离建立的。该细胞表达FGF的受体。 人乳腺癌细胞MDA-MB-157 上皮样贴壁生长髓样癌该细胞源自一位患有 乳腺髓样癌的44岁黑人女性，表达WNT7B癌基因，细胞与细胞边界处有细胞桥粒、微绒毛、张力细丝。 人乳腺癌细胞SK-BR-3 上皮样贴壁生长这株细胞是1970年由Trempe G和 Old LJ从一位43岁的白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离得到的。该细胞亚显微结构特征包括微丝和桥粒、肝糖原颗粒、大溶酶体、成束的细胞质纤丝；过表达 ______________ HER2/c-erb-2 基因产物。 人乳腺导管癌细胞ZR-75-1 上皮样贴壁生长该细胞产生高水平的黏液素 MUC-1 mRNA，低水平的MUC-2 mRNA，但不表达MUC-3基因；表达雌激素受体。 人乳腺导管癌细胞HCC38 上皮样贴壁生长该细胞于1992年从一位50岁的白 人女性乳腺导管癌组织中分离建立，该患者曾有平滑肌肉瘤的病史，其母亲死于乳腺 癌；该细胞癌基因her2/neu- , p53+ ;上皮细胞特异性标志物EGP2 (上皮糖蛋白2) 和CK19
乳腺癌相关基因表达与其发生发展预后及治疗的相关性研究
乳腺癌相关基因表达与其发生发展预后及治疗的相关性研究 发表时间：2016-05-10T11:40:30.343Z 来源：《心理医生》2015年15期供稿作者：夏月平黄雅琴 [导读] 河北大学医学部临床医学院同源异型盒基因是一类在进化中高度保守的DNA序列，共同点是具有183个核苷酸长度的同源区。 夏月平黄雅琴 （河北大学医学部临床医学院河北保定 071000） 【摘要】乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，通常发生在乳房腺上皮组织。近年来女性乳腺癌发病率和死亡率呈上升趋势，跟据资料统计，其发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%，在妇女仅次于子宫癌，它的发病常与遗传有关，以及40—60岁之间，绝经期前后的妇女发病率较高。是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。2020年预计中国乳腺癌新发病例将达210000例，共增加44000例乳腺癌患者。研究相关基因与乳腺癌之间的关系，有利于乳腺癌的诊断，治疗与相关研究工作的进一步进行。 【关键词】乳腺癌；基因；HB基因；FOXO3a基因；PTEN；治疗 【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）15-0106-02 1.同源异型盒基因（homeobox gene,HB基因） 同源异型盒基因是一类在进化中高度保守的DNA序列，共同点是具有183个核苷酸长度的同源区，自身编码由61个氨基酸组成的同源蛋白域，即同源异型域（homeodomain,HD）本基因存在于酵母乃至人类几乎所有真核细胞中，占脊椎动物整个基因组数量的0.1%～ 0.2%①。其中，I类同源异型盒基因（HOX基因）在正常乳腺及癌变的乳腺组织中的表达水平存在一定差异。HOX基因还可以与公认的抑癌基因P53发生交互作用从而诱发乳腺癌。②但具体机制仍有待进一步研究。 2.FOXO3a基因 FOXO3a基因与细胞的增殖分化，肿瘤的发生发展及血管生成等有重要关系③，其表达水平增高可促进肿瘤细胞的凋亡，具有抑制肿瘤细胞增殖的能力④。从目前的研究证实，本基因的表达水平异常与乳腺癌的发生有紧密联系。根据Sunters等⑤及Habashy等⑥的研究表明，FOXO3a可介导Bim和Kipl的表达以及CDK等细胞周期抑制因子的表达，从而抑制乳腺肿瘤的发生和发展。 3.PTEN（phophatase and tensin homolog deleted on chromosome 10） PTEN是至今发现的第一种具有磷酸酶活性的抑癌基因，对乳腺癌的发生发展转移预后等起着关键性作用。从目前研究表明，PTEN变异导致乳腺过度发育并较早发生肿瘤，而野生型PTEN可通过下调PI3K水平来抑制乳腺癌细胞的生长、引起细胞死亡⑦。在林晓燕等⑧的实验研究中，将野生型PTEN通过脂质介导法转染人乳腺癌多药耐药MCF-7/ADR细胞，来观察细胞对阿霉素的敏感性和耐药倍数，结果显示，野生型PTEN通过下调Bcl-2,活化Caspase-3,从而诱导细胞凋亡，使得转染组的细胞凋亡率高于对照组十余倍，而对阿霉素的耐药倍数则显著降低。 4.小干扰RNA(small in terfering RNA,siRNA) 人端粒酶逆转录酶（human telom erase reverse transcriptase,h TERT）是端粒酶催化亚基，在正常组织中基本不表达，而在多数的肿瘤细胞中存在高表达现象。在刘安定等⑨的实验研究中，体外化学合成的针对h TERT基因的siRNA 序列，转染乳腺癌MCF-7细胞，结果表明，siRNA 可有效抑制h TERE基因的信使RNA和蛋白质的表达，促进乳腺癌MCF-7细胞的凋亡。 【参考文献】 [1]Cillo C,Faiella A,Cantile M. et al.Homeobox genes and canser.Exp Cell Res,1999,281(1):1-9. [2]Raman V.Martensen SA,Reisman D,et https://www.wendangku.net/doc/4613894710.html,promised HOX-A5 function can limit p53 expression in human breast tumors.Nature,2000,405(6789):974-978. [3]Potente M,Urbich C,Sasaki K ,et al.Involvement of FOXO Transcription factors in angiogensis and postnatal neovascularization [J].J Clin Invest ,2005,115(9):2382-2392. [4]Gree EL,Brunet A.FOXO transcription factors at the interface between longevity and tumor supression [J].Oncogene,2005,24(50):7410-7425. [5]Sunters A ,Madureiran PA ,Pomeranz KM ,et al.Paclitaxel induced nuclear translocation of FOXO3a in breast cancer cell is mediated by c-Jun NH2-terminal kinase and Akt [J].Cancer Res,2006,66(1):212-220. [6]Habshy HO ,Rakha EA,Aleskandarany M,ET AL.FOXO3a nuclear localisation is associated with good prognosis in luminal-like breast cancer[J]. Breast Cancer Treat,2011,129(1):11-21. [7]Weng L P,Smith W M,Patricia L,et al.PTEN suppresses breast cancer cell growth by phosphatase activity-dependent GI arrest followed by cell death[J].Cancer Reaserch,1999,59(15):5808-5814. [8]林晓燕，王强修，宋伟等.PTEN对乳腺癌多药耐药MCF-7/ADR细胞凋亡的促进作用及机制[J/CD]。山东医药，电子版，2009,49-38 [9]刘安定，董学君，杨明锋等.SRNA沉默h TERT基因表达对人类细胞增殖和凋亡的影响[J/CD].中华乳腺病杂志：电子版，2008,2（5） 538-546
乳腺癌细胞培养
MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶（25ml培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞
细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称 MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性 MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体和WNT7B癌基因 培养基 L15: Leibovitz Medium 血清 10%FBS 细胞传代方法 1:2~1:4传代；每周2~3次 细胞传代情况 C5 细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基 +5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件：37℃ 5% CO2 消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA溶液，消化5-10min 传代的比例：1：2~1：4 换液时间：2~3天换液一次 冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO
关于基因敲除U251细胞系的应用
关于基因敲除U251细胞系的应用 U251细胞系是通过外植技术从恶性胶质母细胞肿瘤中衍生而来的，U251细胞系通常用作胶质母细胞瘤研究的实验模型。U-251 MG细胞系人类已用于研究Pax6（配对盒蛋白）相关的Dkk3（Dickkopf 3）表达增加的机制，通过CRISPR/Cas9敲除PAX6的U251细胞系是常用的工具分子研究PAX6在减轻胶质母细胞肿瘤进程中的作用。而且，U251细胞系可用于从U-251人胶质母细胞瘤细胞系中提取癌干细胞，这使其在基因编辑领域成为受欢迎的细胞系。此外，它经常用于研究胶质母细胞瘤模型中JARID1B（富含Jumanji AT的交互式区域1B）在神经胶质瘤的发病机理中的作用以及艾力诺弗C联合替莫唑胺的治疗效果。因此U251细胞是用于基因敲除，稳转细胞株等的合适细胞。 应用： 发现PAX6-敲除的U251细胞系具有增强的增殖和集落形成能力 转录因子PAX6在包括U251细胞系在内的各种癌细胞系中表达。在间变性星形细胞胶质瘤中，PAX6表达与肿瘤级别成反比，从而导致胶质母细胞瘤（最高级别的星形细胞胶质瘤）中PAX6表达低。 U251细胞系通常用作胶质母细胞瘤研究的实验模型。因此，一些科学家开发了PAX6基因敲除的U251细胞系，作为分子研究工具来研究PAX6在减轻胶质母细胞肿瘤进程中的作用。
CRISPR-Cas9技术用于敲除U251 N胶质母细胞瘤细胞中的PAX6。指导RNA 被设计成在相对于转录起始位点（TSS）在+25至+58位之间的PAX6基因5'端附近产生突变。强力霉素诱导的EGFP-PAX6表达载体的病毒转导用于在PAX6基因敲除的U251细胞中重新引入（拯救）PAX6表达。通过分析形态，增殖，集落形成能力以及对氧化应激和化学治疗剂的反应，对敲除的U251细胞进行了严格表征。结果表明，与WT细胞相比，敲除的U251细胞具有增强的增殖和集落形成能力，这与临床观察结果一致，表明PAX6可以起到抑癌作用。对于PAX6敲除的U251细胞，与PAX6对照细胞相比，处于G2/M期的细胞百分比增加，表明PAX6使U251 N细胞保持在细胞周期的G1期。有趣的是，与野生型细胞相比，PAX6敲除的U251细胞对H2O2诱导的氧化应激更具适应性。产生的U251 N PAX6-敲除细胞系可以用作研究PAX6的分子功能和机制的工具，该PAX6作为肿瘤抑制因子，涉及肿瘤的进展和胶质母细胞瘤的治疗。AEG-1敲除U251细胞的构建和U251细胞中过表达的AEG-1基因显示出降低的细胞迁移能力 星形胶质细胞升高基因-1（AEG-1）在多种癌症中均过表达，并且在癌症的发生和发展中起着重要作用。研究人员通过CRISPR/Cas9技术构建了AEG-1基因敲除的U251细胞系，以探索AEG-1对U251细胞转移的影响。第一步是合成针对AEG-1的设计sgRNA，然后将sgRNA克隆到pX459质粒中以获得AEG-1-pX459重组载体。将重组载体转染人脑胶质瘤U251细胞，通过TA克隆测序鉴定sgRNA的活性。然后，用嘌呤霉素筛选转移了重组载体的U251细胞，得到AEG-1敲除的U251细胞系。蛋白质印迹法用于检测基因敲除的效率。
【CN109694853A】一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910151712.6 (22)申请日 2019.02.28 (71)申请人 贵州省人民医院 地址 550002 贵州省贵阳市南明区中山东 路83号 (72)发明人 侯净 倪青 魏娜 贾琦 刘欣 胡诗航 (74)专利代理机构 北京栈桥知识产权代理事务 所(普通合伙) 11670 代理人 潘卫锋 (51)Int.Cl. C12N 5/09(2010.01) C12N 15/85(2006.01) (54)发明名称 一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构 建方法 (57)摘要 本发明公开了一种HER2基因过表达的乳腺 癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：S1：对乳腺 癌细胞进行培养；S2：通过对乳腺癌细胞PCR扩 增，建立表达系统；S3：对乳腺癌细胞系进行构 建，S4：进行细胞观察和荧光强度对比。本发明通 过实时荧光定量PCR检测HER2基因在mRNA中的表 达情况，以证明细胞系构建成功。本发明构建的 乳腺癌细胞系可以稳定表达HER2基因，具有整合 效率高，假阳性率低等优点，为进一步研究HER2 基因乳腺癌发生、发展、治疗及后续耐药过程中 提供基本且有力的研究工具。权利要求书2页 说明书7页CN 109694853 A 2019.04.30 C N 109694853 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109694853 A 1.一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： S1：将新鲜的乳腺癌细胞在含有10％FBS的液体培养基中，在温度为30-35℃条件下培养1-2h,然后用FBS充分洗涤后，置于转动频率为50-80r/min、温度为20℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，对培养后的细胞通过灭菌处理，再100目过滤，进行转接培养3-5次，再在水浴温度为30℃、通气量为5-10m3/h的条件下震荡处理2-4h，得到乳腺癌细胞； S2：提取乳腺癌细胞的总mRNA，将总mRNA进行稀释后放入到反应离心管，在温度为60-75℃的条件下，加入反转录缓冲液，然后温度按照1.5℃/min的降温速率下降至20-30℃，向其加入反转录酶、DNA聚合酶，期间不断用磁力棒搅拌处理，处理30-45min，得到cDNA，再对得到的cDNA通过上下引物分别进行PCR扩增，通过切酶SnaBI剪切，进行琼脂凝胶电泳，通过pBS-T Mini Kit中片段连接的方法，分别克隆到pBS-T载体中，通过电泳结果筛选及其琼脂糖凝胶电泳，获得质粒； S3：所述质粒作为模板，pGenesil-1载体，构建出相应的pGenesil-ETV1A、pGenesil-ETV1B、pGenesil-ETV1C、pGenesil-NC重组siRNA表达载体；在200μlPCR管中配制如下连接体系：pGenesil-1/HindⅢ/BamHⅠ载体大片段1μl；双链片段DNA5ul；T4DNAligase1ul；10×T4DNAligasebuffer1ul；ddH2O2μl。以上体系配制好后放入金属浴，16℃反应4小时，将连接产物全部加入到100μlDH5α感受态中，冰浴15min，加入500μlLB液体培养基，在温度为30℃，70rpm条件下，振荡培养1h，然后在35℃热激90s后立即冰浴100s，取150μl培养物涂布于LB/ Kan平板上37℃倒置培养10小时； S4：对培养后培养物进行转染Marc-145细胞，通过消化，振荡过滤将Marc-145细胞重选，调节细胞悬浮液密度，培养3-6h，然后将培养后的Marc-145细胞放入到四孔板中培养，待细胞密度为60-70％时，向四孔中分别加入转染试剂离心搅拌，观察细胞病变，培养4代后，加入含有乳腺癌细胞的新鲜培养基培养3-5h，洗涤，观察细胞状态及荧光强度。 2.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中液体培养液为硝酸铵15-20g/L、黄豆粉3-7g/L、磷酸氢二钾0.03-1g/L。 3.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中液体培养液为黄豆粉3-7g/L、磷酸氢二钾0.03-1g/L、硝酸铵15-20g。 4.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR反应体系及反应条件：通过无菌超纯水稀释至10μM/L；取已经稀释好的两条互补的mRNA靶点序列片段各1.5μl，10×T4buffer1μl，加水至总体积20μl，放于200μl的PCR管中，RT产物8.7uL，4×PCR缓冲液3uL，15mM的氯化钾3uL，PCR引物溶液1.5uL，DNA聚合酶0.5uL混匀后加入到87孔样品板上进行PCR反应，反应条件：85℃，8min；90℃，25min，60℃，30秒钟，65℃，2min，循环30次；70℃1min；4℃直至收取PCR产物。 5.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中所得的质粒通过阳性克隆筛选，进行阳性克隆筛选时，先平均取得质粒，均匀涂布到含去去甲基金霉素培养基平板上，培养6h，然后抽提质粒，将培养物在温度为20-30℃的条件下，滤膜过滤，通过EcoRI进行单酶切鉴定，被EcoRI切开的可能是阳性克隆。 6.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中从-70℃中取出质粒细胞，冰上放置4min，待质粒细胞解冻后，加入9μL连接产物，轻柔混匀内容物，冰中放置10min；然后将之放到预加温到30℃的水浴锅中，静置70s；快 2
如何看懂乳腺癌常见免疫组化指标
如何看懂乳腺癌常见免疫组化指标 很多乳腺癌患者和家属都苦于看不懂乳腺癌常见的免疫组化指标而无法对医生的治疗进行判断，今天海南亚洲制药集团的小编就这个问题为您详细阐述。 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，它的发病常与遗传有关，以及40-60岁之间、绝经期前后的妇女发病率较高。仅约1-2%的乳腺患者是男性。通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤。是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。治疗乳腺癌主要有手术、化学药物治疗、放射治疗和现代中药治疗等手段，临床必须根据病期早晚，选择不同方法联合应用，选择合理时，比单一方法疗效好。近年来研究发现人参皂苷Rh2（最佳含量16.2%）抑制癌细胞增殖作用的能力最强，是人参皂苷中的最主要抗癌活性成分。人参皂苷Rh2通过抑制癌细胞增殖和诱导癌细胞分化凋亡对多种肿瘤有效，也为应用于乳腺癌治疗提供了新的武器。 乳腺癌为激素依赖性肿瘤，就是说乳腺癌细胞的生长依赖雌激素和孕激素的刺激，雌孕激素通过与乳腺癌细胞上相应受体结合发挥作用，免疫组化表现为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）阳性。PR的形成直接受ER的控制和调节，故PR阳性的乳腺癌，ER大多为阳性。但有些细胞在癌变过程中，其受体系统保留很少或完全丧失，不能再作为激素的靶细胞，其生长不再受激素的控制与调节，表现为ER阴性乳腺癌。 乳腺癌常见免疫组化指标：雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR） 临床上可以通过对雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的检测，得出肿瘤细胞内激素受体含量的水平，从而提示乳腺癌的预后信息和指导内分泌治疗。据报道高分化肿瘤或临床分期较低的肿瘤ER、PR更可能阳性；乳腺癌ER阳性率约为50%～80%,PR阳性率约为50%。ER及PR阳性肿瘤对内分泌治疗反应性高，有效率达55％～60％，受体阴性者有效率5％～8％。ER和(或)PR阳性患者较ER和(或)PR阴性患者有较好的预后。 乳腺癌常见免疫组化指标：雌激素调节蛋白PS2 雌激素调节蛋白PS2是由激素依赖细胞分泌的，可以通过自分泌和旁分泌起作用，是预测乳腺癌预后和内分泌治疗疗效的另一项重要指标。通常ER阳性乳腺癌细胞，PS2也呈现高水平表达。PS2在乳腺癌表达的阳性率在43%～58%之间。PS2与ER表达的正相关性，在绝经前的妇女(50岁以下)表现更为明显。PS2(+)ER(+)病例大约占83%，很少ER(-)和PR(-)，而PS2(+)(约4%)。作为乳腺癌抗雌激素治疗预测指标，PS2可能优于ER、PR，若三者结合则可达到满意的预测效果。 乳腺癌常见免疫组化指标：预后指标PS2 PS2作为预后指标，对无淋巴结转移者的意义尤为重要。No(无淋巴结转移)的乳腺癌患者，在采取单纯手术治疗的情况下,约20%～30%的患者会复发。有研究发现，PS2阳性与阴性两组在N0患者复发率相差31%,死亡率相差13%。因此PS2成为确定N0组患者属于危险组或非危险组的参考指标之一。PS2检测对淋巴结阳性(N+)患者也同样可分成危险组和非危险组,两组预后差别非常明显。乳腺癌ER(-)、PR(-)、PS2(-)的患者预后差,治疗失败率为83%,5年存活率仅为41%。 乳腺癌常见免疫组化指标：标记细胞增殖状态的抗原Ki67 Ki67是一种标记细胞增殖状态的抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中是不可少的，阳性说明癌细胞增殖活跃。Ki67的监测多用于判断肿瘤的良、恶性及恶性程度，也用于探讨细胞增殖活性、细胞周期与肿瘤的生长方式、浸润方式、复发、转移等生物学行为及预后的关系。 乳腺癌常见免疫组化指标：细胞周期蛋白(CyclinD1) 细胞周期是由细胞周期素(cyclin)、细胞周期素依赖蛋白激酶(CDK)和细胞周期素依赖蛋白激酶抑制蛋白(CKI)来进行调控的。不同时相(G1、S、G2、M)间存在关键的调控点。细胞周期蛋白(CyclinD1) 与特定的CDK结合构成复合体，可在G1/S 交界处将信号转导途径与细胞周期调控联系起来，完成各个时期的转换。其过度表达可缩短G1 期，并减少对生长因子的依赖
乳腺癌细胞培养
MCF-7是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10- 15%的小 牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25%的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶(25ml 培养瓶)静置消化2—5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该 细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-a受体和WNT7BS基因 培养基L15: Leibovitz Medium 血清10%FBS 细胞传代方法1:2~1:4 传代；每周2~3次 细胞传代情况C5 细胞冻存条件MDA-MB-231人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件：37 C 5% CO2 消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA 溶液，消化5-10min 传代的比例：1 : 2~1: 4 换液时间：2~3天换液一次 冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO 冻存密度：1-2 X 10 6/管，液氮保存 MDA-MB-231人乳腺癌细胞复苏方法：取出冻存管后，投入37 C水浴中，震荡解冻2 min , 酒精消毒管壁外侧后，将其转入超净台中，将管内细胞转移至离心管中，加入 5 ml 37 C预热的培养基，并清洗冻存管一次，将离心管离心( 1000 rpm , 5 min),弃去上清液，再加入 2 ml培养■基，转入培养瓶中培养。 产品名称：人正常乳腺细胞Hs 578Bst 规格：70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶 特点：细胞代数为4-5代左右 包装：内层无菌自封袋；专用防压泡沫盒；外层防压保温气泡袋；说明书 细胞来源：ATCC、sciencell、ICLC
circRNA基因敲除细胞株的经典方法及案例
circRNA基因敲除细胞株的经典方法及案例 circRNA敲降（干扰） 在研究circRNA功能的方法中，最经典的抑制circRNA的方法是通过RNAi的方式（shRNA）进行敲降。为了避免影响到mRNA，设计方案时需将干扰序列设计在反向剪接位点（BSS）处。源井生物通过设计高效的shRNA，用慢病毒法将干扰载体转入细胞中，根据最佳药筛浓度对细胞进行药物筛选，直到对照组细胞全部死亡，获得circRNA敲降的稳定细胞株。 应用案例： 用siRNA进行敲降后，通过检测细胞增殖凋亡情况，说明circ-HIPK3敲除后抑制细胞增殖。首先设计三组实验，分别针对HIPK3 mRNA线性转录本、 circ-HIPK3环状转录本和两种转录本共有部分设计siRNA，并在HEK-293?T细胞系上验证设计的siRNA只干扰相应的转录本。
利用增殖凋亡检测试剂盒：CCK-8和EdU进行细胞增殖凋亡检测，结果显示HIPK3 mRNA敲降后不明显影响细胞增殖，而circ-HIPK3敲降后，会明显抑制细胞增殖。 参考文献： Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.
circRNA过表达 circRNA过表达一直有成环效率低，容易错配成环等难点。通过优化侧翼成环框架，如成环元件、QKI等RBP的结合位点，使circRNA准确高效环化。过表达后仍需要检测是否成功成环，以及线性mRNA是否表达。为了研究一种新环状RNA载体表达系统的成环效率，选择小鼠circRtn4环状基因在多种细胞系（包括Hela，N2a，HEK293）中进行表达验证。根据不同细胞系中进行的RT-QPCR 实验数据显示，新载体系统pCircRNA-DMo-Rtn4成环效率在几种不同的细胞系中均比普通的载体系统（pCircRNA-BE-Rtn4）要高效得多。 circRNA的检测与鉴定 Northern Blotting是检测circRNA的金标准，探针通常跨反向剪接位点设计。但由于Northern Blotting需要的circRNA量非常大，耗时间精力，而且探针一般是放射性标记，操作上比较困难。常用的检测方案还是用RT-PCR或者是RT-QPCR，引物设计在反向剪接位点两端。
乳腺癌基因
(一)c-erbB-2基因 许多有关c-erbB-2基因的研究基本上已经取得了大致相似的结果。即该基因在乳腺癌研究中常有异常扩增，伴基因表达升高，一般在浸润性癌中，特别在早期癌，如导管内癌中约70％可有c-erbB-2表达水平升高，当发展到浸润癌时，其扩增水平则明显下降，到15％－20％，因此被解释为乳腺癌发展中的早期事件，特别是可为诊断早期癌提供重要参考依据。天津肿瘤医院（1996）对316例乳腺不同类型病变中c-erbB-2癌基因检测结果，正常上皮无表达，轻度增生阳性率仅为4％，重度增生为43.9%，非浸润癌为66.77%，浸润癌则降到45.1％，（P<0.01）。 （二）c-myc基因 c-myc基因扩增也常见于乳腺癌细胞系中，其扩增率为6％－32％，常伴c-myc mRNA 转录水平增高，扩增倍数为2～10倍，在c-erbB-2扩增的乳腺癌中，也常见c-myc的共扩增。利用转基因动物模型能更清楚地见到c-myc癌基因加速肿瘤形成的作用。因而认为c-myc 扩增可以作为早期乳腺癌独立的预后指标。此外，c-myc还参与细胞凋亡过程，细胞凋亡的程度与c-myc活性及表达水平有关。一旦细胞增殖出现障碍，c-myc基因将会启动凋亡程序。这些作用也为今后开展基因治疗提供有力条件。 （三）p53基因 近年研究认为肿瘤发生有可能是肿瘤抑制基因失活的结果。p53为目前最受瞩目的抑癌基因，已经了解到p53基因的高度保守区有四个突变热点，主要集中在4－8外显子之间，在乳腺癌中p53突变率可达到46％，可使细胞增殖停滞在G1期。近年发现p53还具有监控细胞基因活动的作用，一旦细胞内出现异常，它将启动程序性细胞死亡机制，中止细胞生长过程，使之修复损伤的DNA。。近年还发现p53先天变异的家族中，可导致发生Li-Franmeni 综合症。其特点为30岁以前发生恶性肿瘤。人类肿瘤一般有较高的p53突变率，表明它是肿瘤发生过程中起关键性作用的分子之一。p53基因可分为野生型和突变型，研究表明，野生型并不为转化蛋白质编码，其产物分布在核内；与肿瘤抗原或癌基因协同作用的是已发生突变的p53蛋白质，突变型p53蛋白质可抑制野生型p53活性，使之失活。野生型p53基因对一些恶性肿瘤具有p53广谱抑制作用，而突变型p53有成瘤作用。结合临床研究，表明p53基因蛋白的表达因乳腺组织情况而异，正常乳腺组织无表达，乳腺增生与乳腺癌变之间，其表达水平有明显差异，对于早期诊断及判断预后有参考价值。由于p53基因调节肿瘤细胞生长及血管生长功能，现被选作基因治疗的靶基因。 （四）nm23基因 nm23基因是从K－1735属黑色素瘤细胞系的cDNA库中被分离出来的，为近年被确认的肿瘤转移抑制基因，已经见到许多研究报道。人类基因中存在两个nm23基因，即nm23-H1及nm23-H2。现已了解，两者为不完全相同的基因，各有独立的调控系统，各在肿瘤转移中起不同作用。其中以nm23-H1与转移关系更为密切。天津肿瘤医院（1997）对169例乳腺癌进行了nm23基因表达检测，结果，nm23基因表达与远处转移呈明显负相关。nm23 基因高表达率在远处转移组（37.8%）与无远处转移组（75.0％）间的差异非常显著（P<0.005）;与腋窝淋巴结转移也呈负相关。无论腋窝淋巴结阳性或阴性组中，均有部分患者发生或未发生远处转移，nm23基因高表达率在发生远处转移与无远处转移的患者之间均有显著差异。利用此种差异，可将腋窝淋巴结阴性组中具有潜在高转移和腋窝淋巴结阳性组中可能不发生转移的患者筛选出来，分别予以不同处理，，以提高治疗效果。也有人用核酸分子杂交技术检测nm23-H1等位基因缺失与腋下淋巴结转移关系密切。有转移病例nm23-H1等位具有缺失的百分率为33.3%,而无转移组为7.7%（P<0.05）. （五）表皮生长因子（EGF） 近年研究表明，乳腺癌细胞生长受EGF和转化生长因子（TGF-α）的调控。实际上，
乳腺癌细胞培养
MCF-7 就是一种很好养的人乳腺癌细胞,培养基用DMEM或RPMI1640均可, 10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基,加入0、25％的胰酶1ml,轻轻晃动培养瓶,使胰酶流遍瓶壁,以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶(25ml培养瓶)静置消化2－5min,待细胞缩起变圆,将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗,而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用,感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快,一般不放到培养箱中消化,以免消化太过。需要注意的就是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起,一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称 MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性 MDA-MB-231就是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体与WNT7B癌基因 培养基 L15: Leibovitz Medium 血清 10%FBS 细胞传代方法 1:2~1:4传代;每周2~3次 细胞传代情况 C5 细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基:DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件:37℃ 5% CO2 消化条件:0、25% (w/v) Trypsin-0、53mM EDTA溶液,消化5-10min 传代的比例:1:2~1:4 换液时间:2~3天换液一次 冻存液比例:85%培养基,10%FBS, 5% (v/v) DMSO 冻存密度:1-2 ×10 6/管,液氮保存 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法:取出冻存管后,投入37 ℃水浴中,震荡解冻2 min,酒精消毒管壁外侧后,将其转入超净台中,将管内细胞转移至离心管中,加入5 ml 37 ℃预热的培养基,并清洗冻存管一次,将离心管离心(1000 rpm,5 min),弃去上清液,再加入2 ml培养基,转入培养瓶中培养。 产品名称:人正常乳腺细胞 Hs 578Bst 规格:70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶 特点:细胞代数为4-5代左右 包装:内层无菌自封袋;专用防压泡沫盒;外层防压保温气泡袋;说明书 细胞来源:ATCC、sciencell、ICLC
CHO细胞表达系统常见问题与解析
1、问：请问有人养过CHO细胞吗？文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低 糖？ 参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢， 跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。 2、问：要转染钾通道pcDNA3.1入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞？cho细胞转染效率高吗？ 参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有： （1）采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。 （2）WESTERN-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。 （3）构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用GFP）有可 能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。 当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个DNA 测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！ 3、问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长 参考见解：培养CHO细胞最好用F12，并且由于F12中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以在血 清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。我们的前辈曾用F12在无血清的条件下成功的克隆出CHO细胞。