微生物学检验实验指导
微生物学检验实验指导
2009．7
一、《微生物学检验》实验目的要求
1．通过实验验证理论知识，并掌握比较全面的微生物学基本操作技术。
2．在微生物学实验过程中建立无菌观念，掌握无菌操作技术。
3．通过实验进一步掌握临床常见病原微生物的生物学性状、分离培养和鉴定的方法、各种临床标本的微生物学检验程序和方法。
4．在实验过程中逐渐培养独立思考问题、分析问题和解决问题的能力。
二、微生物学实验室规则及实验室意外处理方法
1．微生物学实验室规则
由于微生物学实验是以病原微生物为研究对象，在实验过程中任何疏忽大意都有可能引起实验人员的自身感染或实验室和周围环境的污染。因此，实验中应严格遵守实验规则，建立无菌观念，严格无菌操作，防止实验过程中出现意外情况，并确保实验结果的准确。
（1）试验前须预习实验内容，了解实验目的、方法和注意事项，做到心中有数，避免发生错误，提高实验效率。
（2）进入实验室必须穿工作服，必要时还须戴口罩、帽子和手套，并做好实验前的各项准备工作。
（3）非必需物品禁止带入实验室，带入实验室的物品应远离操作区，放在指定的区域。
（4）实验室内不准大声喧哗、嬉戏，应保持实验室的安静、整洁和有序。不准在实验室内吸烟、饮水和进食，尽量避免用手触摸头、面部，防止感染，尽量减少室内活动，以免引起风动。
（5）实验中注意节约试剂，爱护仪器，避免有菌材料的污染，如有传染性材料污染桌面、地面、手、衣服或发生其他意外情况，应立即报告老师及时作适当处理。
（6）用过的污染物品应放到指定的地点，经专人消毒灭菌之后再进行清洗，切勿乱丢或冲入水池中。禁止将本实验室的物品带出实验室外。需送温箱培养的物品，应标记清楚后送到指定地点。
（7）实验完毕后应将桌面整理清洁，试剂、仪器放回原处，并用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，打扫卫生，关好水、电、门窗。
（8）离室前脱下工作服，反折放在指定的地方；双手在2％来苏液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗净，方可离开实验室。
2．实验室意外的紧急处理方法
（1）发生皮肤破损或刺伤：首先用肥皂和水冲洗伤口，尽量挤出损伤处的血液，并用70%乙醇或其他皮肤消毒剂进行消毒，立即进行医疗处理。
（2）化学药品腐蚀伤：若为强酸，用大量清水冲洗后再以5%碳酸氢钠溶液中和；若为强碱，用大量清水冲洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和；若受伤处是眼部，经上述方法处
理后，再滴入橄榄油或液体石蜡1~2滴。
（3）烧伤：局部涂凡士林、5%鞣酸或2%苦味酸。
（4）菌液误入口中：立即将菌液吐入消毒容器中，再用1∶1000高锰酸钾或3%过氧化氢漱口，根据菌种服用适当抗生素预防感染。
（5）菌液污染环境：将适量2~3%来苏或0.1%新洁尔灭浸泡污染面半小时后除去，如手上有菌污染，也可浸泡于上述消毒液中3~5min，之后用肥皂和清水洗净。
三、生物安全防护知识简介
医学检验工作人员长期接触有潜在传染性的血液、粪便、体液等标本，这些标本往往是各种细菌、病毒等病原微生物的传播载体，无论是实验人员感染，还是造成实验室和周围环境的污染，都将导致严重的后果。因此实验室工作人员在实验过程中必须高度重视实验室生物安全防护，强化生物安全意识，熟悉生物安全防护有关知识，严格无菌操作。
1．微生物的分类等级
根据世界卫生组织（WHO）出版的《实验室生物安全手册》，将微生物分为四个不同危险度等级：危险度1级是指不能引起人或动物致病的微生物，此类微生物无或仅具有极低的个体和群体危险；危险度2级的病原体具有中度个体危险，低度群体危险，能引起人或动物致病，但对实验室工作人员、社区、家畜或环境不易导致严重危害，所引起的感染具有有效的预防和治疗措施，并且疾病传播的危险有限；危险度3级的病原体具有高度个体危险，低度群体危险，通常能引起人或动物的严重疾病，但一般不会发生感染的播散，并且对感染具有有效的预防和治疗措施；危险度4级的病原体具有高度的个体危险和群体危险，通常能引起人或生物的严重疾病，并且很容易发生个体之间的直接或间接传播，对感染一般没有有效的预防和治疗措施。
基于以上划分标准，结合微生物的致病性、传播方式、目前所具有的预防和治疗措施等因素，我国卫生部于2006年制定了《人间传染的病原微生物名录》，对各种病原微生物的危害程度及其相关实验活动需要达到的生物安全实验室级别做了详细分类，各实验室进行有关实验均需参照此标准。
2．生物安全实验室分级与要求
由于各种病原微生物的危险度等级不同，因此实验室必须达到相应的生物防护等级才能开展有关实验。根据WHO《实验室生物安全手册》和我国卫生部2002年颁布的《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》，实验室从生物安全防护的角度共分为四级：一级生物安全防护实验室（BSL-1）为实验室结构设施、安全操作规程、安全设备适用于危险度1级的微生物，依据标准操作程序可进行开放性操作，如用于教学的普通微生物实验室即属此类。二级生物安全防护实验室（BSL-2）适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物，即危险度2级的病原体，该级别实验室应具备生物安全柜和密封的离心管，以免发生泄漏和产生气溶胶。三级生物安全防护实验室（BSL-3）适用于有明显危害、可以通过空气传播的病原微生物（如结核杆菌、伯氏立克次体等），通常已有预防传染的疫苗，该级别实验室除了有严格
的一级和二级安全设施要求外，还需具备合适的空气净化系统。四级生物安全防护实验室（BSL-4）适用于对人体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。BSL-4实验室必须与其他实验室隔离，并具备特殊的空气和废物处理系统，实验操作须在Ⅲ级生物安全柜内或全身穿戴特制的正压防护服。
根据以上定义，医院内的临床实验室因接触可能含有致病微生物的标本，通常应达到二级生物安全防护实验室要求。根据《实验室生物安全认可准则》，二级生物安全实验室结构设施需符合以下几点：（1）实验室需具有防止节肢动物和啮齿动物进入的设计，有可开启的窗户，有纱窗，实验室门有可视窗带锁并能自动关闭。（2）每个实验室均应设置洗手池，宜设置在靠近出口处。（3）实验室工作区域外有足够的存储空间及摆放个人衣物的设施。（4）实验室内墙壁、地面应平整、防滑、易于清洁，不适宜用地毯。（5）实验台面应能防水、耐腐蚀、耐热。（6）实验室内应保证工作照明，避免反光和强光。（7）在实验室内应穿戴隔离衣、帽、手套，必要时戴防护眼镜。实验室应备有生物安全柜。（8）有适当的消毒设施，如高压蒸汽灭菌器，并设置洗眼装置、应急喷淋装置、急救药箱、灭火器等。（9）有可靠的电力供应和应急照明。（10）在实验室出口处设有在黑暗中可明确辨认方向、通道的标识。（11）在实验室入口处和装有传染性物质的设备表面贴有生物危险标志。
3．实验室生物安全管理制度
实验室生物安全制度建设对于临床实验室而言是生物安全防护的核心，实验室生物安全管理制度应包括：实验室准入制度、生物安全培训制度、生物安全责任制和责任追究制度、生物防护与安全制度、安全检查制度、个人防护制度、实验室管理制度、清洁消毒制度、安全计划审核制度、废弃物处理制度、事故报告制度、生物安全防护应急预案、标准操作程序等。
建立健全了各项生物安全制度，还应成立生物安全管理领导小组，加强生物安全制度实施情况的监督管理，实验室入口处须粘贴生物安全标志，注明危险因素，生物安全级别，负责人姓名和电话，进入实验室的特殊要求及离开程序，禁止非工作人员进入实验室，如需参观实验室等特殊行为需经实验室负责人的批准后方可进入。
4．实验室常见生物危险
实验室生物污染的途径包括：空气传播（临床标本中的污染源在空气中传播、微生物气溶胶的吸入）、直接传播（工作中偶然刺伤、割伤，碎玻璃划伤直接感染）、皮肤粘膜接触（临床标本中的传染源通过破损皮肤粘膜接触造成的感染）、其他不明原因的实验室相关感染。
实验室伤害以及与工作有关的感染主要是由于人为失误﹑不良实验技术以及仪器使用不当造成的。因此，实验室人员必须提高生物安全意识，认真学习生物安全相关的各种法规和文件，定期进行生物安全防护知识培训，熟悉生物防护有关知识，加强基本技能的培养，严格执行操作规程。实验室管理者应对实验室的风险级别进行分析，尤其对风险级别较高的、接触高危标本几率较大的区域如微生物和分子生物学室予以高度重视，保护实验室工作人员
和环境的安全。
5．生物废弃材料的管理
实验室内所有用过的样本、培养物及其他生物性材料等废弃物，严禁未经处理就随意丢弃，应置于贴有生物危害标志的专用废弃物处理容器内，注意容器的充满量不能超过其设计容量，利器（如针头、小刀、玻璃等）应置于耐扎锐器盒内，在去污染或最终处置前应存放在指定的安全地方，经过高压灭菌或其他无害化处理后再安全运出实验室；有害气体、气溶胶、污水、废液等均需经无害化处理后排放；动物尸体、组织的处置和焚化应符合国家相关要求。处理危险废弃物的人员需经过专业培训，并使用适当的防护设备。
第一章微生物学检验基本技术
实验一细菌的形态结构观察及显微镜油镜的使用
【目的和要求】
1．熟悉微生物实验室规则并自觉遵守。
2．掌握细菌基本形态和特殊结构的观察方法。
3．掌握光学显微镜油镜的使用和维护方法，了解荧光显微镜和暗视野显微镜的构造和使用方法。
【试剂与器材】
1．示教片：各种球菌、杆菌、弧菌、荚膜、鞭毛、芽胞的示教片。
2．器材及其他：光学显微镜、载玻片、擦镜纸、香柏油、脱油剂等。
【实验内容】
一、细菌基本形态和特殊构造的观察
1．细菌的基本形态（各种球菌、杆菌、弧菌等）
观察要点：注意细菌的染色性、相对大小、形状及排列方式。
2．特殊结构的观察（荚膜、芽胞、鞭毛）
观察要点：注意这些特殊结构的大小、形状及其在菌体中的位置，均有助于细菌的鉴定。
二、光学显微镜油镜的使用
1．光学显微镜的构造
光学显微镜是观察细菌形态最常用的一种仪器，其构造分为机械部分和光学部分，机械部分包括：镜座、镜臂、载物台、镜筒、镜头转换器、调焦装置等；光学部分包括：接物镜、接目镜、反光镜、聚光器、光圈等（见图1-1）。
图1-1 光学显微镜的构造
显微镜的接物镜有低倍镜、高倍镜、油镜三种，放大倍数依次增高，其识别方法为：（1）低倍镜：镜头标志为10×或10/0.25，镜头最短，其上常刻有黄色环圈。
（2）高倍镜：镜头标志为40×或40/0.65，镜头较长，其上常刻有蓝色环圈。
（3）油镜：镜头标志为100×或100/1.30，镜头最长，其上常刻有白色环圈，或“oil”字样。
2．油镜的使用原理
图1-2 显微镜油镜的使用原理
油镜的放大倍数高而透镜很小，自标本片透过的光线，因玻片和空气的折光率不同（玻璃n=1.52，空气n=1.0），部分光线经载玻片进入空气后发生折射，不能进入接物镜，致使射入光线较少，物象不清晰。在油镜和载玻片之间滴加和玻璃折光率相近的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野光亮度增强，物象清晰（见图1-2）。
3．使用方法
（1）采光：使用显微镜时必须端坐，将显微镜放在胸前适当位置。将低倍镜转到中央并对准下面的聚光器，打开光圈，转动反光镜，使光线集中于聚光器（以灯光为光源时，使用凹面反光镜，以自然光为光源时用平面反光镜）。根据所观察的标本，通过升降聚光器和缩放光圈以获得最佳光度。当用低倍镜或高倍镜观察时，应适当缩小光圈，下降聚光器；当用油镜观察时，光线宜强，应把光圈完全打开，并将聚光器上升到最高位置。
（2）低倍镜调焦：将欲观察的标本置载物台上，用弹簧夹和推进器固定，将待检部位移
至视野正中央，上升载物台至不能升高为止。用左眼观察接目镜，缓慢调节粗调节器，使载物台下降，待看到模糊的图像时，再调节细调节器，直至看到清晰的图像为止。
（3）油镜的使用：低倍镜找到物象并调至清晰之后，转开物镜头，在玻片的标本上滴加1滴香柏油，将油镜头转换至中央，缓慢调节粗调节器，使镜头浸入油中，当油镜头几乎接触玻片时停止转动（从侧面观察），边观察接目镜边轻轻转动粗调节器（此时只能上升镜头，不能下降，防止压坏玻片及损坏物镜），待看到模糊物象时改调细调节器，直至找到清晰物象。
镜检时应将标本按一定方向呈“弓”形移动，直至整个标本观察完毕，以防漏检。观察时应将两只眼睛同时睁开，左眼观察，右眼用于绘图或记录。标本观察完毕后，先将物镜头移开，再转动粗调节器使载物台下降，取下载玻片，立即用擦镜纸将镜头上的香柏油擦净。
4．注意事项
（1）显微镜是精密光学仪器，在搬放时应右手紧握镜臂，左手稳托镜座，平端在胸前，轻拿轻放。
（2）显微镜放到实验台上时，先放镜座的一端，再将镜座全部放稳，切不可使镜座全面同时与台面接触，这样震动过大，透镜和微调节器的装置易损坏。
（3）避免强酸、强碱、氯仿、乙醚、酒精等化学药品与显微镜接触，避免日光直射，显微镜须经常保持清洁，勿使油污和灰尘附着。
（4）接目镜和接物镜不要随便卸下，必须抽取接目镜时，须将镜筒上口用布遮盖，避免灰尘落入镜筒内。更换接物镜时，卸下后应倒置在清洁的台面上，并随即装入木箱的置放接物镜的管内。
（5）细调节器是显微镜最精细而脆弱的部分，不要向一个方向连续转动数周，应轻微地来回旋转。
（6）镜头必须保持清洁，油镜使用完后应立即用擦镜纸拭去香柏油。若油镜镜头上的油迹未擦干净，应先将1:1醇醚混合液或二甲苯滴在擦镜纸上擦拭镜头，再用干净擦镜纸将镜头上残留的醇醚混合液或二甲苯擦净。
（7）显微镜擦净后，取下标本片，下降聚光器，再将物镜转成“品”字形，送至显微镜室放入镜箱内。
三、暗视野显微镜
1．构造与原理：在显微镜上安装一个特制的聚光器一暗视野聚光器。此聚光器中央为一黑板所遮，光线不能直接通向镜筒，使视野背景黑暗。这样，从聚光器周边斜射到载玻片上细菌等微粒上的光线，就因散射作用而发出亮光，反射到镜简内。故在强光照射下，可在黑色的背景中看到发亮的菌体。正如我们在暗室内，能看到从隙缝漏入的阳光内，有无数颗尘埃微粒跳跃飞舞一样。
2．使用方法：
（1）将显微镜聚光器御下，装上暗视野聚光器，置暗室，使用人工光源。
（2）先用低倍物镜观察，调节光环置中央后，在暗视野聚光器表面滴上香柏油（或水），再将标本夹在移动尺上。
（3）调节暗视野聚光器，使之油滴（或水滴）与镜台上的载玻片底面接触，
（4）其余操作同光学显微镜。
四、荧光显微镜
1．构造：
（1）荧光显微镜光源：能发射丰富的紫外线光和紫兰光，常用150~200瓦高压汞灯。
（2）滤光片：
1）激发滤光片装于光源与聚光器之问，可选择性使紫外光及紫兰光通过，激发荧光素发出荧光；
2）吸收滤光片装于物镜与目镜之间，可吸收紫外光及紫兰光，仅让荧光通过，以便观察标本和保护眼睛。
2．荧光显微镜的使用方法：
（1）将荧光显微镜置暗室，开启光源，待光源稳定并达到一定亮度（约5~10min）后，对准光轴。
（2）装好配对的激发滤光片和吸收滤光片后再作观察。操作同光学显微镜。
3．注意事项
（1）荧光显微镜如用高压汞灯作光源，使用时一经开启不宜中断，断电后需待汞灯冷却后（约15min）方能再启用。
（2）使用荧光显微镜观察标本时间不宜太长．因标本在高压汞灯下照射超过3min，即有荧光减弱现象。
【结果记录和报告】
实验二细菌的形态学检查
【目的和要求】
1．熟悉细菌染色的常用染料和一般程序。
2．掌握革兰染色的方法、原理、结果观察及意义。
3．熟悉不染色标本检查法（压滴法和悬滴法）的方法与结果观察。
4．熟悉细菌的特殊染色法。
【试剂与器材】
1．菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌。
2．试剂：革兰染色液、细胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理盐水等。
3．其他：载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、香柏油、蜡笔、擦镜纸、脱油剂等。
【实验内容】
一、细菌染色的一般程序
细菌染色法分单染法和复染法。单染法是用一种染料去染，所有细菌都染成一种颜色；复染法是用多种染料对细菌进行染色，不同细菌可染成不同的颜色。
大部分细菌染色的基本程序相同，即：涂片→干燥→固定→染色，根据实验目的选择不同的染色方法，在实际工作中，应用最广泛的是革兰染色法。
二、革兰染色
1．染色原理
（1）等电点学说：革兰阳性菌的等电点（pI2～3）比革兰阴性菌（pI4～5）低，在同一pH条件下革兰阳性菌带负电荷比革兰阴性菌要多，与带正电荷的碱性染料（结晶紫）结合性牢固，不易脱色。
（2）化学学说：革兰阳性菌含有大量的核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%酒精脱色；而革兰阴性菌含此种物质少，故易被乙醇脱色。
（3）通透性学说：革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层较厚，含脂质少，脱色时，乙醇不易进入，而且95％乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小，通透性降低，阻碍结晶紫和碘复合物渗出。而革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层较薄，含脂质多，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫与碘复合物易被溶出而脱色。
2．方法
（1）涂片：取清洁无油迹的载玻片1张，用蜡笔划线将其分成左右两格。用接种环先挑取生理盐水1~2环于载玻片每格中央，再分别挑取大肠杆菌和葡萄球菌少许菌落与生理盐水研匀，涂成直径约1.5cm的菌膜。
（2）干燥：让涂片自然干燥，也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干，但切勿靠近火焰。
（3）固定：干燥后的标本片在酒精灯火焰上来回通过3次（以钟摆的速度），冷却后染色。固定的目的在于杀死细菌，并使菌膜与玻片牢固粘附，避免染色过程中被水冲洗掉，通过固定还可凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性，使细菌易与染料结合而着色。
（4）染色：分以下四步：
1min，水洗1min，水洗约0.5min，水洗0.5min，水洗
待干、镜检
（初染）（媒染）（脱色）（复染）
3．结果：革兰阳性菌染成紫色；革兰阴性菌染成红色。
4．注意事项：
（1）涂片厚薄要适宜，以菌膜刚好能透过字迹为宜（半透明）。如果涂片太厚有可能将革兰阴性菌染成紫色，涂片太薄则可能将革兰阳性菌染成红色。
（2）脱色时间长短要适宜，如果涂片较厚应相应的延长脱色时间，如涂片较薄则相应的缩短脱色时间，脱色时应不断旋转玻片摇匀，使其充分脱色，通常脱到乙醇中没有紫色流下即可。
（3）水洗时，水流不能过大，防止水流直接对准菌膜冲洗。
（4）所有染液应防止因蒸发而改变浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后失去媒染作用；涂片上积水过多会降低染液浓度，影响染色效果。
（5）因细菌的菌龄不同染色结果也有差异，一般以18~24h培养物染色结果最好。
5．医学意义：通过革兰染色有助于细菌的初步鉴别，并可作为选择药物的参考，了解细菌的致病性。
三、特殊染色法
细菌的细胞壁、核质、胞浆颗粒和细菌的特殊结构如芽胞、荚膜、鞭毛等，必须用相应的特殊染色法才能染上颜色。
1．细胞壁染色法
（1）涂片、干燥：同革兰染色法。
（2）固定：滴加100g/L鞣酸固定标本15min，水洗。
（3）滴加5g/L龙胆紫染色3~5min，水洗，待干、镜检。
结果：有细胞壁的细菌仅菌体周边染成紫色，菌体内部无色；无细胞壁的细菌（如L型细菌）整个菌体都染成紫色。
2．鞭毛染色法（改良Ryu法）
鞭毛染色可从平板上直接挑取菌落，也可从斜面培养基上刮取菌苔涂片，必须注意动作尽量轻，以免鞭毛脱落。培养基应为营养较好的琼脂平板（如血平板、营养琼脂），不可用含抑制剂的选择培养基（如SS、中国蓝、MAC等）。
（1）玻片的处理：要求用新的载玻片，用前在95%乙醇中浸泡24h以上，用时从酒精中取出，用干净的纱布擦干使用。若水滴向周围流散而不形成水珠表示玻片处理良好。
（2）在玻片上加蒸馏水1滴，用接种针蘸取菌落少许，将细菌点在蒸馏水滴的顶部（一般只需点一下，仅允许极少量细菌进入水滴），使其自然流散成薄膜，不可搅动，以免鞭毛脱落。
（3）室温自然干燥，不可在火焰上烘干。
（4）滴加染液（配方见附录二），染色约10~15min后，将玻片微倾斜，用蒸馏水缓慢滴
加在玻片顶端无菌膜处洗去染液，注意洗净染液表面的金属光泽液膜。
（5）玻片自然干燥后镜检。观察时应从细菌较少的地方寻找鞭毛。
结果：鞭毛染成红色。
3．芽胞染色法
（1）涂片、干燥、固定：同革兰染色法。
（2）染色：分为以下三步。
1）初染：在菌膜上加石炭酸复红染液，用微火加热使染液冒蒸气5min，注意不能煮沸或烧干，加热过程中应随时添加染液，冷却后水洗。
2）脱色：用95%乙醇脱色1～2min，水洗。
3）复染：用碱性美蓝染1min，水洗，待干、镜检。
结果：菌体呈蓝色，芽胞染成红色。
4．荚膜染色法
（1）黑斯氏法
1）涂片，自然干燥，加热固定。
2）滴加结晶紫染液，在火焰上微微加热至染液冒蒸气为止。
3）用硫酸铜溶液将玻片上的染液洗去（注：切勿水洗），用吸水纸吸干后镜检。
结果：菌体及背景均染成紫色，荚膜染成淡紫色或无色。
（2）密尔氏法
1）涂片：提前数日于小鼠腹腔注射肺炎链球菌0.2ml，小鼠死亡后取腹腔液印片，自然干燥，加热固定。
2）滴加石炭酸复红染液，微火加热染色1min，水洗。
3）加媒染剂染0.5min，水洗。
4）加碱性美蓝染色1min，水洗，待干，镜检。
结果：菌体染成鲜红色，荚膜染成蓝色。
5．异染颗粒染色
细菌经涂片、干燥、固定，加甲液（见附录二）染色3~5min，水洗后加乙液染色1min，水洗，待干、镜检。
结果：菌体染成蓝绿色，异染颗粒染成蓝黑色。
四、不染色标本检查法
细菌未经过染色呈无色透明，在显微镜下为有折光性的小点，不能判断细菌的形态和结构特征。因此，不染色标本检查法主要用于观察细菌的动力，常用的方法有以下几种。
1．压滴法
用接种环分别取菌液2～3环，置于洁净载玻片中央。用小镊子挟一盖玻片，先使盖玻片一边接触菌液，然后缓缓放下，覆盖于菌液上，避免菌液中产生气泡。先用低倍镜找到观察部位，再换高倍镜观察细菌的运动。
2．悬滴法
取一洁净凹玻片，在凹窝四周涂少许凡士林。取一环菌液于盖玻片中央，将凹玻片凹窝对准盖玻片上的菌液，迅速翻转载玻片，用小镊子轻压盖玻片，使之与凹玻片粘紧封闭（见图2-1），置显微镜下观察。
图2-1 悬滴法
3．暗视野显微镜观察
将上述经压滴法制成的标本片，置于暗视野显微镜下观察，有鞭毛的细菌运动活泼，在黑色的背景下闪闪发亮，有明显的位置移动。
观察要点：有鞭毛的细菌运动活泼，可向不同方向迅速运动，位置移动明显。无鞭毛细菌不能做真正的运动，但受水分子的撞击而呈分子运动（布朗运动），即在一定范围内作来回颤动，位置移动不大，注意与细菌的鞭毛运动相鉴别。
【结果记录和报告】
实验三灭菌前的准备与基础培养基的制备
【目的和要求】
1．熟悉常用玻璃器皿的清洗、灭菌前的包装准备。
2．熟悉培养基的种类、主要成分及用途。
3．掌握基础培养基的制备程序、方法和注意事项。
【试剂与器材】
1．试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、1mol/L NaOH、1mol/L HCl等。
2．器材：试管、吸管、平皿、锥形瓶、量筒、吸管、精密PH试纸、天平、滤纸等。【实验内容】
一、常用玻璃器材的洗涤和准备
1．玻璃器材的洗涤
玻璃器材若不清洁，常可影响实验结果，如影响培养基的pH值，甚至由于某些化学物质的存在可抑制微生物的生长；试管不清洁也可影响血清学反应的结果，如在pH<3时可发生酸凝集。因此，微生物实验所用的各种玻璃器材必须清洗干净后才能使用。
（1）新的玻璃器材：
先用肥皂水煮沸半小时，再用自来水冲洗多次，晾干水后浸于2％HCl内数小时，将游离的杂质除去，最后用自来水反复冲洗除尽残余HCl后，晾干备用。
（2）用过的玻璃器材：
1）凡含有培养基或病原微生物的玻璃器材，均应先用煮沸或高压蒸汽灭菌法灭菌，然后趁热倒出培养基，用5％肥皂水刷洗，再用自来水冲净后倒置架上，晾干备用。
2）试管：作血清反应的试管若不含病原微生物，可先用5％热肥皂水刷洗，再用自来水冲洗；若不够清洁，可先用清洁液（配制法见附录二）浸泡数小时，然后用自来水冲洗7次以上，晾干备用。
3）吸管：吸过病原微生物的吸管，应插入盛有消毒液（3~5％来苏）的玻璃筒中（筒底应垫纱布或棉花，以免碰破吸管尖），使消毒液盖过吸管，浸泡24h后，用5％肥皂水洗涤，再用自来水冲洗（若无病原微生物污染，则可用自来水浸泡或直接用自来水冲洗），晾干水后，用清洁液浸泡数小时，最后用自来水冲洗7次以上，晾干备用。
4）载玻片及盖玻片：用后分别浸入3~5％的来苏液中，浸泡24h后，用5％肥皂水煮沸10min，再用自来水冲洗，晾干后于清洁液中浸泡数小时，最后用自来水洗净，晾干备用。
5）注射器：用后若无病原微生物污染，立即用自来水将注射器及针头等抽洗干净；若有病原微生物污染，则立即进行煮沸消毒（含有芽胞菌，则应用高压蒸汽灭菌）。在消毒或灭菌之前，均应先将清水抽入针头及注射器内反复抽洗几次，并连同洗出水一起消毒或灭菌，以免加热时有蛋白质凝固而阻塞针头或注射器。若用上述方法不能洗净，可再置清洁液中浸泡数小时（针头不能用清洁液泡），取出用自来水冲洗7次以上，干燥后备用。
2．常用无菌器材的准备
（1）包装
1）平皿：用纸包好，或盛入金属盒内。
2）试管和锥形瓶：空的或盛有培养基的均可用棉塞塞好，并用不透水的厚纸包于棉塞外。若是盛有液体培养基的试管，应直立并扎成捆，以免灭菌时倾倒。
3）吸管：于吸口端先垫入少许棉花(不可太松或太紧)，然后每支分别用纸包好，或以数支放入金属筒内。
4）注射器：最好将内芯取出，与外套一起用纸或纱布包好；针头最好装入小试管内（管底垫有少量棉花），管口塞上棉塞。
（2）灭菌
上述玻璃器材可用高压蒸汽灭菌法，也可用干烤法进行灭菌。如用干烤法应注意控制温度和时间在160~170℃2h，以免烧焦棉塞及外包的纸张等。
注意：任何已灭菌的器材。在使用前不能随意打开，一经打开则不再认为是无菌的。
二、基础培养基的制备程序和方法
培养基是用人工方法将细菌生长所需要的营养物质按一定比例配制而成的营养基质。按照物理性状分为：液体、半固体和固体培养基三类，其区别主要是凝固剂的有无和多少；按
用途分为：基础、营养、选择、鉴别、增菌、特殊培养基等。
培养基的成分因种类不同而异，其中基础培养基含有一般细菌生长所需要的基本营养成分，如：蛋白胨、肉浸液（或牛肉膏）、氯化钠和水，这些营养物质能为细菌提供生命所需的碳源、氮源、无机盐、水分，并能调节菌体内外的渗透压，为细菌提供能量。其他培养基大多是在基础培养基中加入某些特殊成分（如：营养物质、抑菌剂、检测基质、指示剂等）配制而成。
1．培养基配制的基本程序
包括：调配、溶化、矫正pH、过滤澄清、分装、灭菌、鉴定等几个主要步骤。
（1）调配：先在锥形瓶或烧杯中加入少量蒸馏水（事先量好），按照培养基的配方准确称取各种成分加入瓶中混合，再将剩余的水冲洗瓶壁。
（2）溶化：将调配好的混合物置电炉上隔水加热，使其完全溶解，注意随时搅拌，防止溶液外溢，溶解完毕，应补足失去的水分。
（3）矫正PH：用PH比色计、比色法或精密PH试纸矫正溶液的PH，一般矫正至7.2~7.6左右。其中PH试纸矫正法操作简便，快速，但误差较大；用PH比色计和比色法测定PH较为准确，后者无需特殊仪器。
比色法：取3支与标准管口径相同的试管，按下表加样。
试管号培养基蒸馏水0.2g/L酚红
1（测试管）5ml —0.25ml
2（蒸馏水管）—5ml —
3（培养基管）5ml ——
第4管为标准PH比色管（配方见附录二）。
将4支试管按图3-1所示插入比色架中进行比色。
目测方向
图3-1 比色法
若测定管偏酸或偏碱，可分别加入0.1mol/L NaOH、0.1mol/L HCl矫正，直到测定管的颜色与标准管相同为止，注意：在加酸或加碱矫正时要缓慢，并准确记录加入的量，按下式计算培养基中需加入的量。
计算：设5ml培养基矫正PH至7.4需加入0.15mlNaOH，现配制1000ml培养基，需加入NaOH的量为：
5∶1000=0.15∶X，则X=（0.15×1000）/5=30ml
为防止培养基因矫正PH而加入过多的水，可将0.1mol/L NaOH换算成1mol/L NaOH，则需3ml。在培养基中加入NaOH后需再测一次PH，如仍未达到所需PH，再按上述方法进行矫正。
（4）过滤澄清若培养基有混浊或沉淀，则需过滤。液体或半固体培养基用滤纸过滤，固体培养基在加热溶化后用绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。
（5）分装根据需要将培养基分装于不同的容器中，并进行包扎。
1）基础培养基：一般分装于锥形瓶，灭菌后备用，便于随时分装倾注平板或制备营养培养基。灭菌后的基础培养基在倾注平板前应冷却至50℃左右，以无菌操作分装于无菌平皿内（直径9cm的平皿分装量约13~15ml），待培养基冷却后将平皿翻转，即为琼脂平板。
2）琼脂斜面：分装于试管，分装量约为试管高度的1/4~1/3，灭菌后趁热放置成斜面，斜面长度占试管长度的2/3左右，斜面下方保持1cm高。
3）半固体培养基：分装于试管，量约为试管高度的1/4~1/3，灭菌后趁热将试管直立凝固。
4）琼脂高层培养基：分装于试管，量为试管高度的2/3，灭菌后趁热将试管直立凝固。
（6）灭菌根据培养基的成分、性质采用不同的灭菌方法。
1）高压蒸汽灭菌法：用于基础培养基等耐高温培养基的灭菌。
2）间歇灭菌法：用于含糖、明胶、血清、牛乳、鸡蛋等不耐高温物质配制的培养基灭菌。
3）水浴低温灭菌法：将血清、腹水、组织液等配制的培养基在水浴中加热56~57℃维持1h，以保持液体状态，连续5~7天，此法较少用。
4）血清凝固器灭菌：用于富含蛋白质的培养基（如含血清、鸡蛋清的培养基）灭菌，方法是：将分装好的培养基（一般做成斜面）放在血清凝固器中，第一天75℃30min，第二天80℃30min，第三天85℃30min，在三次灭菌的间隙将培养基置35℃温箱孵育过夜。
5）过滤除菌：用于血清、细胞培养液的灭菌。
（7）鉴定包括两项内容：
1）无菌试验：将灭菌后的培养基置35℃温箱孵育24h，无菌生长为合格。
2）效果检验：将已知菌种接种于培养基上，观察细菌的生长情况、生化反应等是否符合。
（8）保存制备好的培养基需注明制备日期、名称，置4℃冰箱或冷暗处保存，但不宜放置过久。
2．常用培养基的配制和用途（见附录一）
3．培养基配制的注意事项
（1）在进行调配时应在瓶中先加入少量水，再加入各种固体成分，以免固体成分粘附在瓶壁上。装培养基的容器不能用铁、铜等材质的容器，若铁进入培养基中，含量超过0.14mg/L 时可抑制细菌毒素的产生；含铜量超过0.3mg/L时可抑制细菌的生长。某些特殊成分（如染料、胆盐、指示剂等）应在矫正PH后加入。
（2）如需要制备十分澄清的培养基，可用卵蛋白加热澄清法：取一个鸡蛋的卵蛋白加水
20ml，搅拌至出现泡沫，倒入1000ml液体或溶化的固体培养基，混匀，流通蒸汽加热30~60min，使培养基中的不溶性物质附着于凝固蛋白，取出后用纱布加脱脂棉（固体培养基）或滤纸（液体或半固体培养基）过滤。
（3）灭菌后的培养基在进行分装时应注意无菌操作，倾注平板时培养基的温度不能过高，否则冷凝水多，影响细菌的分离并易造成污染；也不能温度过低，否则琼脂过早凝固，使平板表面高低不平。
（4）在加热溶化时注意溶液不能溢出瓶外，否则会影响培养基的营养成分，若水分蒸发，应补足失去的水分。
【结果记录和报告】
实验四细菌的接种培养法与生长现象的观察
【目的和要求】
1．掌握无菌技术，建立无菌观念；明确无菌操作时注意要点。
2．掌握细菌的接种、分离培养方法和接种环的制作方法。
3．熟悉细菌生长现象的观察方法。
【试剂与器材】
1．菌种：葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等。
2．培养基：固体、半固体、液体培养基。
3．其他：温箱、酒精灯、接种环、接种针、L形玻棒、打火机、记号笔等。
【实验内容】
一、细菌的接种工具
1．接种环和接种针：其结构包括环（针）、金属柄、绝缘柄三部分（见图4-1）。其中环（针）部分最佳材料为白金丝，因其受热和散热速度快，硬度适宜，不易生锈且经久耐用，但因为价格昂贵而限制了其应用。目前实验室常用的是经济实用的300~500W电热镍鉻丝。一般要求接种环长5~8cm，直径为2~4mm，定量接种环的容量为0.001ml。
图4-1 接种环和接种针
接种环（针）在使用之前需检查镍鉻丝是否呈直线，若有弯曲，需用吸管或接种环的另一端将其压直；若环不圆，可将镍鉻丝前端放在吸管尖部缠绕一圈，再将镍鉻丝突出的部分朝内压紧。
接种环用于固体、液体培养基的接种，接种针用于半固体培养基的接种。
2．L形玻棒：由直径2~3mm的玻璃棒弯曲成L形制成。在使用之前用厚纸包扎后置高压蒸汽灭菌，或沾取无水乙醇后在火焰上烧灼灭菌。主要用于液体标本涂布接种。
二、细菌的接种方法
1．液体培养基的接种
该法主要用于细菌的增菌培养或进行细菌的生化反应。
方法：（图4-2）
（1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许细菌。
（2）左手拿试管，右手持接种环，用右手其余手指将试管塞打开，试管口通过火焰烧灼灭菌。
（3）将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次，使细菌均匀分布于培养基中。
（4）将试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。
（5）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。
图4-2 液体培养基接种法
2．半固体培养基的接种
该法可用于保存菌种、观察细菌的动力或进行细菌的生化反应。
方法：（图4-3）
（1）先将接种针在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。
（2）左手拿试管，右手持接种针，将试管塞打开后，试管口通过火焰灭菌，将接种针从培养基的中心向下垂直穿刺接种至试管底上方约5mm处（勿穿至管底），然后由原穿刺线退出，
（3）将试管口灭菌后加塞，接种针烧灼灭菌后放回原处。
（4）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。
图4-3 半固体培养基接种法
3．平板划线接种法
该法可将标本中的多种细菌分散成单个菌落，有利于细菌的分纯和进一步鉴定。
方法：
（1）连续划线法（图4-4）
1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。
2）左手斜持平板，用手掌托着平板底部，五指固定平板边缘，在酒精灯旁以拇指、食指和中指将平板盖撑开大约30~45°角，将已挑取细菌的接种环先在平板一侧边缘均匀涂布，然后运用腕力将接种环在平板上自上而下，来回划线。划线要密，但不能重叠，充分利用平板的面积，不能划破琼脂表面，并注意无菌操作，避免空气中的细菌污染。
3）划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处。
4）在平板底上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。
图4-4 固体培养基连续划线法
（2）分区划线法（图4-5）
1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。
2）同上法将平板盖打开约30~45°角，将已挑取细菌的接种环在平板一端（1区）内作来回划线，再在2、3、4区依次划线，每区的划线须有数条线与上区交叉接触，每划完一区是
否需要烧灼接种环依标本中的菌量多少而定，每区线间需保持一定距离，线条要密而不重复。
3）划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处。
4）在平板底上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。
图4-5 固体培养基分区划线法
4．斜面培养基接种法（图4-6）
斜面培养基主要用于细菌的纯培养，以进一步鉴定细菌或保存菌种。
（1）将接种环（或接种针）在火焰上烧灼灭菌，待冷却后以无菌操作挑取少许菌落。
（2）左手拿试管，打开试管塞后，试管口通过火焰灭菌，再将取有细菌的接种环由斜面底部向上划一直线，再由下至上在斜面上作曲线划线。
（3）试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。
（4）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。
图4-6 斜面培养基接种法
5．涂布接种法
本法主要用于活菌计数和药敏试验。
（1）活菌计数：取一定稀释度的菌液0.1ml滴在平板上，用无菌L型玻璃棒将液滴涂布均匀，盖上平板盖，经35℃培养18~24h后计数菌落，则每毫升所含活菌数=菌落数×10×稀释倍数。
（2）直接涂布法：多用于纸片法和管碟法药敏试验。先配制一定浓度的菌液，用无菌棉签蘸取菌液后，在管壁上将多余的液体挤去，在MH琼脂平板上按三个方向均匀涂布3次，最后沿平板边缘涂一周。盖上平板盖，置室温放置5min使平板表面稍干，然后用无菌镊子将药敏纸片贴在培养基表面，或向竖在平板表面的牛津小杯内加入不同浓度的药物，经35℃培养18~24h后观察结果，测定抑菌圈直径，按判断标准判定结果。
6．倾注培养法
此法常用于标本或样品中活菌计数。
（1）方法：
1）将标本用无菌生理盐水稀释成不同浓度：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等。
2）取不同稀释度的标本各1ml分别注入直径90mm无菌平皿，迅速加入溶化并冷却至约50℃的营养琼脂15ml，轻轻转动平板使之充分混匀，待凝固后翻转平板。
3）置35℃温箱孵育18~24h，计数菌落形成单位（colony forming unit，CFU），按下式算出每ml标本中的细菌数：
1ml标本中的活菌数=全平板CFU×稀释倍数
7．细菌接种的注意事项
（1）细菌接种过程中需注意无菌操作，避免污染，因此每一步操作均需严格按要求进行。操作时不宜说话或将口鼻靠近培养基表面，以免呼吸道排出的细菌污染培养基。
（2）所有操作均需在酒精灯火焰附近进行，平皿盖、试管塞、瓶塞均应拿在手上打开（具体见前述），禁止将盖或塞事先取下放置在桌面上。
（3）取菌种前灼烧接种针（环）时要将镍鉻丝烧红，烧红的接种针（环）稍事冷却再取菌种，以免烧死菌种。
（4）取菌时注意菌落不要取得太多，应蘸取而不宜刮取，否则平板划线很难分离出单个菌落。
（5）平板划线时注意掌握好划线的力度和角度，用力不能过重，接种环和培养基表面大约呈30~40°角，划线要密而不重复，充分利用培养基，并注意不能划破平板。半固体培养基接种时注意穿刺线要直，并沿原穿刺线退出。
（6）接种完毕后，需在培养基上做好标记再放置温箱孵育。废弃的有菌材料（如玻片、有菌的平板、试管、吸管等）均需灭菌后再清洗。发生有菌材料污染应及时进行消毒处理。
三、细菌的培养方法
1．需氧培养法
该法适用于需氧菌和兼性厌氧菌。将接种后的培养基（试管放试管架上，平板底上盖下）置35℃培养箱，培养18-24h。大多数细菌生长速度快，在孵育18~24h后即可见到生长现象，但若标本中的菌量少或生长速度慢的细菌（如结核分支杆菌），则需培养3~7天甚至4~8周后才能观察到生长现象。
2．CO2培养法
（1）CO2孵育箱：能自动调节箱内CO2的浓度和温度，使用方便。
（2）烛缸法：取一有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨口处上涂上凡士林。将接种后的培养基放入缸中，并在缸内放一支点燃的蜡烛，加盖密封。随着缸内蜡烛燃烧产生的CO2增加，蜡烛逐渐自行熄灭，此时缸内的CO2浓度约为5~10%，置35℃培养箱孵育18~24h后观察结果。（见图4-7）
图4-7 烛缸法
（3）化学法（重碳酸钠-盐酸法）：按每升容积重碳酸钠0.4g与1mol/L盐酸0.35ml比例，分别将二种试剂置于容器内，将容器放置在标本缸中，密封后倾斜容器，使二种试剂接触混合产生CO2。该法适用于奈瑟菌和布鲁菌等苛养菌的培养。
3．微需氧培养：先用真空泵将容器内的空气排尽，再注入5%O2、10%CO2、85%N2的混合气体，然后置于35℃培养箱孵育后观察结果。该法适用于空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等微需氧菌的分离培养。
4．厌氧培养法：
（1）厌氧罐培养法：用理化方法使容器内形成无氧环境，用于专性厌氧菌培养。常用的方法有抽气换气法和气体发生袋法。
1）抽气换气法：将已接种的培养基放入真空干燥缸或厌氧罐中，再放入催化剂钯粒和指示剂美蓝。先用真空泵将缸内抽成负压99.99kPa（750mmHg），再充入无氧氮气，反复三次，最后充入80%N2、10%H2和10%CO2混合气体，若缸内呈无氧状态，则指示剂美蓝为无色。每次观察标本后需重新抽气换气，用过的钯粒经160℃2h干烤后可重复使用。
2）气体发生袋法（Gas-pak法）：该法需以下二种容器：厌氧罐——是由透明聚碳酸酯或不锈钢制成，盖内有金属网状容器，其内装有厌氧指示剂美蓝和用铝箔包裹的催化剂钯粒；气体发生袋——是一种铝箔袋，其内装有硼氢化钠-氯化钴合剂、碳酸氢钠-柠檬酸合剂各1丸和1张滤纸条，使用时剪去特定部位，注入10ml水，水沿滤纸渗入到二种试剂中，发生下列化学反应，产生H2和CO2。立即将气体发生袋放入罐内，密封罐盖，使气体释放到罐中。
C6H8O7+3NaHCO3→Na3(C6H5O7)+3H2O+3CO2↑
NaBH4+2H2O→NaBO2+4H2↑
（2）厌氧袋法：厌氧袋是用无毒透明、不透气的复合塑料薄膜制成。袋中装有催化剂钯粒和2支安瓿，分别装有H2、CO2发生器（化学药品，成分同上）、指示剂美蓝。使用时将接种细菌的平板放入袋中，密封袋口，先将袋中装有化学药品的安瓿折断，几分钟后再折断装有美蓝的安瓿，若美蓝为无色则表示袋内已处于无氧状态，置35℃温箱孵育。
（3）需氧菌共生法：将已知专性需氧菌（如枯草芽胞杆菌）和待检厌氧菌分别接种到2个大小相同的平板上，将两者合拢，缝隙用透明胶密封，置35℃温箱培养，需氧菌生长过程中消耗氧气，待氧气耗尽后，厌氧菌即开始生长。
（4）平皿焦性没食子酸法：按每100ml容积加入焦性没食子酸1g和2.5mol/LNaOH 10ml
微生物学实验指导
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、大 小的测定和计数 一、实验目的 1、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片，学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 4、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 1、显微镜 2、微生物标本装片 3、目、物镜测微尺 4、血球计数板 5、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜，由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器；光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 2、操作 在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺（图1-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间 . . . .
. . . . 像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺（图1-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm 等分为100格，每格长l0μm （即0.0lmm ），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载物台上，由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即物镜测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度(图1-3)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μm ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺5小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为l0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺，换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm ＝平均格数×校正值 宽μm ＝平均格数×校正值 大小表示： 宽μm ×长μm 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正
微生物学实验指导大全
微生物学实验指导 黄文芳张松编著 华南师范大学生命科学学院 第一部分基础实验 实验1 培养基的配制 一、实验目的和内容 目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。 内容：1．牛肉膏蛋白陈培养基的配制。 2．高氏1号培养基的配制。 3．马丁氏培养基的配制。 二、实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO423H2O、MgSO427H2O、FeSO427H2O。 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。 三、操作步骤 （一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.6 1．称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2．加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。 3．调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4．过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。 5．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 6．加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7．包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾
微生物学实验技术指导书
实验须知 普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基础知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。 2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导老师，及时处理，切勿隐瞒。 5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。 6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。 7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石碳酸液覆盖0.5小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前需浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。 8.每次实验需进行培养的材料，应标明姓名、组别及处理方法，放于教师指定的仪器内培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10.实验结束后，整理桌面，物归原处，留人打扫室内卫生。 11.离实验室前，将手洗净，注意关闭火、煤气、灯、水管等。
微生物学综合设计实验实验指导
微生物学综合设计实验实验指导 实验内容：环境（样品）微生物检测 实验目的 1. 巩固培养基配制和灭菌操作等微生物实验技术。 2. 学习平板菌落计数的原理和方法。 3. 加深和巩固对四大类细胞型微生物的菌落特征的认识。 4. 了解不同环境（样品）微生物检测的方法和评价指标。 5.. 培养学生实验设计能力和分析问题解决问题能力和团结合作精神。 实验要求 以3~4人为一组，对某一特定环境的（如空气）、某一样品微生物数量和种群进行测定，并参考相应的标准进行评价和分析，并给予合理的建议。 实验安排 第一阶段（9—10周）：布置任务，选题，查阅文献，撰写实验方案 第三阶段（10—14周）：实验准备、实验和实验结果观察 第四阶段（15周）：数据整理，撰写实验报告，16周周 第五阶段（16周）：交实验报告，清理、归还器皿、实验室钥匙 实验报告 实验报告要求按照正式发表论文的格式书写。包括如下内容： 文章标题：简明扼要，不超过20字
作者姓名、班级、学号 中文摘要：不超过200字。摘要应给出文中主要的实验方法和实验结果以及结论。 关键词：3~5个。 英文标题、作者姓名和班级学号、摘要和关键词：必须和中文一致。 正文：包括前言（主要包括研究目的和意义）、实验材料和方法、实验结果、分析和讨论） 参考文献 其他说明：如致谢等。 成绩评定（20分） 方案：3分（选题是否有意义、实验设计合理性、采用的方法是否正确、查阅文献的数量） 实验内容：10分。是否完成预定计划、实验的工作量和难度、结果的可信度等 实验报告：7分（格式、数据的处理、语言表达、分析讨论） 注意事项： 1、按照规范正确的方法进行操作（灭菌锅使用、琼脂融化、分装） 2、注意安全（灭菌锅、电炉、酒精灯、门窗、水电） 3、保持实验室整洁 4、节约
微生物实验指导
二零零六年十月
目录 实验一显微镜油浸系物镜的使用 ------------------------------------------3实验二细菌形态的观察-------------------------------------------------------------4实验三细菌简单染色法及口腔微生物的观察 ------------------------5实验四细菌的革兰氏染色---------------------------------------------------------7实验五细菌的芽胞染色 ------------------------------------------------------------8实验六酵母菌的形态观察实验 ---------------------------------------------- 10实验七霉菌的形态观察----------------------------------------------------------- 12实验八细菌大小的测定----------------------------------------------------------- 14实验九细菌数量的测定（血球板计数） ------------------------------ 16实验十培养基的配制--------------------------------------------------------------- 19实验十一消毒与灭菌--------------------------------------------------------------- 21实验十二稀释平板计数及微生物菌落形态的观察 -------------- 27实验十三紫外线对微生物生长的影响 ---------------------------------- 30实验十四抗生素对微生物的作用 ------------------------------------------ 30实验十五比浊法测定大肠杆菌的生长曲线 ------------------------ 31实验十六土壤中好气性细菌的分离与计数(附划线分离法)33实验十七土壤中放线菌的分离与计数 -------------------------------- 35实验十八土壤中真菌的分离与计数 ------------------------------------ 36实验十九纤维素分解试验----------------------------------------------------------- 37
微生物学检验实验指导
微生物学检验实验指导 2009．7 一、《微生物学检验》实验目的要求 1．通过实验验证理论知识，并掌握比较全面的微生物学基本操作技术。 2．在微生物学实验过程中建立无菌观念，掌握无菌操作技术。 3．通过实验进一步掌握临床常见病原微生物的生物学性状、分离培养和鉴定的方法、各种临床标本的微生物学检验程序和方法。 4．在实验过程中逐渐培养独立思考问题、分析问题和解决问题的能力。 二、微生物学实验室规则及实验室意外处理方法 1．微生物学实验室规则 由于微生物学实验是以病原微生物为研究对象，在实验过程中任何疏忽大意都有可能引起实验人员的自身感染或实验室和周围环境的污染。因此，实验中应严格遵守实验规则，建立无菌观念，严格无菌操作，防止实验过程中出现意外情况，并确保实验结果的准确。 （1）试验前须预习实验内容，了解实验目的、方法和注意事项，做到心中有数，避免发生错误，提高实验效率。 （2）进入实验室必须穿工作服，必要时还须戴口罩、帽子和手套，并做好实验前的各项准备工作。 （3）非必需物品禁止带入实验室，带入实验室的物品应远离操作区，放在指定的区域。 （4）实验室内不准大声喧哗、嬉戏，应保持实验室的安静、整洁和有序。不准在实验室内吸烟、饮水和进食，尽量避免用手触摸头、面部，防止感染，尽量减少室内活动，以免引起风动。 （5）实验中注意节约试剂，爱护仪器，避免有菌材料的污染，如有传染性材料污染桌面、地面、手、衣服或发生其他意外情况，应立即报告老师及时作适当处理。 （6）用过的污染物品应放到指定的地点，经专人消毒灭菌之后再进行清洗，切勿乱丢或冲入水池中。禁止将本实验室的物品带出实验室外。需送温箱培养的物品，应标记清楚后送到指定地点。 （7）实验完毕后应将桌面整理清洁，试剂、仪器放回原处，并用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，打扫卫生，关好水、电、门窗。 （8）离室前脱下工作服，反折放在指定的地方；双手在2％来苏液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗净，方可离开实验室。 2．实验室意外的紧急处理方法 （1）发生皮肤破损或刺伤：首先用肥皂和水冲洗伤口，尽量挤出损伤处的血液，并用70%乙醇或其他皮肤消毒剂进行消毒，立即进行医疗处理。 （2）化学药品腐蚀伤：若为强酸，用大量清水冲洗后再以5%碳酸氢钠溶液中和；若为强碱，用大量清水冲洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和；若受伤处是眼部，经上述方法处
(完整版)微生物学实验指导书
实验一微生物的分离和纯化 本实验以微生物的分离和纯化为主线，综合包括了培养基的配制、消毒灭菌、微生物的分离等内容,在给定的时间内由学生自主完成。包括以下知识内容。学生书写实验报告的时候,不能照抄袭原文，要用自己的语言，表述实验过程，在别人看完你的实验报告后,能够知道你是怎样做的，能够重复你的实验过程。 一、目的要求 1．了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法. 2．掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。 3 学习、掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术. 4 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 5 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术,了解培养细菌、放线菌及霉等种类的微生物的培养条件. 二、原理 培养基是将微生物生长繁殖所需要各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。其中除含有水分、碳水化合物、含氮化合物和无机盐类。此外，微生物还必须在最合适的酸碱度范围的培养基上生长繁殖，因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的PH值范围.根据研究目的不同,可将培养基制成固体、半固体和液体三种形式。固体培养基是在液体培养基中加入1.5～2％的琼脂作凝固剂，半固体培养基则加入0.5～0.8％的琼脂.有时为了特殊目的，也可用明胶或硅胶等作为凝固剂。 由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。在分离、培养异样微生物时，对一般细菌常用肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏合成1号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基，有时也常用马丁培养基分离霉菌。马丁培养基除含有霉菌所含需的各种营养物外,还有孟加拉红染料，能抑制放线菌和细菌，链霉素可杀死或抑制细菌，但对霉菌均无害，所以这种培养基具有选择作用。
微生物学实验指导书
微生物学实验指导书生物技术教学部初立业编 重庆邮电学院生物信息学院
2003年12月30日 前言 一、本课程的性质和任务 微生物学实验是生物学重要的基础课之一，特别是随着分子生物学的发展与拓宽，微生物学方法与技术显得尤为重要。此外，医学、农学、林学等学科，甚至地质学、太空学等也需微生物的方法与技术。因此，熟悉掌握微生物学方法与技术，对其它很多学科的发展有直接的影响。无菌操作技能和无菌概念的建立是微生物学实验中最重要的内容，微生物学实验课主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。 二、教学要求与教学方法 1.教学要求
1)注重微生物学基础实验技能的掌握与提高，克服盲目追求新颖而忽视基础的倾向； 2)实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤； 3)在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象； 4)树立密切合作的风气，包括学生与老师、班与班、组与组、组长与组员之间的密配合。 2.教学方法 1)以学生自己动手为主，老师在适当时间予以提示； 2)对实验中所出现的一些现象多向学生提出问题，使它们学会分析结果，并与理论知识有 机结合； 3）根据实验的进行程度，引导学生更深入思考，逐步树立他们的创新意思； 4）严格要求使操作技能规范化，老师作示范，强调其要点学生自己练。 三. 教学学时分配与安排 本课程按每周3学时安排，共6个实验，总学时18。 目录 实验一细菌的革兰氏染色 (3) 实验二根霉、酵母菌形态结构的观察 (4)
环境工程微生物实验指导
环境工程微生物实验指导 实验一微生物形态观察 一、实验目的 1、认识细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的基本形态特征。 2、巩固显微镜的使用方法。 3、学习微生物画图方法。 二、实验原理 1、细菌的基本形态 细菌是单细胞的微生物，能够独立进行生活，它的种类繁多，但基本形状有四种：球状、杆状、螺旋状和丝状，分别称为：球菌、杆菌、螺旋菌和丝状菌。 （1）球菌：细胞呈球形或椭圆形，根据它们相互联结的形式可以分为单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等。如金黄色葡萄球菌。球菌大小以直径表示，一般为0.5~1μm。 （2）杆菌：细胞呈杆状或圆柱形，大小以宽度×长度表示，各种杆菌的长度与直径比例差异很大，有的粗短，有的细长。如大肠杆菌就比较细而短、枯草杆菌粗而长。 杆菌是细菌中种类最多的，工农业生产中所用的细菌大多是杆菌。 （3）螺旋菌：细胞呈弯曲杆状，螺旋菌细胞壁坚韧较硬，常以单细胞分散存在。大小一般为（0.3~1.0）μm×（1.0~50）μm，根据其弯曲情况可分为弧菌、螺菌、螺旋体。弧菌只有一弯曲，而螺菌有2~6个弯曲。其大小为0.3~1×1~50μm。若菌体弯曲螺旋圈数较多者，无坚韧的细胞壁，比较柔软，能自由运动，通称为螺旋体。 2、细菌的特殊构造 细菌细胞的特殊构造有荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。 （1）荚膜：是有些细菌生活在一定营养条件下，向细胞壁表面分泌的一种粘液状、胶质状的物质。用显微镜观察，中心部位是细菌菌体，在暗色背景下荚膜呈透明状环绕菌体。 （2）鞭毛和菌毛：鞭毛是某些微生物细胞表面着生的一根或数根细长、波曲、毛发状的丝状物。直径为0.1~0.2μm，它是细菌的运动器官。在光学显微镜下不能直接观察到。经过特殊的鞭毛染色后，在光学显微镜下可以看到鞭毛。 （3）芽孢：是某些细菌在其生长的一定阶段，在细胞内形成一个圆形、椭圆形、壁厚、含水量极低、抗逆性极强的休眠体。芽孢形成的位置、形状、大小可因菌种而异。如：枯草芽孢杆菌的芽胞位于菌体中间，呈卵圆形比菌体小；破伤风梭菌芽胞位于菌体一端呈圆形，比菌体大，使菌呈棒锤形。因此，能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊中的位置、大小等特征是细菌鉴定的依据之一。 3、真菌的特征结构 菌丝：是真菌营养体的基本单位。菌丝是一种管状的细丝，用显微镜观察，像一个透明的管，直径一般3~10μm，与酵母菌相似，比细菌和放线菌的细胞直径约粗几倍到几十倍。根据菌丝中是否存在隔膜，可以把真菌菌丝分成两种类型：有隔菌丝和无隔菌丝。无隔菌丝中无隔膜，整个菌丝体就是一个细胞，其中含有多个细胞核，是低等真菌具有的菌丝类型。有隔菌丝有隔膜，菌丝体由多个细胞组成，每个细胞有1个或多个细胞核，是高等真菌具有的菌丝类型。 4、放线菌的特征结构 放线菌是主要呈丝状生长、以孢子进行繁殖、革兰氏染色阳性的一类原核微生物。放线菌的形态比细菌复杂些，但仍属于单细胞微生物。在显微镜下，放线菌呈分枝丝状，我们把
微生物学实验指导
实验一光学显微镜的操作以及微生物的形态观察 一、实验目的 （一）了解光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养。 （二）观察细菌的个体形态，学会生物图的绘制。 （三）掌握压滴法制作标本的方法。 （四）通过显微镜观察，认识细菌的基本形态及特殊结构。 二、实验仪器、材料 光学显微镜，目测微计、物测微计，香柏油、二甲苯，擦镜纸、吸水纸，细菌、示范片，活性污泥混合液等。 三、显微镜的结构、光学原理及其操作方法 （一）显微镜的结构（图1）和光学原理 显微镜分机械装置和光学系统两部分。 1．机械装置 （1）镜筒：镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜筒有单筒和双筒两种。单筒有直立式（长度为160 mm）和后倾斜式（倾斜450）。双筒全是倾斜式的，其中一个筒有屈光度调节装置，以备两眼视力不同者调节使用。两筒之间可调距离，以适应两眼宽度不同者调节使用。 （2）转换器：转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个孔。不 同规格的物镜分别安装在各孔上。 （3）载物台：载物台为方形（多数）和圆形的平台，中央有一光孔，孔的两侧各装1 个夹片，载物台上还有移动器（其上有刻度标尺），可纵向和横向移动，移动器的作用是夹住和移动标本用。 （4）镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式（可改变倾斜度）两种。 （5）镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。 （6）调节器：调节器包括大、小螺旋调节器（调焦距）各一个。可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。调节器有装在镜臂上方或下方的两种，装在镜臂上方的是通过升降镜臂来调焦距，装在镜臂下方的是通过升降载物台来调焦距，新式显微镜多半装在镜臂的下方。 2．光学系统及其光学原理 1
医学免疫学与微生物学 实验指导
《医学微生物学与医学免疫学》实验指导 前言 医学微生物学与免疫学是医学院校必设的基础课程之一，该学科具有理论与实践紧密结合的特点及实验教学在学科中的重要性。本课程设置要求学生不仅要掌握基础理论、基本知识，而且要学习和掌握各项基本技能。本书结合中药学专业的教学工作实际，编实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，并附有一定量的思考题。本书依教学进程安排实验次序，可帮助学生巩固基础理论知识，培养学生基本技能，提高教学效果。 实验学时：4学时 形态二《医学微生物学》实验指导 实验一细菌分布检测、理化及药物因素对细菌影响的检测 （一）细菌分布的检测 【实验目的与要求】 1.掌握无菌操作技术。 2.熟悉细菌菌落的观察及计数方法。 3.了解微生物在自然界及正常人体的分布，增强无菌观念。 【实验原理】 细菌广泛分布于自然界中，人的体表和与外界相通的腔道中也有细菌存在。通过本次实验理解微生物学科实验中强调无菌操作、防止污染和感染的重要性，为今后在医疗实践中建立牢固的无菌观念打下基础。 【实验仪器、器材与试剂】 1.实验仪器和器材：无菌平皿、普通琼脂平板、血平板、高层琼脂培养基、微波炉、无菌吸管、胶帽、酒精灯、打火机、无菌试管、试管架等。 2.实验试剂：自来水或纯净水、生理盐水等。 【实验项目、方法与步骤】 1.空气中细菌分布的检测——沉降法 （1）取一个普通琼脂平板并作好标记。 （2）置于实验室某处，揭开盖。操作时不要用手接触培养基，以免造成结果误差。 （3）让培养基暴露在空气中30min，然后盖好皿盖，置37℃生化培养箱内培养18～24h。（4）取出观察并纪录结果。
《微生物学实验》操作步骤
实验一培养基的制备与灭菌 实验步骤： （一）伊红美蓝培养基（EMB，用成品，分离大肠杆菌用） 每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。按成品说明称量、放入搪瓷杯，加水，加热完全溶化，倒入三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，作标记（培养基名称、批次组别、日期，下同），灭菌。 （二）营养琼脂培养基（即牛肉膏蛋白胨培养基，用成品，分离芽孢杆菌用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基，方法同上，灭菌。 （三）PDA培养基（即马铃薯蔗糖培养基，分离酵母菌、根霉用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。 培养基配方：马铃薯20%、蔗糖（白砂糖）2%、琼脂 2%，加水至所需体积，pH自然。 配制方法：马铃薯去皮，称量，切成小方块，放入搪瓷杯，加水适量，煮沸20 min，取汁液，补水至所需体积，加入蔗糖（白砂糖），加热溶化，最后加入琼脂（琼脂要预先单独用水浸泡，然后挤干再加入），加热至琼脂完全溶化，分装三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，灭菌。 培养基统一高压蒸汽灭菌（121℃25 min）。 （四）无菌平皿准备（下次实验倒平板用） 每组10套，报纸包扎，高压蒸汽灭菌（121℃25 min）后，置干燥箱80℃烘干1 h。 （五）枯草样预处理及预培养（下次实验分离芽孢杆菌用） 枯草样预处理：每组1瓶。100 ml三角瓶＋自来水约50 ml，加5%可溶性淀粉，溶解。枯草若干，剪短，浸入三角瓶水中，牛皮纸封口，包扎，置水浴中煮沸10 min，然后置培养箱30℃预培养3～7 d。 （六）葡萄样（或其它水果）酵母菌预培养（下次实验分离酵母菌用）每组1瓶。葡萄（或其它水果）适量，捏碎，皮渣与汁液一起放入250 ml 三角瓶（装量1/2～2/3），封口，置培养箱25℃预培养3～7 d，观察自然发酵过程。
医院检验微生物作业指导书
1.目的 规范微生物实验室内部质量控制，确保临床报告的质量。 2.适用范围 微生物实验室的所有检验项目。 3.职责 实验室检验人员均需熟知并遵守本程序。 4.程序 4.1分析前质量控制 4.1.1检验申请单：临床医生应按照《微生物检验项目申请程序》申请临床微生物检测口头申请追加样本检验项目，必须在样本有效期内申请.并补正式的检验申请单。 4.1.2生成微生物检验标本标签：护士应在核对医嘱患者信息和检验申请信息后，按照《微生物检验标本条形码程序》生成申请单和微生物检验项目标签，并将微生物检验项目标签正确张贴于标本容器上。 4.1.3样本采集手册：实验室应制订样本采集手册，指导正确采集和处理样本。 4.1.4样本采集和运输：样本采集人员应按照《采样前患者识别程序》确认患者，按照《标本采集、运送、保存程序》采集样本，并在规定的时间和温度范围内，使用指定的运输培养基，安全运送到微生物室。 4.1.5样本的接收：样本接收人员应严格按照《标本接收、标识及信息录人程序》《标本拒收程序》对样本接收或拒收，并记录。 4.1.6微生物检验标本信息输人：微生物实验室接种岗位检验人员严格按照相关的微生物标本检验信息输，人程序录人，核对患者信息和标本信息等资料。 4.1.7样本储存：微生物实验室接种岗位检验人员按照相关的微生物标本检验前储存程序正确铺存未能及时处理的标本，已经检验的样本应在保证其性质稳
定的条件下，将样本以适当的方式保留到规定时间内，以便能在出具结果报告后可以复查，成做补无检食。 4.2分析中质量控制 4.2.1试剂的质量控制 4.2.1.1所有试剂用于检测标本前，必须做质控以验证试剂性能并记录质控结果，只有质控合格才可使用（表2-1-1）。质控应遵循以下原则。 4.2.1.1.1使用中的染色剂（革兰染色、特殊染色和荧光染色），至少每周（若检测频率小于每周1次,则实验当日）用已知阳性和阴性（适用时）的质控菌株检测。 4.2.1.2平行试验：新批号试剂使用前须用老试利或参考材料平行试验。 4.2.1.3无厂商特别说明时，不同批号的试剂不可混用。 4.2.1.4缺陷或失效试剂只能用于培训员工业务能力，否则报废处理。培训试剂应明显标记“仅供培训使用"，并与检验试剂分开放置。 4.2.2培养基的质量控制 4.2.2.1培养基外观良好（平滑、水分适宜、无污染、适当的颜色和厚度，试管培养基湿度适宜），新批号及每一贷次的商品成自配培养基应检测相应的性能，包括无菌试验、生长试验或与旧批号平行试验、生长抑制试验（适用时）、生化反应（适用时）等，应以质控菌株进行验证。 4.2.2.2外观检查合格的培养基的标准：完整，琼脂附于平板底部，血平板应不透明、没有溶血情况，平板颜色好、湿润，无干裂、无污染、无浑浊或沉淀、无冻伤、无过热现象，琼脂厚度至少3mm。如发现与上述情况不符的培养基，应不予使用。 4.2.2.3无菌试验时抽检培养基数量：100块以内，随机抽检5%;100块以上可随机取10块平板或10支试管培养基进行无南试验。35C培养24h后观察是否有细菌生长，无细菌生长为合格。 4.2.2.4 生长试验及生化反应试验：质控菌栋（表2-1-2.表2-1-3）于35C培养24h，用无菌生理盐水配制0.5麦氏单位的细菌胁悬液。无菌生理盐水1：100稀释，每块平板接种10μ（浓度相当于103~104CFU/平板），培养24~48h。符合生长、
微生物专题试验指导试验一显微镜的使用目的要求1熟悉普通
实验一显微镜的使用 一、目的要求 1、熟悉普通光学显微镜的构造及其使用方法。 2、了解油镜的原理，并掌握其使用方法。 二、实验原理 （一）、普通光学显微镜的构造 普通光学显微镜包括机械部分和光学部分两部分。机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等（图1-1）。 图1-1 显微镜的构造 （二）、油浸系的原理
浸系是在油浸镜与标本之间加1滴香柏油，调整光源检查细菌标本的方法。油浸镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95x、100x等。其镜头标记国产镜多用“油”字表示，国外产品则用“Oil”表示。而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一种标志。 其使用原理是：由于香柏油与玻璃的折光率相似（香柏油为1.515，玻璃为1.52）。镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气（折光率为1.0）而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰。 三、实验器材 1、显微镜，细菌三型玻片标本。 2、香柏油、二甲苯、擦镜纸、载玻片、滴管、纱布。 四、方法步骤 （一）显微镜油镜的使用 1、用低倍镜对光。 2、低倍镜观察（寻找观察目标）。 3、高倍镜观察（选取理想的观察目标）。 4、油镜观察：高倍镜观察后----上升镜筒--油镜转至正下方在载玻片上加一小滴香柏油--小心地下降镜筒使镜头浸在油里----用粗螺旋将镜筒缓慢上升，寻找目标（物象）----用螺旋调节，使物象清晰----观察记录。 5、观察完毕。上升镜筒转动物镜转换器，使油镜物镜偏位。用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹，最后再用擦镜纸擦去残留在镜头上的二甲苯。
(word完整版)医学微生物学实验指导
医学微生物学实验指导 西安交通大学医学院 微生物学教研室 第一次实验课内容 实验内容1. 实验目的与要求 实验内容2. 实验室规则 实验内容3. 细菌形态学观察技术 实验内容4. 染色标本的制备-革蓝染色
实验目的与要求 医学微生物学实验课是该专业课程的重要组成部分，指导学生上好实验课是教学过程中的重要环节,学习实验课的目的是： 1. 使学生加深理解并巩固理论知识，学习和掌握有关的实验操作技术，为以后的医学专业课学习打好基础： 2. 在实验中,培养学生观察、思考和分析问题的能力，主动参与实验的动手能力及独立工作的能力。训练学生严格的科学作风、严肃白的科学态度和严密的工作方法. 3. 培养学生在集体工作环境中互帮互让，团结协作,共同完成好实验的精神品德。 为了达到上述目的，提高实验课的教学效果,特提出以下要求： 1. 实验课前做好预习，明确本次实验课的内容及其原理、方法及注意事项； 2。实验中要仔细认真，注意分工与协作，操作实验要按操作步骤进行。学会正确操作手法、准确记录实验结果。示教实验要注意观察，并记录好相关内容; 3. 详细讨论实验结果，提倡同学之间互帮互学,并紧密联系理论课内容.要注意不论实验结果与理论符合与否，都有讨论的价值，并分析其原因，有可能的话还应重复实验； 4. 严格遵守实验室规则，在微生物学实验课上,要树立“有菌观点”,严格掌握和不断完善无菌操作技术。
实验室规则 一、进入实验室须穿工作服、戴工作帽。除必要的书籍文具外，其它个人物品一律不得带入实验室。 二、在实验室内，禁止饮食、吸烟及与学习无关的其它活动,不得大声喧哗或嘻戏。 三、未经老师许可，不得擅自搬动实验器材及示教物品，不准随意摆弄和旋转实验仪器上的开关及旋扭等。 四、按照实验要求，在老师的指导下，主动安排要进行的实验,认真进行实验操作,严格遵守无菌操作规程，争取顺利地完成实验。 五、实验中使用完毕的器材和试剂，必须放回规定的位置。废弃物必须按规定进行处理或归放于指定的容器内，不能随便乱丢乱放。 六、实验中万一有菌液打翻、有菌材料污染桌面或衣物、割破手指等意外情况,应及时报告老师进行处理，切勿自作主张不按规定处理。 七、爱护实验室内一切设备、挂图、仪器。注意节约使用消耗材料及药品试剂，注意用电安全及节约水电。 八、实验结束，要清理桌面，将实验器材放回原处。值日同学要搞好实验室的清洁卫生，保持室内整齐，离开实验室前要关好门窗、水、电，并将手洗干净。 九、未经许可，不得将实验室内任何物品带出实验室。
水微生物学实验指导书
水微生物学实验指导书 武汉科技大学城市建设学院 给排水工程系 2007.12
目录页 实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察活性污泥生物相的观察 实验二培养基的制备及灭菌 微生物的纯种分离及计数 实验三微生物生理生化特性
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察 一、实验目的 1.了解普通光学显微镜的构造，学习显微镜的使用方法和保养方法。 2.观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。 二. 实验内容 1．显微镜的使用方法和保养方法 2．微生物形态的观察 三、实验仪器、设备及材料 1.光学显微镜、载玻片、盖玻片等 2.示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌。 四、实验原理 显微镜的结构和各部分的作用 图1是微生物实验常用的双目电光源生物显微镜，其构造分机械和光学两部分：机械部分主要包括： 1．镜筒镜筒是双筒，两筒间距离可调，长度一般是160mm。它的上端装有接目镜，下端有回转板。回转板上一般装有3个接物镜。 2．载物台载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。两旁有弹簧夹，用以固定标本或载玻片。有的载物台上装有自动推物器。 3．调节器镜臂旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降载物台，调节接物镜与所需观察的物体之间的距离。 光学部分主要包括： 1．接目镜一股使用的显微镜具有2—3种放大倍数的接目镜，其上常刻有“5×”、“10×”或“16×”等数字及符号。意即使用时可放大5倍、10倍或16倍。观察微生物时常用放大10倍或16倍的接目镜。 2．接物镜接物镜装在回转板上．可分低倍镜、高倍镜和油镜3种，其相应的放大倍数常是10、40 (45)、100。通常显微镜的放大倍数等于接物镜与接目镜放大倍数的乘积。例如：用放大40倍的接物镜(高倍镜)与放大10倍的接目镜时所得的物象的放大倍数为40×10＝400。如果用放大100倍的接物镜则放大倍数为100×10＝1000。接目镜装在镜筒上端，在使用过程中并不经常变动，所以通常所谓的用低倍镜、高倍镜或油镜的观察主要是指使用不同的接物镜而言的。 油镜的放大倍数最大(100)。放大倍数这样大的镜头，焦距就很短．直径就很小。所以自标本玻片透过的光线，因介质密度(从玻片至空气，再进入油镜)不同、有些光线因折射或全反射，就不能进入镜头，致使射入的光线较少，物象显现不清。所
《微生物学及实验》实验指导书
《微生物学及实验》实验指导书 第一部分 实验目的 《微生物学及实验》实验课是我院情况科学专业学生必修的一门重要的底子实验课，是学生进入我院实验室的第一门实验课。 《微生物学及实验》实验的目的是使学生掌握微生物学的根本实验要领和技能，正确的使用实验的仪器设备，在学生头脑中创建无菌观点和掌握无菌操纵技能是最重要的内容，是学生进行后续课实验和研究的底子。在目前的实验室条件和有限学时的情况下，得到微生物实验技能的根本操纵和技能训练，培养学生动手操纵能力和创新能力。通过微生物学实验课讲授，加深理解和牢固课堂所学的知识，熟悉微生物学实验的根本操纵技能，了解微生物实验的底子知识。通过微生物学实验培养学生视察、思考、阐发问题、解决问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度、创新精神、创新思维和创新能力。 本实验指导书主要内容包罗：微生物个别和菌落形态视察、染色要领、培养基制备和灭菌、无菌操纵、微生物检测和疏散、生理生化反响、影响微生物生长的因素和污染物微生物降解实验，水中微生物漫衍视察等内容。同时也注意和情况微生物学的联系与区别。 整个实验课中贯串了显微镜使用—灭菌要领—无菌操纵—微生物菌种疏散筛选判定、选育—微生物代谢作用这一主线。微生物学需掌握的根本操纵在实验中得到训练，同时加深了学生对所学微生物学根本观点的理解。实验设计贴近生活，可以大大提高同学们学习微生物学的兴趣。实验内容与目录如下： 序 号 实验名称 学时 实验类型 实验一 光学显微镜的使用及活性污泥中生物相的视察 3 底子验证实验 实验二 微生物的染色及视察 3 实验三 培养基的制备和灭菌 3 实验四 纯种微生物的疏散、转种和培养 3 实验五 有机污染物质的生物降解实验* 4 综合性实验 实验六 双歧杆菌口服液的发酵制备* 4 *注：实验六为选做实验。
医学微生物学与免疫学实验指导.
医学微生物学与免疫学实验 实验目的和要求 一、实验前务必做好预习，明确实验目的、内容及理论依据等，避免或减少错误的发生，以保证实验在预期内完成。 二、实验操作严格按要求进行，严防污染和感染。 三、对示教实验联系理论认真观察。对光镜下标本不得擅自挪动视野，其他示教标本看后必放回原处。对录像教学应作重点、简要的笔记。 四、客观真实地记录实验结果并进行分析，若与理论不符，要加以分析讨论，找出原因，必要时重复实验。 五、在规定时间内完成实验报告，报告要求字迹清楚，说明问题简单扼要。 实验室规则 1. 非实验必需品禁止带入实验室。 2. 穿白大衣，按规定就坐。 3. 实验室应保持安静和良好的秩序，不得高声谈笑、乱动物品或随便走动。 4. 实验室内严禁吸烟、进食、饮水或用嘴湿润铅笔和标签等，也不要用手搔抓抚摸机体。 5. 实验时若不慎发生皮肤创伤，或病原菌污染衣物、卓（地）面等事故，应立即报告指导老师，进行紧急处理。 6. 实验所用的玻片、试管、吸管等，用后应随即投放盛有消毒剂的指定容器内，不得放在桌上，也不可在水池中冲洗。 7. 每次实验完毕，按实验要求应及时清理实验物品，清扫卫生；离开实验室时，消毒洗手后离开实验室；对白大衣经常清洗消毒。
油镜的使用和维护 目的：掌握油镜的使用与维护，熟悉油镜的使用原理。 材料：显微镜，拭镜纸，液体石蜡油，二甲苯 原理：油镜的透镜极小，工作焦距最短，光线通过玻璃和空气，由于介质密度不同发生折射，射入镜筒的光线极少，视野暗，物象不清晰。如在玻片与镜头（透镜）之间加上折光率和玻片 （n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可减少光线的折射，加强视野的亮度，获得清晰的物象。 步骤：显微镜油镜的使用和维护 1.将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。识别油镜头：标有100×、OIL、HI等字样。 2. 打开电源，用低倍镜对光，打开光圈，调节聚光镜的位置，使视野光线充足。 3. 标本上加镜油一滴，转动粗螺旋，使油镜头缓缓下降，用眼从侧面观察，直到油镜头浸入油中接近玻片为止。 4. 从目镜观察，同时徐徐转动粗螺旋提升，见模糊物象后再用细螺旋调节，直到见到清晰物象为止。 5. 观察完毕，粗螺旋提高镜头，取下标本片，油镜头使用后立即用擦镜纸擦净镜头上的油。如油已干，可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭，并立即用另一擦镜纸擦去二甲苯，因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜头脱落。 6.将镜头转呈“八”字，调低聚光器，对号送入柜子内存放。 革兰染色 目的：掌握革兰染色的原理及操作。 材料：干净玻片，接种环，葡萄球菌和大肠杆菌18-24h培养后的混合菌液，酒精灯，一套革兰染液
环境微生物实验指导书
试验一培养基的配制及灭菌 【目的要求】 1．了解培养基的概念、种类及用途 2．了解培养基的配制原理及其常规配制程序 3．学习和掌握细菌、放线菌、霉菌、酵母菌常用培养基的配制方法。 【基本原理】 培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。不同培养基一般都应含有微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。高氏一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基。马丁氏培养基和豆芽汁葡萄糖培养基分别用于霉菌和酵母菌的分离培养。 【材料与用品】 1．材料与试剂 牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂、黄豆芽、NaCl、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、MgSO4•7H2O、NaOH溶液（1mol/L）。 【仪器与用品】 天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、pH试纸、棉花、纱布、牛皮纸、线绳、报纸等。 一、肉膏蛋白胨培养基的配制 1．培养基成分 牛肉膏0. 3g 蛋白陈1g NaCl 0.5g 琼脂 1.5g 水100ml pH 7.2~7.4 2．配制方法
（1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于唐瓷缸中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述唐瓷缸中。将唐瓷缸加热，用玻璃棒搅拌，使药品全部溶化。 （2）加琼脂：加入所需量的琼脂，加热融化。 （3）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 （4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/l NaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。 待培养基冷却至50℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。 二、高氏一号培养基的配制 1．培养基成分 可溶性淀粉20g KNO3 1g NaCl 0.5g K2HPO4 0.5g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g 琼脂 20g 水 1000ml pH 7.2～7.4 2．配制方法 （1）称量及溶化：量取所需水量的2/3左右加入到搪瓷缸中，加热至沸腾。称量可溶性淀粉，置于另一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，然后到如上述沸水的搪瓷缸中，继续加热，使淀粉完全融化。分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4，依次逐一加入水中溶解。 （2）加琼脂：加入所需量的琼脂，加热融化。 （3）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 （4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/l NaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。